γ射线照射对肺腺癌细胞迁移能力的影响及其分子机制

目的探讨辐射对肺腺癌A549细胞迁移能力的影响及其所依赖的信号通路。方法划痕实验检测2和4 Gyγ射线照射后A549细胞的迁移能力,Western印迹实验检测STAT3及磷酸化STAT3水平,ELISA法检测IL-6的分泌水平,间接免疫荧光染色观察STAT3在细胞内定位情况。结果 2或4 Gyγ射线照射均能显著增强A549细胞的迁移能力,并能激活STAT3的磷酸化,促进STAT3入核以及IL-6的分泌。JAK-2激酶特异性抑制剂AG490能阻断辐射诱导的STAT3磷酸化并进一步抑制辐射诱导的A549细胞迁移。结论本研究结果表明辐射能通过激活JAK-2/STAT3信号通路促进A549细胞的迁移,而IL-6可能参与了辐射诱导的JAK-2/STAT3信号通路的激活。     

重要蚊媒黄病毒对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用

目的:比较并探讨日本脑炎病毒Beijing-1株和登革2型病毒43株对宿主细胞内IFN-α介导的信号转导通路抑制作用的机制.方法:采用含萤火虫荧光素酶(Luciferase,Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,通过检测IFN刺激应答元件(IFN-stimulated response element, ISRE)活性对病毒感染细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的抑制作用进行定量分析.利用间接免疫荧光法观察在IFN-α作用下病毒感染细胞内STAT1分子的分布情况.进一步采用Western印迹分别检测在这两种病毒感染状态下宿主细胞内STAT1、JAK1和TYK2的磷酸化水平.结果:感染日本脑炎病毒和登革病毒的细胞在IFN-α作用下,ISRE活性与对照组相比均显著下降,而且日本脑炎病毒对宿主细胞内ISRE活性的抑制程度明显强于登革病毒;进一步研究发现,日本脑炎病毒可通过抑制JAK1和TYK2两种激酶的活性,降低STAT1的磷酸化水平,阻碍STAT1的核转运;而登革病毒则只抑制TYK2激酶的活化,降低STAT1的磷酸化及核转运水平.结论:日本脑炎病毒和登革病毒可通过不同的作用机制抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路.     

FOXO3a介导PTEN对DNA修复基因RAD51表达的调节作用

目的探讨转录因子FOXO3a在PTEN调节RAD51表达中的作用。方法利用Western印迹技术分析PTEN缺陷与否时,总FOXO3a以及细胞核内FOXO3a磷酸化的情况;转染外源AKT到PTEN野生型细胞或外源PTEN和失去激酶活性的AKT（AKT-DN）到PTEN缺陷型细胞,Western印迹检测核内FOXO3a的磷酸化情况。结果 PTEN缺失导致细胞核内FOXO3a磷酸化水平增高;外源PTEN可以降低PTEN缺陷型细胞核内FOXO3a的磷酸化水平,外源AKT可以增加PTEN野生型细胞核内FOXO3a的磷酸化水平;沉默FOXO3a在一定程度上导致RAD51表达水平下降。结论 FOXO3a可以结合到RAD51基因的启动子区,PI3K/AKT/FOXO3a信号通路是PTEN调节RAD51表达的重要方式之一。     

内毒素直接作用于血管内皮细胞激活信号分子的研究

目的：对内毒素（LPS）直接作用于血管内皮细胞（VECs)激活的多种信号通路的主要激酶及转录因子进行筛选研究。方法：10ng.ml^-1浓度的LPS刺激细胞至预定时相点后,用免疫细胞化学观察信号分子的磷酸化和／或核转位,结果：LPS直接作用于VECs在5－15min内即可观察到多种信号分子的激活,随刺激时间延长,信号分子激活程度逐步增,至一定时相点后活性又消失,这些信号分子的活性在持续时间上存在一定的差异。这些激活的信号分子包括p38、ERK1／2MAPK、CREB、STAT5、STAT6、NF－kB家庭成员p65、p50、p52、c-Rel、Rel-B等。结论：LPS直接作用于VECs可以迅速激活多种信号分子,诱导信号分子的磷酸化和／或核转位。LPS诱导的CREB磷酸化、不同NF－kB家族成员核转位持续时间的差异是第一次报道。     

