环氧丙烷皂化废水活性污泥DNA提取方法的比较与优化

探索适宜的环氧丙烷废水中活性污泥微生物总DNA提取的方法并进行优化。采用11种方法提取环氧丙烷废水中活性污泥微生物总DNA,即Na Cl溶液-提取缓冲液-溶菌酶-十二烷基磺酸钠(SDS)法、蛋白酶K-SDS法、SDS-反复冻融法、Tris-EDTA-Na Cl-聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(TENP)法和反复冻融-SDS-蛋白酶K法等。通过对这11种方法进行比较,以确定最佳试验方案并结合单因素法对最佳方案进行优化。琼脂糖凝胶电泳结果显示:Na Cl溶液-提取缓冲液-溶菌酶-SDS法提取DNA亮度高,有大片断DNA的存在且拖带较少,条带集中;酶法所提取的DNA效果仅次于提取缓冲液-溶菌酶-SDS法,其他方案没有提取出DNA。单因子试验结果表明:10 mg/m L溶菌酶,100g/LSDS,反应时间为30 min,反应温度为45℃时效果最佳。Na Cl溶液-提取缓冲液-溶菌酶-SDS提取法为环氧丙烷废水中微生物群落在分子水平上的研究提供了一种简便、可靠的DNA提取方法。     

基于PCR DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立

通过比较4种小鼠粪便细菌总DNA提取方法对基于PCR-DGGE检测的肠道菌群多样性分析的影响,旨在建立适于PCR—DGGE的小鼠肠道微生物宏基因组提取的稳定、经济、快捷的方法。采用SDS裂解法、某国产市售粪便DNA提取试剂盒、改进的化学裂解法、改进的溶菌酶法4种方法提取小鼠粪便细菌总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、细菌16S rRNAV3区PCR扩增结合DGGE对提取结果进行比较分析。SDS裂解法和国产市售试剂盒2种方法提取粪便细菌总DNA均未得到理想结果,另2种方法均能够检测到粪便中20种左右的细菌。改进的化学裂解法和改进的溶菌酶提取法的建立为基于PCR—DGGE进行肠道菌群结构的定量及定性分析提供了可靠的前提基础和实验保障。     

PCR-DGGE研究微生物种群中多条带产生原因分析

鸡肠道微生物菌群经PCR-DGGE分析,回收PCR-DGGE分析胶上的一条DNA片段,回收的DNA片段再重复进行2次PCR-DGGE分析,以及分别用PCR反复循环扩增和PCR高保真酶扩增后再进行DGGE分析等方法研究PCR-DGGE分析中多条带产生原因。结果显示PCR-DGGE分析中多条带产生原因可能是作PCR扩增模板的DNA混杂有少量其他DNA片段,多条带现象不易被消除。DGGE分析胶上的DNA片段测序时,将该DNA片段回收、PCR扩增后克隆,提取多个阳性克隆菌的质粒DNA片段,分别与其原目的DNA片段进行DGGE分析,在DGGE分析胶上选取与原目的DNA片段处于同一电泳位置的质粒DNA测序,提高测序的准确性。     

浙贝母根际土壤总DNA提取和纯化方法的比较

本研究通过对6种土壤总DNA提取方法(CTAB-SDS-冻融法、玻璃珠-SDS-酚氯仿抽提法、玻璃珠-聚乙烯聚吡咯烷酮-SDS法、玻璃珠-聚乙烯聚吡咯烷酮-溶菌酶法、玻璃珠-聚乙烯聚吡咯烷酮-冻融法和UltraClean试剂盒法)和4种纯化方法(改进琼脂糖凝胶电泳法、2%聚乙烯吡咯烷酮-琼脂糖凝胶电泳法、PVPP层析柱法和低熔点琼脂糖电泳法)的比较,证明利用20 mmol/L EDTA(pH 7.5)预处理土壤后,利用CTAB-SDS-冻融法提取土壤总DNA并经改进琼脂糖凝胶电泳法纯化获得的浙贝母根际土壤总DNA的得率和纯度相对较高,达44.00 μg/g±2.65 μg/g土壤,可用于后续基于16S rDNA分析基础上的土壤微生物分子生态学的分析工作.     

小鼠胚胎胃肠道细菌基因组DNA提取方法比较

目的:筛选能均衡地提取小鼠胚胎胃肠道微生物区系各种细菌总DNA的方法.方法:分别采用反复冻融法、CTAB -SDS法、柱式基因组DNA提取试剂盒法提取小鼠胚胎胃肠道细菌基因组DNA,对其进行琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测定、PCR扩增等质量检测.结果:CTAB -SDS方法提取的基因组DNA纯度较高,OD260/OD280平均值最高,为1.845,电泳条带清晰,能满足下游的PCR扩增等分子操作.结论:确定CTAB -SDS方法为提取小鼠胚胎胃肠道细菌基因组DNA的最佳方法,为研究不同种动物胚胎的肠道菌群的结构和多样性奠定了基础.     

