远志皂苷碱水解产物的化学成分研究

目的 对远志皂苷碱水解产物进行化学成分研究.方法 采用pH=14的NaOH溶液加热回流4 h,制备远志皂苷碱水解产物;采用硅胶反复柱层析、薄层色谱检识和重结晶的方法,从远志皂苷碱水解产物中分离纯化主要成分,并利用理化性质和渡谱特征鉴定其结构.结果 从远志皂苷碱水解产物中分离出细叶远志皂苷、黄花倒水莲皂苷A、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸和肉桂酸等主要化学成分.结论 远志皂苷碱水解产物稳定,细叶远志皂苷和黄花倒水莲皂苷A为其主要的皂苷类成分,黄花倒水莲皂苷A和对甲氧基肉桂酸为首次从远志皂苷碱水解产物中分离得到.     

远志皂苷碱水解产物对乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究

目的对远志皂苷碱水解产物及其主要化学成分的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行研究。方法运用薄层色谱(TLC)-生物自显影和微孔高通量筛选技术,测定远志皂苷碱水解产物、细叶远志皂苷、黄花倒水连皂苷A、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸和肉桂酸对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。结果远志皂苷碱水解产物表现出明显的乙酰胆碱酯酶抑制作用;细叶远志皂苷和黄花倒水连皂苷A表现出一定的乙酰胆碱酯酶抑制作用,但是活性有限;3,4,5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸和肉桂酸没有表现出对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。结论通过乙酰胆碱酯酶抑制实验,明确了远志皂苷碱水解产物的体外活性,为开发抗早老年性痴呆的药物提供了科学依据。     

远志皂苷类成分及其在动物体内代谢过程的研究进展

目的:综述远志皂苷类及其水解产物的结构类型以及体内过程研究进展,为深入研究该类成分的体内物质基础及作用机制提供参考。方法:查阅文献,归纳分析总结。结果:远志皂苷结构复杂,目前文献报道的共有百余种,大多数远志皂苷的基本母核为细叶远志皂苷元,其衍生物共有49种;大多数远志皂苷性质不稳定,经碱水解后,成分稳定,生物活性显著,其水解产物结构确切者有5个。远志皂苷可在胃肠道菌群中发生去糖基化等复杂的生物转化,其代谢产物主要通过被动扩散方式进行吸收;吸收入血成分中不仅有代谢产物,还有多种皂苷原型。结论:远志皂苷及其碱水解产物在体内经过生物转化后产生的次生代谢产物中有多种活性成分,具有重要药用价值。     

细胞膜固相色谱法筛选夏枯草抗人乳腺癌细胞效应成分

目的 应用细胞膜固相色谱法(CMC)筛选夏枯草中抗人乳腺癌细胞MDA-MB-231的效应成分.方法 采用人乳腺癌细胞MDA-MB-231与夏枯草提取液共培养,让人乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞膜上靶点与夏枯草提取液成分结合,洗去未结合的其他成分,再用磷酸盐缓冲液(pH=4.0)使细胞膜靶点失活,让结合于细胞膜上的夏枯草提取液成分解离,解离液经萃取后用液质联用仪进行测定与解析,并用CCK8法检测结合于细胞膜上的成分抗人乳腺癌细胞活性.结果 通过细胞膜固相色谱法检测出结合于MDA-MB-231细胞膜上的成分有芦丁、迷迭香酸,CCK8法检测结果显示,芦丁、迷迭香酸均在实验浓度对MDA-MB-231细胞有明显抑制作用(P＜0.05,P＜0.01).结论 夏枯草中抗人乳腺癌细胞活性的效应成分为芦丁、迷迭香酸,芦丁、迷迭香酸可以作为夏枯草的质量控制成分.     