大鼠脑缺血再灌注后海马组织中GFAP和p－STAT3表达研究

目的：检测脑缺血再灌注（I／R）后海马齿状回区（dentate gyrus, DG）星形胶质细胞活化增殖及其磷酸化信号转导与转录激活子3（phosphorylated STAT3,p－STAT3）表达情况,为调控星形胶质细胞异常活化增殖提供理论依据。方法线栓法制作大鼠脑局部I／R模型,48只Sprague－Dawley（SD）大鼠随机分为假手术（Sham）组、I／R－24 h组、I／R－72 h组及I／R－7 d组。免疫荧光法及Western 印迹检测缺血后不同时间点患侧海马区胶质原纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein , GFAP）标记阳性细胞及p－STAT3表达情况。结果与Sham组比较,I／R－72 h和I／R－7 d组海马区GFAP蛋白表达增加（P＜0．05）;随缺血时间延长,GFAP蛋白表达增加呈上升趋势,且24 h、72 h和7 d各时间点之间两两比较差异均具有统计学意义（P＜0．05）。与Sham组比较,脑I／R后海马区各时间点p－STAT3表达量均显著增加（P＜0．05）;p－STAT3表达在24 h最高,72 h开始下降,7 d仍有一定量表达,与I／R－24 h组比较, I／R－72 h组和I／R－7 d组p－STAT3表达量均显著降低（ P＜0．05）。结论脑I／R损伤后,海马区星形胶质细胞大量增殖及其p－STAT3表达增加;且p－STAT3的表达高峰在时间上早于星形胶质细胞的大量增殖。     

脱氧佛波醇乙酸酯通过激活PKC/ERK通路诱导急性髓系白血病细胞分化

目的研究脱氧佛波醇乙酸酯（12-deoxyphorbol 13-acetate,Prostratin,DPA）对人急性髓系白血病（AML）细胞株HL-60、NB4和U937细胞分化的影响,并证明其通过激活蛋白激酶C/胞外信号调节激酶（PKC/ERK）通路诱导细胞分化。方法 1μmol/L DPA作用HL-60细胞3 d后观察细胞形态的改变;不同剂量的DPA作用HL-60、NB4、U937细胞24 h后,流式细胞仪检测细胞分化表面标志变化;Western印迹检测ERK蛋白磷酸化的改变;流式细胞仪检测丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制剂和PKC抑制剂对细胞分化表面标志的影响;Western印迹检测MEK抑制剂和PKC抑制剂对ERK蛋白磷酸化的影响。结果 DPA可诱导HL-60细胞出现白血病细胞分化的形态。DPA剂量依赖性地诱导AML细胞CD11b表达。DPA在诱导分化剂量范围内可剂量依赖性地引起ERK磷酸化。MEK化学小分子抑制剂U0126可完全抑制DPA引起的ERK磷酸化和CD11b表达;PKC非选择性抑制剂GFX可完全抑制DPA引起的ERK磷酸化和CD11b表达。结论 DPA其通过激活PKC/ERK通路能够明显诱导白血病细胞分化。     

ARRDC4通过NF-κB和MAPK信号通路促进EV71诱导的IL-6产生

目的 研究含阻遏蛋白结构域蛋白4(arrestin domain-containing protein 4,ARRDC4)对肠道病毒71(EV71)诱导IL-6产生的调节作用和相关机制.方法 利用特异性靶向ARRDC4的小干扰RNA(siRNA)在THP-1诱导分化的巨噬细胞(t-M?)中干扰ARRDC4的表达,无关siRNA序列干扰作为阴性对照组,采用实时定量PCR、ELISA和Western印迹等技术观察ARRDC4对IL-6产生、EV71复制以及相关天然免疫信号通路接头分子活化的影响.结果 EV71感染时,ARRDC4表达显著上调.以siRNA靶向干扰ARRDC4的表达,能抑制EV71感染诱导的IL-6 mRNA的表达和IL-6的分泌产生,促进EV71的复制.靶向干扰ARRDC4能明显抑制EV71诱导的p-65、IκBα、ERK、JNK和p38的活化.结论 ARRDC4通过增强NF-κB和MAPK信号通路的活化,促进EV71诱导的IL-6产生,从而抑制EV71的复制,正向调控EV71触发的天然免疫反应.     

