宁夏苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因外显子7突变分析

目的 探讨宁夏地区苯丙酮尿症（PKU）患儿苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因外显子7 突变类型及频率,为该地区PKU 的基因诊断和产前诊断提供依据。方法 应用PCR 产物直接测序方法,对宁夏73 例经典型PKU 患儿（回族39 例,汉族34 例）的146 个PAH 等位基因外显子7 及其旁侧内含子区域进行序列分析。结果 共检测出6 种突变基因型,分别是R243Q（14.4%）、R241C（6.8%）、IVS7+2T → A（2.7%）、L255S（0.7%）、G247V（0.7%）和G247R（0.7%）。外显子7 突变基因总频率为26.0%（38/146）,包括错义突变和剪接位点突变两种。回族患儿R241C 等位基因突变检出率高于汉族（10% vs 3%,P<0.05）。结论 宁夏地区PKU 患儿PAH 基因外显子7 突变频率最高的是R243Q,其次为R241C;回族和汉族PKU 患儿R241C 等位基因突变率不同。     

宁夏地区苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变分析北大核心CSCD

目的：分析宁夏地区苯丙酮尿症（PKU）患者苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变分布特征,了解其热点突变位点及区域。方法采用直接测序的方法,首先对30例宁夏地区 PKU 患者 PAH 基因6个热点突变外显子3,5,6,7,11,12进行测序,对未检出突变的患者再进行外显子1,2,4,8,9,10,13测序。采用多重连接探针扩增（MLPA）方法对于通过测序方法未能明确突变基因型的患者进行外显子大片段缺失突变检测。结果通过对30例患者进行全部外显子序列突变分析,在60个等位基因中明确了58个突变等位,检出率为96.7％。其中在外显子3、5、6、7、11、12检出了49个突变,检出率为81.6％。这58个突变等位分属于23个突变位点,包括错义突变9种、剪接突变9种、无义突变2种、微小缺失突变2种、大片段缺失突变1种。其中 R243Q 突变频率最高（18.3％）,其次是 IVS4-1G ﹥ A（11.7％）和 R111X（11.7％）。在外显子11的测序中发现了一个新的缺失突变 N393del。采用 MLPA 技术在3例患者中检测到了大片段缺失突变 c.-1932＋3402del,其中1例为纯合缺失,2例为杂合缺失突变。结论宁夏地区 PKU 患者 PAH 基因突变具有明显的热点突变和突变热点区域。宁夏地区 PKU 患者存在 PAH 基因大片段缺失突变,MLPA 技术是检测 PAH 基因大片段缺失的有效手段。     

宁夏地区苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因外显子6突变研究

目的 探讨宁夏地区苯丙酮尿症(PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子6突变类型及频率,为该地区PKU的基因诊断和产前诊断提供依据.方法 应用聚合酶联反应(PCR)产物直接测序方法,对宁夏73例经典型PKU患儿[PKU患儿均为宁夏新生儿疾病筛查中心2010年1月至2013年6月确诊,病例分布于宁夏22县(市、区);年龄15 d～13岁;男38例,女35例;回族39例,汉族34例]和100例(回族50例,汉族50例)健康新生儿的PAH基因外显子6及其旁侧内含子区域进行序列分析.结果 共检测出6种基因突变型别,分别是EX6-96A＞ G(6.85％)、Q232X(2.74％)、D222G(1.37％)、V2301(1.37％)、R176X(0.68％)和N223I(0.68％),基因外显子6突变检出率为13.70％,包括3种突变型别,分别是错义突变3种(50.0％)、无义突变2种(33.3％)和剪切位点突变1种(16.7％);查阅国内外文献,其中EX6-96A＞G、Q232X和R176X国内早有报道,D222G、V2301为国内首次报道的PAH突变,N223I为国际上尚未见报道的新PAH突变.结论 明确了宁夏地区PAH基因外显子6突变类型及频率,丰富了该地区PKU基因研究,为开展PKU的基因诊断提供依据.     