TAT-tCNTF融合蛋白对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的确定TAT-tCNTF融合蛋白能够透过细胞膜进入细胞内,并研究其对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法重组PCR获得人截短型CNTF基因后,与pBV220-TAT载体连接,在大肠杆菌中表达,细胞免疫荧光方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SH-SY5Y细胞膜的作用,Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞产生神经毒性,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测融合蛋白对细胞存活率的影响,Heochst33342/PI荧光双染法进行细胞凋亡和坏死的形态学观察,并进行LDH释放分析进一步检测TAT-tCNTF对细胞损伤后的保护作用。结果成功构建pBV220-TAT-tCNTF表达载体,Western blot结果表明重组融合蛋白可以与CNTF抗体特异性结合,细胞免疫荧光方法显示TAT-tCNTF能大量进入细胞,而rhCNTF只有微量进入细胞。对Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞MTT、Heochst33342/PI荧光双染法及LDH分析都表明TAT-tCNTF能明显提高细胞的存活率。结论TAT-tCNTF融合蛋白可以跨越细胞膜,能够保护Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞,具有促进细胞生存生长的活性。     

红芪化学成分及其抗氧化活性研究

目的对红芪化学成分及其抗氧化活性进行研究。方法采用色谱技术对红芪化学成分进行分离,利用理化性质和现代波谱技术确定化合物的结构,并应用过氧化氢损伤的SH-SY5Y细胞与野生型DJ-1基因转染的SH-SY5Y细胞模型对得到的代表性化合物进行抗氧化应激活性研究。结果从红芪中分离鉴定了6个化合物,其结构分别为大豆皂苷II甲酯（1）,大豆皂苷I（2）,芒柄花苷（3）,柚皮苷（4）,下箴桐碱（5）和色氨酸（6）。抗氧化活性实验结果表明化合物3具有较好的抗氧化作用。结论化合物4和6为首次从该属植物中分离得到,化合物3具有抗氧化应激作用。     

阿来替尼抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞糖酵解

目的观察阿来替尼对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞糖酵解的作用。方法培养SH-SY5Y细胞分为对照组及1.25、2.5、5、10和20μmol·L^-1阿来替尼组,MTT法检测细胞增殖活性变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,检测ALK表达正常和敲低的SH-SY5Y细胞乳酸产量变化;检测5μmol·L^-1阿来替尼对SH-SY5Y细胞糖酵解活性改变;Western blot法检测乳酸脱氢酶A(LDH-A)的表达。结果与对照组比较,1.25、2.5、5、10、20μmol·L^-1阿来替尼组SH-SY5Y细胞增殖率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P <0.05);细胞内乳酸含量显著降低(P <0.05),且不依赖于ALK表达。5μmol·L^-1阿来替尼组SH-SY5Y细胞基础糖酵解活性值及最大糖酵解活性值相较于对照组显著下调(P <0.05)。与对照组相比,1.25、2.5、5和10μmol·L^-1阿来替尼组SH-SY5Y细胞LDH-A表达均显著下调(P <0.05)。结论阿来替尼抑制SH-SY5Y细胞增殖、诱导其凋亡,其机制可能与降低SH-SY5Y细胞糖酵解活性,抑制LDH-A表达有关。     

基于CREB通路研究3,6’-二芥子酰基蔗糖的神经保护分子机制

目的 3,6’-二芥子酰基蔗糖(DISS)是远志中的寡糖酯类成分,通过研究DISS对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖作用和对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)通路的影响,探究其发挥神经保护作用的分子机制。方法采用四甲基噻唑蓝(MTT)法测定SH-SY5Y细胞生长曲线,筛选最佳种板密度和给药时间,并检测不同浓度DISS对细胞增殖的影响;采用Western blotting法检测细胞给予DISS后不同时间点CREB、磷酸化CREB(p-CREB)和脑源性神经生长因子(BDNF)的表达水平;给予调节CREB活性的相关上游通路拮抗剂U0126(MEK拮抗剂)、H89(PKA拮抗剂)、KN93(CaMK拮抗剂)拮抗CREB上游通路,并给予DISS保护,用Western blotting法检测DISS对拮抗前后细胞内CREB,p-CREB,BDNF蛋白表达的影响。结果 SH-SY5Y最佳中板密度为2×108L-1,DISS(60μmol·L-1,30μmol·L-1)对SH-SY5Y细胞具有明显的促增殖作用(P<0.05);与正常细胞相比,DISS给药15 min时可显著增加细胞内p-CREB,BDNF的表达(P<0.05);DISS可明显增加拮抗后SH-SY5Y细胞内CREB,p-CREB,BDNF的表达水平(P<0.05)。结论 DISS可以调节CREB活性并促进下游BDNF等相关因子的表达,其神经保护作用的机制可能与活化Ca2+/CaM/CaMK-CREB-BDNF信号通路有关。     