电离辐射对肠上皮细胞NF-κB p65和Akt表达的影响

目的 观察电离辐射对肠上皮细胞PI3K/Akt通路和NF-κB通路的激活模式。方法 将对数生长期的IEC-6细胞用无血清培养基培养24h后进行60Co γ射线12Gy照射,检测IEC-6细胞辐照前后不同时间Akt磷酸化水平和胞浆、胞核NF-κB P65蛋白水平变化。结果 辐射可使肠上皮细胞受照20 min后迅速诱导p65的核转位,但检测不到明显的Akt磷酸化;肠上皮细胞Akt磷酸化的高峰于受照后1 h才出现。结论 电离辐射诱导的NF-κB p65快速核转位早于辐射诱导Akt的磷酸化。     

促红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注后STATl和STAT3表达的影响

目的探讨促红细胞生成素（EPO）对大鼠局灶性脑缺血再灌注后信号转导与转录激活因子（STAT）1、磷酸化STATl（P．STATl）、STAT3、P—STAT3蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法将雄性sD大鼠80只完全随机分为假手术（A）组、单纯脑缺血再灌注（B）组、脑缺血再灌注＋生理盐水（c）组和脑缺血再灌注＋EPO（D）组,每组20只,采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注损伤模型。各组大鼠均于缺血2h后再灌注24h时,行MRI检查并计算缺血区异常信号相对面积值,Westernblot检测STATl、P—STATl、STAT3、P—STAT3蛋白表达水平的变化并计算相对灰度（rOD）值,原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡情况并计算细胞凋亡指数。应用单因素方差分析和q检验分析数据。结果MRIT,WI示B、C组在左侧大脑半球皮质及皮质下均可见大片脑缺血异常高信号影,D组仅皮质下脑实质内或仅皮质处可见斑片状脑缺血高信号影;与B、C组比较,D组异常高信号区相对面积明显减小[（28．00±4．60）％、（29．70±4．80）％和（21．10±2．40）％;F=11．285,P〈0．01]。STATl、STAT3蛋白在正常脑组织中表达,缺血再灌注及EPO干预对二者表达水平均无明显影响（F=0．806和1．558,均P〉0．05）。P—STATl在A组表达较低,rOD值为0．75±0．13,缺血再灌注后表达显著增加;与B、C组相比,D组P—STATl表达水平有所减少（B～D：2．08±0．15、2．05±0．16、1．92＋0．05;F=3．274,P〉0．05）。P—STAT3在A组表达也较低,rOD值为1．02±0．09,缺血再灌注后表达显著增加;与B、c组相比,D组P—STAT3表达明显增加（B—D：2．22±0．13、2．04±0．14、4．21±0．21;F=40．719,P〈0．01）。B、C组细胞凋亡指数分别为（42．00±1．30）％和（41．20±2．50）％,高于D组[（20．90±1．46）％;F=378．704,JP〈0．01]。结论EPO可增加脑缺血区域P—STAT3表达水平、降低P—STATl表达水平,从而减少脑细胞凋亡的数目、减小脑梗死面积。     

日本脑炎病毒非结构蛋白NS5对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用

目的探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础。方法分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体。采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况。利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度。构建融合表达红色荧光蛋白的STAT1重组真核表达载体pRed-STAT1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的细胞内定位情况。同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT1分子的磷酸化水平进行检测。结果日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中。在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT1分子的核转运及抑制STAT1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化。结论日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5对Ⅰ型IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白。     

腺病毒-甲病毒杂合载体的构建

目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下：利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子（CD11a promoter,CD11Ap）、甲病毒载体元件（nsP）、目的基因（GFP）、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数（100MOI）分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP＋细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP＋细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。     

