丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化乙型脑炎病毒非结构蛋白NS5,并制备其多克隆抗体。方法通过PCR法扩增编码NS5蛋白的全长基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并通过Ni柱亲和层析纯化重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测抗体效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果与结论成功获得了可溶性表达的NS5蛋白,制备了多克隆抗体,效价为1∶1000,能够特异性识别乙型脑炎病毒感染细胞中表达的NS5蛋白,为进一步研究NS5蛋白的生物学功能奠定了基础。     

人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10在大肠埃希菌中的诱导表达与鉴定

目的 构建稳定表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C/UbcH10)蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导其表达,纯化并鉴定该重组蛋白. 方法 通过PCR扩增获得UbcH10基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体,经EcpRI/Xho 1双酶切及测序验证止确后,转化至大肠埃希菌BL21,经IPTG(终浓度Immnol/L)诱导表达4h.采用SD6-PAGE、Westernblotting等方法鉴定表达产物,用Ni-Sepharose亲和层析和Sephadex G-50分子筛纯化UbcH10蛋自. 结果 成功构建UbcH10基因的原核表达载体,经IPTG诱导后在大肠埃希菌B121中获得大量重组蛋白.该重组蛋白以町溶形式表达,表观分子量约为29kD,表达量约占黹体蛋白总量的40%.Westem blotting检测在29kD附近出现预期条带,与目的 蛋白的理论计算值相吻合.纯化后的UbcH10蛋白终浓度为8.82mg/ml,纯度达90%以上. 结论 成功表达并纯化了 UbcH10重组蛋白,为进一步研究其结构、功能以及该蛋白在肿瘤发生发展过程中的作用奠定了基础.     

重叠PCR合成蓖麻毒素B链基因及其在大肠杆菌中表达和抗原性分析

目的:表达蓖麻毒素B(RTB)链蛋白,为制备RTB特异性抗体奠定基础。方法:采用密码子优化软件对RTB编码基因序列重新优化设计,以18条长片段寡核苷酸引物经两步重叠PCR合成RTB基因片段,并在RTB的C端引入6×H is标签序列,插入表达载体pBV220,转化E.coliDH5α获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化。利用W estern印迹和间接ELISA方法鉴定重组RTB蛋白的抗原性。结果:表达工程菌株E.coliDH5α在42℃经诱导3 h后获得包涵体形式表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的65.48%,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与RTB相对分子质量相符,为29×103左右。表达产物经N i-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达96.21%,并可得到约25 mg/L重组RTB蛋白。结论:在国内首次应用重叠PCR合成RTB基因并实现高表达,纯化重组RTB蛋白可被抗天然蓖麻毒素多抗所识别,为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了基础。     

重组人瘦素融合蛋白在大肠杆菌中的低温自诱导表达、纯化和活性鉴定

目的:建立低温自诱导表达重组人瘦素(leptin)融合蛋白的系统方法,经体外纯化获得大量具有生物活性的瘦素蛋白.方法:从cDNA文库中扩增瘦素编码区,克隆到pGEM-T easy载体,测序正确后亚克隆到A1.3表达载体,转入BL21(DE3),低温自诱导表达.用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定表达产物.对低温自诱导表达产物rMBP-10His-Leptin进行纯化和酶切,获得可与瘦素单抗发生特异性反应的瘦素蛋白.用Km小鼠减肥实验检验其生物学活性.结果:在22×103处有明显的新增蛋白带,含量超过总蛋白的40%,Western印迹证实为瘦素蛋白.Km小鼠减肥实验证实其具有生物学活性.结论:成功建立了低温诱导表达rMBP-10His-Leptin的系统方法,获得大量瘦素蛋白,经验证表达产物具有免疫活性和生物学活性,可供进一步基础及临床研究应用.     

胰高血糖素样多肽-2的重组表达及鉴定

目的:构建胰高血糖素样多肽 - 2(GLP - 2)原核表达载体,在大肠杆菌BLR(DE3)中表达,为胰GLP - 2的作用机制的探究奠定基础.方法:人工合成GLP - 2序列,磷酸化后连接到质粒pET31b(+),构建成功的质粒GLP - 2/pET31b(+)转化至BLR(DE3)进行诱导表达,优化条件获得最大表达产量;纯化重组蛋白,溴化氰裂解蛋白获得单体蛋白,SDS - PAGE、Western blotting鉴定重组蛋白.结果:成功合成GLP - 2序列,与Genebank收录序列一致;构建原核表达质粒GLP - 2/pET31b(+),测序成功;37℃,OD600 nm为0.8时,加入1 mmol/L的IPTG诱导表达获取较纯的GLP - 2重组蛋白产量较高,溴化氰裂解获得了蛋白的单体.结论:成功构建GLP - 2原核表达载体,该蛋白具有生物活性.确定了优化表达条件,获得了具有生物活性的GLP - 2单体蛋白,为进一步研究奠定基础.     