以Caco-2细胞模型研究远志皂苷水解物的肠吸收特性

目的 通过研究远志皂苷水解物主要活性成分3,4,5-三甲氧基肉桂酸(TMCA)、对甲氧基肉桂酸(PMCA)和细叶远志皂苷(TF)的肠转运特性,预测其口服生物利用度.方法 利用Caco-2细胞模型,以及所建立的LC-MS/MS分析方法,研究上述3个成分在不同浓度下从顶侧(AP)到基底侧(BL)以及从BL到AP2个方向的转运特性.结果 TMCA和PMCA 2个酚酸化合物具有较好的膜通透性,在不同浓度下从AP到BL的表观渗透系数(Papp)均＞10×10-6cm·s-1,而三萜皂苷TF的通透性较差,Papp值均＜1×10-6cm· s-1.3个化合物的转运量均随浓度的增加而增加,但Papp值保持基本一致,且各自2个方向的Papp值无明显差异.结论 TMCA和PMCA具有良好的肠通透性,属吸收较好的化合物,而TF则通透性较差,口服吸收可能很有限;3个化合物均以被动扩散形式转运,且无外排转运机制.     

红花甙对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡保护作用的实验研究

目的研究红花甙(carthamin)对过氧化氢(H2O2)诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(SH-SY5Y cells)凋亡的影响,并探讨其机制。方法实验分为空白对照组、H2O2损伤组及红花甙高、中、低剂量组。用H2O2作用于SH-SY5Y细胞,使其发生凋亡。MTT法检测SH-SY5Y细胞活性,比色法测丙二醛(MDA)的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与损伤组比较,随着红花甙剂量的增加,SH-SY5Y细胞存活率提高(P<0.01),MDA生成量减少(P<0.01),凋亡率下降(P<0.05)。结论红花甙对H2O2诱导SH-SY5Y细胞凋亡有保护作用,与红花甙能抗氧化、降低细胞凋亡有关。     

人参水提物对MPP^＋诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的研究人参水提物（WEG）对四氢吡啶离子（MPP^＋）诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法体外培养SH-SY5Y细胞,建立MPP＋致SH-SY5Y细胞凋亡的模型,同时给予WEG干预。应用MTT比色法检测细胞活力;Hoechst33258染色观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果0.5mmol·L^-1MPP^＋作用于SH-SY5Y细胞60h,MTT值降低到（51.97%±2.46%）（P〈0.01）,Hoechst 33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光,凋亡率增加到（40.52%±1.68%）（P〈0.01）,而WEG则能明显改善SH-SY5Y细胞的凋亡特性,显著升高其MTT值,降低凋亡率（P〈0.05）。结论人参水提物对MPP＋诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有显著的保护作用。     

牛蒡苷元对H89诱导的SH—SY5Y细胞损伤的保护作用

目的：考察牛蒡苷元对H89诱导的人神经母细胞瘤SH—SY5Y细胞损伤的保护作用。方法：用蛋白激酶A抑制剂H89处理SH—SY5Y细胞．建立细胞损伤模型。将SH—SY5Y细胞分成正常组（正常细胞）、模型组（经H89处理的细胞）、H89＋牛蒡苷元组（经H89处理后给予牛蒡苷元处理的细胞）和H89＋丹酚酸B组（阳性对照组,经H89处理后给予丹酚酸B处理的细胞）。采用MTT法检测细胞活力、免疫荧光细胞化学法检测细胞中β-淀粉样肽和神经营养因子-3的表达以及Hoechst33258染色法检测细胞凋亡率。结果：H89诱导的细胞损伤模型造模成功。牛蒡苷元在低浓度（0．5μmol·L-1）用最佳,与模型组相比,H89＋低浓度显著提高（P〈0．01）,细胞中β-淀粉样肽的表达下调5．17％（P〈0．05）,而神经营养因子-3的表达上调80．54％（P〈0．01）．凋亡细胞百分比也显著降低（P〈0．05）。结论：低浓度牛蒡苷元对H89诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有显著保护作用。     