手足口病病原体EV71的检测方法学比较

 目的 比较4种不同的方法对手足口病(hand-foot and mouth disease,HFMD)病原体肠病毒71型(enterovirus type 71,EV71)感染的检测效果。方法 非洲绿猴肾细胞(Vero)培养至对数生长期后,加入EV71病毒株感染。分别采用细胞病变效应法(cytopathic effect,CPE)、实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction,Real-Time PCR)、Western blot和免疫荧光法检测病毒感染情况,并对4种检测结果进行比较。结果 4种方法均可检测到EV71的感染,其中CPE最经济实惠,但是检测周期长,需要至少96 h,并且对病毒活力要求高;Western blot和免疫荧光检测相近,72 h即可完成实验,但灵敏度低,对病毒量有一定要求;Real-Time PCR检测既快速灵敏性又高,48 h即可完成实验。结论 不同的方法各有其优缺点,需要根据不同的需要进行选择,达到快速准确诊断病原体的目的。     

重组HIF—1α及NIS慢病毒表达载体的构建及功能鉴定

目的构建肌凝蛋白轻链-2（MLC-2v）启动下HIF-1α及人NIS慢病毒真核表达载体,探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性。方法应用基因重组技术构建慢病毒（Lv）-延长因子（EF）1-HIF-1α-内部核糖体进入位点（IRES）-NIS及Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS慢病毒表达载体。对重组质粒进行酶切、测序鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转入Hela细胞。细胞免疫荧光及Westernb1a分别验证HIF-1α及NIS蛋白在细胞中的定位及定量表达;制备重组病毒,分别以不同的感染复数（MOI）感染H9C2大鼠心肌细胞、NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞和L6大鼠骨骼肌成肌细胞,Westernb1a确定最佳MOI并验证MLC·2v启动子的特异性;分别行H9C2细胞动态摄碘和NaClO4抑制实验。采用两样本t检验分析数据。结果成功构建Lv-EFl-HIF-1a-IRES-NIS及Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS慢病毒表达载体。2种质粒分别转染Hela细胞,免疫荧光显示HIF-1α蛋白表达于胞质,NIS蛋白表达于胞膜;Westernb1a显示EFl启动下2种蛋白质的表达量多于MLC-2v启动下相应表达。Westernb1a蛋白检测后测定蛋白灰度值,阳性对照组NIS及HIF-1α灰度值分别为69-8和71-9,EF1启动下分别为109-4和92-7,MLC-2v启动下分别为141-9和132-4。Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS病毒感染H9C2细胞,MOI为20时NIS蛋白表达最高,为最佳MOI。2种病毒以MOI为20分别感染H9C2、NIH-3T3及L6细胞,Westernb1a显示EF1启动下NIS蛋白在3种细胞中均有表达,灰度值分别为23.4、29.8和28.6,相差较小。MLC-2v启动下仅H9C2细胞中有大量NIS蛋白表达,NIS蛋白在H9C2、L6及NIH-3T3细胞的灰度值分别为157.9、178.8和2173。H9C2细胞的摄碘高峰时间为40min,峰值为4287.2计数·min-1,是阴性对照组（254.g计数·min-1）的16.85倍（t=5.34,P〈0.01）。摄碘可被NaC国O4抑制,抑制率达85.5％（t=21.3,P〈0.01）。结论MLC-2v可启动治疗基因HIF-1α及报告基因NIS在心肌细胞中特异性表达,表达的NIS蛋白具有摄碘功能,为NIS作为报告基因监测外源基因的靶向治疗奠定了基础。     

凝血酶体外促进肺癌细胞Glc-82周期进程和增殖及其分子机制

目的探讨凝血酶体外促进肺癌细胞Glc-82周期进程和增殖及其作用机制。方法采用CCK8法检测凝血酶（thrombin）对Glc-82细胞增殖活性的影响,确定其量效和时效关系;利用碘化丙锭（propidium iodide,PI）单染和AnnexinⅤ-FITC/PI双染在流式细胞仪上检测细胞周期和凋亡;以荧光实时定量PCR检测10号染色体上与张力蛋白同源缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromatosome 10,PTEN）mRNA水平的变化,免疫印迹法检测PTEN蛋白表达和AKT磷酸化水平的变化。结果凝血酶（0.5和1.0 U/ml）可以有效促进细胞的增殖（P〈0.01）。凝血酶（0.5 U/ml）促进Glc-82细胞由G1期向S期转化,可以抑制PTEN的表达,提高AKT磷酸化水平,但对细胞凋亡没有影响。结论凝血酶（0.5 U/ml）可以促进肺癌细胞Glc-82周期进程和细胞增殖,可能系通过PTEN/PI3K/AKT信号分子途径发挥作用。     