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7的重组表达及生物信息学分析

目的 构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7(NS5ATP7)的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中的表达,并初步探讨其结构与功能.方法 应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得NS5ATP7基因片段,连接到pGEM-T载体,酶切鉴定及测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导以获得NS5ATP7融合蛋白的表达,SDS-PAGE、Western blot免疫印迹分析和证实该融合蛋白表达的特异性,并应用生物信息学方法对该融合蛋白的结构和功能进行预测.结果 利用RT-PCR扩增获得大小为891bp的NS5ATP7基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,成功获得了大小为48kD的目的蛋白,Western blot进一步证实了该蛋白具有特异性免疫反应识别.生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽.结论 利用大肠埃希菌BL21成功表达了NS5ATP7融合蛋白,结合生物信息学分析结果,为研究NS5ATP7蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

含有RSV G蛋白片段和CTL表位融合蛋白的表达及纯化

目的：构建表达呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段(G126，来自100-225氨基酸)和来自：RSVM2蛋白的CTL表位的原核表达质粒，探索适宜的表达和纯化条件，获得融合表达产物，为进行体内外实验检测奠定基础。方法：利用PCR技术，从质粒puC18(G10)、puC18(CTL)中扩增G126和CTL基因，通过DNA重组技术构建含：DsbAG126-Linker-CTL(DsbA-GLC)融合基因的表达载体pET(GLC)。转化宿主菌E.coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达，并采用亲和层析纯化目的蛋白。结果：DsbA-GLC在E．coli BL21(DE3)plysS中可获得高效表达，表达量可达菌体总蛋白的21％。通过可溶性测试，DsbA-GLC能以可溶性形式表达。纯化后目的蛋白的纯度可达到95％以上。结论：实现RSVG126和M2蛋白CTL表位的融合表达，所获得的重组蛋白可作为抗原用于RSV重组蛋白疫苗的筛选。     

人源性抗食管癌细胞单链抗体的表达纯化及活性鉴定

目的研究噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体的功能,对单链抗体进行包涵体表达纯化。方法将从噬菌体抗体库中筛选到的2个单链抗体基因分别连接到pET-28a、pET-SUMO原核表达载体中,分别构建原核表达重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化。采用盐酸胍稀释滴定复性方法对抗食管癌肿瘤细胞表面抗原的抗体进行复性,并用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果成功构建了重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,对重组菌株pET-NFC20b、pET NFC70a蛋白表达进行鉴定,诱导条件为0.5 mmol/L IPTG、时间3 h、温度18 ℃,重组蛋白均以包涵体形式表达,经滴定复性后均获得了相对分子量为30 kD和40 kD的重组蛋白。细胞ELISA实验鉴定2种蛋白NFC20b、NFC70a能与KYSE-170、KYSE-150、SMMC7721、A549等细胞结合,具有生物学活性。结论噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体NFC20b和NFC70a,可以成功地构建到pET28a和pET-SUMO载体内进行包涵体表达,纯化后具有蛋白活性,可为后续实验及检测试剂的研发奠定基础。     

我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达

目的：通过对登革病毒ＮＳ１基因的表达,研究表达的ＮＳ１蛋白的抗原性,为研制新型登革疫苗提供依据。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术将扩增的ＮＳ１基因插入到ｐＢＶ２２０载体中,通过温控诱导进行外源蛋白的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果：获得正向插入的ＮＳ１－ｐＢＶ２２０重组质普,表达产物的相对分子质量约为５１０００,与预期大小一致,并且可与登革２型     

青霉素结合蛋白2a C-末端在大肠杆菌M15中的表达、纯化及鉴定

目的构建含目的基因mecA C末端的重组子并在大肠杆菌M15中进行蛋白表达。方法采用PCR方法扩增mecA C末端DNA，将其与表达载体pQE30连接；再通过PCR及双酶切鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒转化大肠杆菌M15后，用1mmol／L的IPTG进行诱导表达。应用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pQE30-mecA重组表达质粒，转化大肠杆菌M15，经IPTG诱导表达，亲和层析纯化获得分子量为39．7kDa的蛋白；Western blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论在大肠杆菌内成功表达具有活性的PBP2a，为后期研究和开发抗MRSA药物奠定了基础。     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.     