北京地区苯丙酮尿症基因突变构成及基因型与表型相关分析

目的 明确北京地区苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶基因(phylalanine hydroxylase gene,PAH)突变图谱及其突变基因的微单体型(STR/VNTR)构成,探讨突变基因型与生化代谢表型的相关关系.方法 应用PCR/SSCP、序列分析和变性凝胶电泳等技术,对50例北京地区PKU患儿及其父母,进行PAH基因的全部外显子及两侧的内含子序列和STR与VNTR多态性分布的分析.依据由基因型预测生化代谢表型的方法进行基因型与生化代谢表型的相关关系分析.结果 (1)共检测到34种PAH突变基因,总的检出率为95%;较为常见的突变有R243Q(20%)、EX6-96A＞G(11%)、Y356X(9%)和V399V(7%),其次是R111x(5%)、R413P(5%)、R252Q(3%)和A434D(3%).(2)北京地区PKU患儿的STR杂合度较高,共检测出8种等位基因,以240 bp(34%)和244 bp(44%)最为常见;而VNTR的杂合度较低,只检测到3种等位基因,以VNTR3(83%)最为常见.(3)由基因型预测的生化代谢表型与患儿实际的生化代谢表型之间一致率为81.5%,在经典型PKU中一致率达到87.5%.结论 (1)北京地区共有34种PAH基因突变,检出率为95%,以R243Q、EX6-69A＞G、Y356X和V399V突变为常见突变.(2)PAH突变基因的微单位(STR/VNTR)构成以240/3和244/3最为常见.(3)PKU患儿基因型与生化代谢表型之间存在较好的相关关系,一致率达到80%以上.     

青海地区苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

目的 明确青海地区苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的突变特征,为该地区苯丙酮尿症(PKU)的产前诊断和遗传咨询提供理论依据。方法 选取2006年1月至2012年12月经新生儿疾病筛查及门诊遗传咨询发现并确诊的49例青海地区PKU患儿为研究对象,应用PCR产物直接测序法对49例PKU患儿及其父母的PAH基因启动子、第1~13外显子及其旁侧内含子区域进行基因突变分析。结果 在98个PAH等位基因中检测出30种、共计80个不同的突变基因,总检出率为82%(80/98),主要包括19种错义突变(63%)、5种无义突变(17%)、3种剪切位点突变(10%)和3种缺失突变(10%),大部分突变集中在第3、6、7、11外显子及第4内含子区域,常见的4种突变是p.R243Q(19%)、IVS4-1G>A(9%)、p.Y356X(7%)和p.EX6-96A>G(5%);p.N93fsX5(c.279-282delCATC)、p.G171E(c.512G>A)突变是国际上未见报道的新的PAH基因突变,p.H64fsX9(c.190delC)突变为国内第2次报道。青海地区PAH基因的突变构成有一部分与北方各省份相似,与中国南方部分省区及日本、欧洲等国家差异显著。结论 青海地区表现出多民族聚居地区PAH基因突变特有的多样性和复杂性。     

苯丙氨酸羟化酶缺乏症基因型与表型的关系

目的研究江苏地区苯丙氨酸羟化酶缺乏症(PAHD)患儿的基因突变特点,构建本地区苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变谱,讨论PAHD基因型与表型的关系。方法应用基因测序技术对70例PAHD患儿及其父母进行PAH基因第1~13外显子及两侧内含子序列分析。结果 70例患儿的140个等位基因中125个检测出突变,检出率为89.29%,常见突变依次为EX6-96AG(19/125,15.20%),R243Q(18/125,14.40%)和R241C(17/125,13.60%)。经典型苯丙酮尿症(PKU)患儿最常见突变为R243Q和EX6-96AG,共占42.86%中度PKU患儿最常见突变为EX6-96AG,R241C和R111X,共占40.74%;轻度PKU患儿最常见的突变是R241C,EX6-96AG和R243Q,共占57.89%;轻度HPA患儿最常见的突变是R241C和R243Q,共占40.00%。通过基因型预测的生化表型与患儿实际生化表型一致率为65.63%,其中经典型PKU的预测一致率较高,为81.25%;预测生化表型(即AV值评分)与患儿治疗前血苯丙氨酸水平呈显著负相关(r=-0.77,P0.001)。结论江苏地区PAH基因突变谱与其他地区有所不同,基因型与表型之间存在一定的联系。     