茶多酚的提取及其对抗生素所致肠道菌群失衡的调整和预防作用

为评价茶多酚对抗生素所致小鼠肠道菌群失衡的调整和预防作用,采用ZnCl2沉淀,乙酸乙酯萃取法提取茶多酚,HPLC检测提取效果;将BALB/c小鼠随机分为正常对照、失调模型、预防和治疗组,定期留取粪便,以自主改进法提取粪便细菌基因组总DNA,PCR-DGGE获得肠道菌群分子指纹图谱,进行相似性、多样性及主要差异条带序列的分析。结果表明提取茶多酚中有效成分EGCG的含量为42.67%;改进的溶菌酶法可有效对粪便细菌总DNA进行提取并保证下游分析顺利开展;DGGE分析显示治疗组和预防组电泳条带与正常对照组比较差异较小(P0.05),提示茶多酚对抗生素所致肠道菌群失衡具有一定的调整和预防作用,预防效果更佳。     

几种直接从高温热泉沉积物中提取DNA方法之比较

用酶解法,化学裂解法和微波炉法,冻融法等物理裂解方法组合出5种方法直接从滇西一个高温热泉沉积物提取DNA。经常规的琼脂糖凝胶电泳检测,发现用溶菌酶,蛋白酶K酶解,SDS化学裂解结合微波炉法裂解不仅可以得到较大量的DNA。而且碎片段较少,提取出来的DNA经RNA酶和蛋白酶K处理后可直接进行PCR扩增。同时DGGE（变性梯度凝胶电泳）电泳检测,结果表明,此法不仅可以得到该种环境中较多微生物分类单位的DNA,而且还能够较好地体现出它们在量上的差异。     

三种粪便总DNA提取方法的比较

目的比较不同粪便总DNA提取方法对肠道菌群多样性研究的影响。方法采用Bead beating法、化学裂解法和QIAamp DNA Stool Mini Kit提取同一份人粪便样品的总DNA,对比3种方法的DNA得率和16S rRNA基因V3区的变性梯度凝胶电泳（DGGE）图谱。结果Bead beating法的DNA得率约是其他2种方法的2倍;3种方法得到的DGGE图谱的Dice相似性为60％～70％,2条优势条带只出现在Bead beating法图谱中。在2～5min的Bead beating法击打时间里,DNA得率随击打时间的延长有一定的增加,但DGGE图谱无显著变化。结论不同的DNA提取方法会影响菌群的多样性分析。比较其他2种方法,Bead beating的裂解效率更高,能够检测到更多种类的细菌,更合适肠道菌群组成的分子研究。     

大麻沤麻液细菌种群多样性

从分子水平分析大麻沤麻液中细菌种类及其优势菌群,为筛选出大麻微生物脱胶的生产菌种奠定基础。采用PCR-DGGE技术研究大麻沤麻液中细菌种群的多样性及动态变化,使用Gel-Pro Analyzer 4.5软件分析DGGE指纹图谱,并对优势条带进行分析。结果表明:从发酵初期过渡到主发酵期细菌种群多样性上升,群落演替迅速,从主发酵期进入到发酵末期,细菌种群多样性下降,群落演替缓慢;在整个发酵过程中,细菌种群多样性指数在发酵中期(72h)达到高峰,说明发酵中期细菌种群数量、优势菌群种类达到了最高值,发酵初期和末期以不可培养细菌为主,主发酵期以成团泛菌属为主。     

鹌鹑肠道微生物PCR-DGGE方法的优化

通过对鹌鹑肠道微生物总DNA不同提取方法的效率进行比较,探讨DNA质量以及PCR-DGGE反应条件对研究鹌鹑肠道微生物多样性的影响。本试验利用常规的饱和苯酚/氯仿法和3种试剂盒(QIAGEN试剂盒、上海生工试剂盒、天根试剂盒)方法提取鹌鹑肠道微生物总DNA,分别以细菌V3可变区引物和V6-V8可变区引物以及不同退火温度进行PCR-DGGE分析。QIAGEN试剂盒法提取的肠道微生物总DNA的A260/A280值在1.8-1.9之间,浓度约200 ng/μL,DGGE微生物多样性条带均匀度均高于其他3种提取方法。此外,利用不同引物扩增的DGGE图谱发现,以V6-V8可变区引物扩增的DGGE图谱条带均匀,分离充分,较V3可变区更能反映鹌鹑肠道微生物种群的多样性;同时,随PCR退火温度的升高,V6-V8可变区的微生物多样性指数下降,V3可变区的微生物多样性则无明显变化。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.