大流行甲型H1N1流感病毒变异株的小鼠感染实验研究

目的对甲型H1N1流感病毒变异株的小鼠感染特征进行观察。方法经过体外鸡胚/MDCK细胞传代和筛选,获得1株甲型H1N1流感病毒变异株（vCA07）;使用不同剂量流感病毒滴鼻感染BALB/c小鼠后,计算半数致死量和半数感染量,观察小鼠感染后的体质量变化、肺部病毒增殖、肺部组织病理变化等。结果与野生型毒株相比,甲型H1N1流感病毒变异株对BALB/c小鼠的致病性显著提高,其可在小鼠肺组织中高效增殖,并导致显著的病理损伤。结论甲型H1N1流感病毒变异株感染特征得以明确,为进一步建立高致病性甲型H1N1流感病毒的小鼠感染模型以及大流行甲型H1N1流感病毒致病机制的研究奠定了基础。     

京尼平苷调节胰腺β细胞增殖的细胞信号机制研究

目的考察京尼平苷（Gen）对胰腺β细胞增殖的影响及其细胞信号转导机制。方法将INS-1细胞（一种胰腺β细胞）用Gen处理一定时间之后,用MTT方法测定活细胞的数量,用BrdU标记的方法分析细胞增殖的情况,Western印迹分析Gen对于细胞增殖相关的Akt和FoxO1磷酸化的影响。结果Gen处理INS-1细胞可将活细胞数量提高45%（P〈0.01）,并且BrdU标记的阳性细胞数量明显增加（P〈0.01）。另外,Gen还能显著上调INS-1细胞中Akt308丝氨酸位点和叉头转录因子FoxO1的磷酸化（P〈0.01）,而且这种作用可被PI3K的抑制剂LY294002阻断。结论Gen能够促进胰腺β细胞增殖,而且这种作用可能与其激活PI3K激酶途径、增强FoxO1的磷酸化有关。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化乙型脑炎病毒非结构蛋白NS5,并制备其多克隆抗体。方法通过PCR法扩增编码NS5蛋白的全长基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并通过Ni柱亲和层析纯化重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测抗体效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果与结论成功获得了可溶性表达的NS5蛋白,制备了多克隆抗体,效价为1∶1000,能够特异性识别乙型脑炎病毒感染细胞中表达的NS5蛋白,为进一步研究NS5蛋白的生物学功能奠定了基础。     

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关蛋白β-内酰胺酶报告系统的建立

目的构建鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）Ⅲ型分泌系统（T3SS）相关蛋白β-内酰胺酶（TEM-1β-lactamases,Bla）报告基因载体,旨在运用本系统检测鼠疫菌待测蛋白能否转运至宿主细胞内。方法将TEM基因克隆入pA-CYC184载体中,构建用于鼠疫菌研究的TEM报告基因载体。把待分析的鼠疫菌基因及启动子区克隆入TEM基因上游,使鼠疫菌蛋白与TEM蛋白融合表达。将鼠疫菌基因-TEM融合表达载体电转化到鼠疫菌中,并感染HeLa细胞2 h后,加入CCF2-AM底物,在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果与结论应用本系统检测了YopK-Bla、YscK-Bla、YscL-Bla和YscX-Bla进入宿主细胞的情况,YopK-Bla和YscX-Bla菌株感染的HeLa细胞呈蓝色,YscK-Bla和YscL-Bla菌株感染的HeLa细胞呈绿色,表明YopK及YscX可以进入宿主细胞,而YscK和YscL则不能。本研究成功地构建了适于鼠疫菌的TEM报告基因系统,该系统可作为分析其他鼠疫菌蛋白能否在感染的过程中进入宿主细胞的工具,为鼠疫菌T3SS相关蛋白致病机制研究奠定了基础。