TAT-tCNTF提高Aβ损伤细胞模型的GSH水平和SOD酶活性研究

目的:探讨TAT-tCNTF、TAT48-58、rhCNTF对Aβ损伤/非损伤SH-SY5Y细胞模型的GSH水平和SOD酶活性的影响,以分别评价其抗氧化应激效应。方法:采用析因设计研究经TAT-tCNTF、TAT48-58和rhCNTF处理后,Aβ损伤/不损伤的SH-SY5Y细胞模型的GSH水平和SOD酶活性;采用单因素多水平设计五个浓度水平的TAT48-58对SH-SY5Y细胞的GSH水平和SOD酶活性。结果:不同蛋白类型对GSH水平和SOD活性影响的结果分别为F=11.13,P<0.000 1和F=10.18,P<0.000 1。TAT-tCNTF与SH-SY5Y共孵育后损伤和非损伤模型的SOD活性和GSH水平分别为(0.57±0.01)%,(0.61±0.02)%和(5283±578)U.L-1,(6394±173)U.L-1。加入不同TAT48-58浓度对SH-SY5Y细胞的SOD活性和GSH含量影响方差分析FSOD=1.86,P=0.156 6,FGSH=1.55,P=0.261 7。结论:TAT-tCNTF能提高Aβ损伤的SH-SY5Y细胞模型的GSH水平和SOD活性的效应,TAT48-58不能引起细胞内氧化应激作用。     

复方脑康胶囊对β-淀粉样肽诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用研究

目的:研究复方脑康胶囊对β-淀粉样肽(Aβ)25-35(Aβ25-35)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用。方法:将SH-SY5Y细胞接种后分为对照、Aβ25-35(25μmol.L-1)和复方脑康胶囊(0.725g.mL-1)+Aβ25-35(25μmol.L-1)组。通过测定细胞存活率(MTT法)、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞轴突长度、胞体面积,观察复方脑康胶囊对Aβ导致神经毒性的保护作用。结果:与对照组比较,Aβ25-35组SY5Y细胞的轴突长度和胞体面积均较小,MTT代谢率降低,LDH漏出率升高,而加入复方脑康胶囊水提液后,可使上述指标恢复或接近正常。结论:复方脑康胶囊具有神经保护作用,可减轻Aβ导致的神经毒性。     

13-甲基十四烷酸对H2O2诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用

目的：探讨13-甲基十四烷酸（13-MTD）对过氧化氢（H2O2）诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的影响。方法：采用体外细胞培养的方法,建立SH-SY5Y神经细胞H2O2损伤模型。光镜观察细胞形态,SRB法检测细胞存活率,AO/EB双重染色法检测细胞凋亡,MTT法检测线粒体活性。结果：与正常对照组相比,H2O2损伤模型组细胞出现明显病理改变,细胞存活率、线粒体活性均显著下降（P〈0.01）,细胞凋亡率显著升高（P〈0.01）;13-MTD10、20、40μg/mL可显著提高细胞存活率（P〈0.01）;13-MTD5、10、20μg/mL可显著下调细胞凋亡率（P〈0.01）;13-MTD5、10、20、40μg/mL可显著提高细胞MTT代谢率（P〈0.01）;且存在一定量效差异（P〈0.05,P〈0.01）。结论：不同剂量的13-MTD对H2O2诱导的SH-SY5Y神经细胞氧化损伤具有保护作用。     

香椿果抗补体活性多酚对补体损伤神经细胞的保护作用研究

目的评价香椿果抗补体活性多酚XCG-7对补体损伤神经细胞的保护作用。方法采用眼镜蛇毒因子特异激活血清补体,诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y损伤。通过测定乳酸脱氢酶释放量、细胞活力和Caspase-3/7活性等指标,评价XCG-7对补体损伤神经细胞的保护作用。结果 XCG-7对SH-SY5Y细胞的生长具有促进作用,明显抑制补体损伤导致的细胞活力下降,在一定程度上减轻乳酸脱氢酶的释放,抑制细胞凋亡的发生。结论香椿果抗补体活性多酚XCG-7能促进SH-SY5Y细胞的生长,对补体损伤神经细胞具有一定的保护作用。     