胃癌相关基因GCRG213在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG213,制备高纯度的GCRG213蛋白。方法 采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG213 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102／D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达融合蛋白,凝胶回收目的蛋白。结果 SDS-PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约29．4kD的Thioredoxin,／GCRG213融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白的28．7％。经凝胶回收法得到纯度近1009,5的蛋白产品。结论 在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin,／GCRG213融合蛋白,并制备出高纯度蛋白产品,为后续的功能研究及其抗体研制奠定了基础。     

长双歧杆菌NCC2705 ATP结合蛋白BL0034表达与活性检测

目的克隆长双歧杆菌NCC2705中ATP结合蛋白BL0034的基因,利用大肠杆菌表达并纯化GST-BL0034融合蛋白,测定其结合ATP的活性。方法以长双歧杆菌NCC2705基因组为模板PCR扩增BL0034基因,双酶切后连接到pGEX-4T-1表达载体上,转入大肠杆菌BL21中表达;用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂对可溶性的GST-BL0034融合蛋白进行纯化,并用Western印迹验证。结果将BL0034基因克隆至质粒pGEX-4T-1,构建表达载体pGEX-4T-1-BL0034。BL0034经0.05 mmoL/L IPTG诱导,16℃过夜表达,SDS-PAGE可见相对分子质量约为82×103的可溶性表达条带;亲和纯化GST-BL0034,Western印迹结果为阳性。对纯化后的融合BL0033蛋白结合ATP的能力进行了定量测定,每毫克BL0034蛋白能结合约40 nmol/L ATP。结论成功克隆了BL0034蛋白的基因,表达并纯化GST-BL0034蛋白,证实了BL0034与ATP具有较强的结合能力,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705 BL0034蛋白的功能奠定了基础,为阐明其在果糖ABC转运系统中如何通过水解ATP产生能量提供了前提。     

重组人KGF-2的制备及生物学活性研究

目的:实现重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)的原核可溶性高效表达,并获得活性良好的重组蛋白.方法:将编码人成熟KGF-2的cDNA构建至pET/21a表达载体中,利用大肠杆菌BL21进行表达,对表达条件(如诱导温度和诱导时间等)进行优化,并对目的蛋白的表达情况进行电泳分析;利用阳离子交换柱对重组蛋白进行纯化,对纯化的rhKGF-2利用MTT法检测其促IEC-6及NIH/3T3细胞的增殖活性.结果:通过对表达条件的优化,rhKGF-2的表达量可占到全菌总蛋白的25%,并且基本上全部为可溶性形式表达;利用阳离子交换柱对rhKGF-2进行纯化,薄层扫描分析其纯度高于90%.利用MTT法对rhKGF-2的活性进行研究,结果表明,低浓度的rhKGF-2就能够促进IEC-6细胞增殖,但对于NIH/3T3细胞需高浓度的rhKGF-2才能促进其增殖.结论:本研究实现了对rhKGF-2的可溶性高效表达,纯化后的rhKGF-2具有较好的活性,这为进一步的功能研究以及基因工程重组药物的开发奠定了基础.     

登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的高效表达

目的：在大肠杆菌中对登革2型病毒包膜蛋白B区进行表达，为观察其抗原性和免疫原性奠定基础。方法：将通过PCR扩增的登革2型病毒包膜蛋白B区插入高效原核表达栽体pBAD／Topo ThioFusion，然后在大肠杆菌中利用阿拉伯糖进行诱导表达。时表达产物以免疲印迹和ELISA法进行检测。结果和结论：登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的表达产物以可溶性形式存在，表达量约占细菌可溶性总蛋白的62％。表达产物可与登革2型病毒的特异多抗反应，但与登革1、3和4型病毒的特异多抗无交叉反应。登革2型病毒包膜蛋白B区可在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术,将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型(抗-Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒,经SfiI／Not I酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,应用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1-Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv进行硫酸铵沉淀,并进行SDS-PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗-Id scFv片段基因由774bp组成。SDS-PAGE电泳表明,大肠杆菌XL1-Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗-Id scFv分子量约28kD。结论 HCV核心蛋白抗-Id scFv与HCV核心蛋白抗-Id scFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗-Id scFv的筛选和表达成功,为今后HCV核心蛋白抗-Id scFv的研究和应用奠定了基础。