Development of an in vitro blood-brain barrier model-cytotoxicity of mercury and aluminum

In this study, in vitro blood-brain barrier (BBB) models composed of two different cell types were compared. The aim of our study was to find an alternative human cell line that could be used in BBB models. Inorganic and organic mercury and aluminum were studied as model chemicals in the testing of the system. BBB models were composed of endothelial RBE4 cell line or retinal pigment epithelial (RPE) cell line ARPE-19 and neuronal SH-SY5Y cells as target cells. Glial U-373 MG cells were included in part of the tests to induce the formation of a tighter barrier. Millicell CM filter inserts were coated with rat-tail collagen, and RBE4 or ARPE-19 cells were placed on the filters at the density of 3.5-4 × 10⁵ cells/filter. During culture, the state of confluency was microscopically observed and confirmed by the measurement of electrical resistance caused by the developing cell layer. The target cells, SH-SY5Y neuroblastoma cells, were plated on the bottom of cell culture wells at the density of 100 000 cells/cm². In part of the studies, glial U-373 MG cells were placed on the under side of the membrane filter. When confluent filters with ARPE-19 or RBE4 cells were placed on top of the SH-SY5Y cells, different concentrations of mercuric chloride, methyl mercury chloride, and aluminum chloride were added into the filter cups along with a fluorescent tracer. Exposure time was 24 h, after which the cytotoxicity in the SH-SY5Y cell layer, as well as in the ARPE-19 or RBE4 cell layer, was evaluated by the luminescent measurement of total ATP. The leakage of the fluorescent tracer was also monitored. The results showed that both barrier cell types were induced by glial cells. Inorganic and organic mercury caused a leakage of the dye and cytotoxicity in SH-SY5Y cells. Especially, methyl mercury chloride could exert an effect on target cells before any profound cytotoxicity in barrier cells could be seen. Aluminum did not cause any leakage in the barrier cell layer, and even the highest concentration (1 mM) of aluminum did not cause any cytotoxicity in the SH-SY5Y cells. In conclusion, BBB models composed of RBE4 and ARPE-19 cells were able to distinguish between different toxicities, and ARPE-19 cells are thus promising candidates for studies of drug penetration through the blood-brain barrier.     

A novel cell-permeable RDP-p53 fusion protein for specific inhibition on the growth of cancerous neural cells

Objective: There is 25–35% mutation rate of p53 in cancerous neural cells and this rate reaches 70–76% in glioma cell line. Complement of wild-type p53 has become a potential strategy for protein therapy of cancerous neural cells. Here we investigated the feasibility of a novel RDP-p53 fusion protein for anti-proliferation of cancerous neural cell and the possible mechanism, which would provide an effective approach for targeted delivery of p53 protein to treat cancerous neural cells.

Methods: The RDP-p53 fusion proteins are expressed in Escherichia coli, and they are labeled with FITC and rhodamine B by chemical modification. The fluorescence-labeled proteins are added to human hepatocellular carcinoma cells (HepG-2) and human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in order to investigate the possibility of RDP enhancing the cell uptake efficiency into neural cells as a cell-permeable carrier. The inhibitory effect of RDP-p53 on SH-SY5Y and human glioma cells (U251) was evaluated by MTT assay. Moreover, the anti-proliferation mechanism of RDP-p53 was determined by Apoptosis and Necrosis Assay Kit and flow cytometric analysis.

Results: The results showed that RDP-p53 could enter SH-SY5Y cells with high efficiency and selectively inhibit the growth of cancerous neural cells, including SH-SY5Y and U251. Also, cell apoptosis pathway and cell-cycle arrest at the G2/M phase were associated with the inhibition mechanism of RDP-p53 according to the data of flow cytometric analysis.

Conclusions: RDP-p53 could be a novel antitumor candidate for targeting treatment of cancerous neural cells.