人苯丙氨酸羟化酶突变体p.R243Q、p.R241C和p.Y356X的体外表达及功能研究

目的 分析3种苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)突变体(p.R243Q、p.R241C和p.Y356X)的体外表达,确定3种突变体的致病性。方法 利用生物信息学技术预测PAH突变体对PAH蛋白结构和功能的影响。构建相应的PAH突变型质粒,在人胚胎肾细胞HEK293T中进行表达,采用定量逆转录聚合酶链反应检测3种PAH突变体的mRNA表达水平,利用蛋白质印迹法与酶联免疫吸附试验检测突变体的PAH蛋白表达水平。结果 生物信息学分析预测结果显示,3种突变体均具备致病性。突变体p.R243Q和p.R241C质粒在HEK293T细胞中的mRNA表达水平与野生型类似(P>0.05),而p.Y356X突变体质粒的mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。3种突变体PAH蛋白的表达水平与野生型相比均显著降低(P<0.05)。p.R241C和p.Y356X的细胞外PAH蛋白浓度较野生型降低(P<0.05),p.R243Q与野生型相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 p.R243Q、p.R241C和p.Y356X降低真核细胞中...     

四氢生物蝶呤反应性苯丙氨酸羟化酶缺乏症的临床与基因研究

目的 探讨四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）反应性苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）缺乏症临床表型和基因型的关系。方法 38例高苯丙氨酸血症（hyperphenylalaninemia，HPA）患儿均进行口服BH。负荷试验（20ms／kg）或Phe-BH。联合负荷试验，同时进行尿蝶呤谱分析、红细胞二氢蝶啶还原酶（dihyaropteridine reductase，DHPR）测定。对7例BH4反应性PAH缺乏症患儿采用聚合酶链反应（PCR）和单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析对PAH外显子进行突变筛检，并结合DNA直接测序方法进行突变分析。结果 确诊10例BH4反应性PAH缺乏症患儿，男6例，女4例；平均年龄7．8个月；生化代谢表型均为轻度或中度HPA。7例BH4反应性PAH缺乏症患儿PAH基因型分别为S70del／-、R241C／R243Q、S70del／A389G、Y166X／-、R11lX/-、EX6-96A〉G／R241C和IVS4-1G〉A／R241C。A389G是新发现的突变基因型。结论 BH4反应性PAH缺乏症多表现为轻、中度HPA生化代谢表型，R241C是BH4反应性相关突变基因型中较常见的一种类型。推测S70del可能是一种BH4反应性相关突变类型.     

淮海地区汉族苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变分析北大核心CSCD

目的研究淮海地区汉族苯丙酮尿症（PKU）人群中苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变特征。方法选择2003年1月至2013年12月在徐州市妇幼保健院确诊的101例PKU患者,应用聚合酶链反应．单链构象多态性（PCR-SSCP）分析及基因测序方法,对础H基因13个外显子及其两侧部分内含子进行突变的筛查和确定。结果1．在202个PAH等位基因中共检测出24种不同的突变类型,将这24种突变资料提交美国国立生物技术信息中心（NCBI）dbSNP数据库,获得24个序列号SS#2137543837～SS#2137543860。2．PAH基因突变集中在第7外显子及其两侧部分内含子。最常见的突变是c．728G〉A（P．R243Q）（18．317％）,其他较常见突变有C．721C〉T（P．R241C）（8．416％）,C．1155G〉C（P．1385L）（4．950％）,C．1068C〉A（P．Y356X）（3．960％）,c．-71A〉C（-71A〉C）（3．465％）,C．60＋62C／T（IVSl＋62C〉T）（2．970％）。3．在中国汉族PKU人群朋日基因发现了2个新的突变：c．60＋62C〉T（IVSl＋62C〉T）和c．782G〉T（P．R261L）。结论淮海地区PAH基因大部分突变类型和比例与中国其他地区相似,少部分存在明显差异。淮海地区汉族PKU人群PAH基因突变谱呈地域特异性。     

Citrin 缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症 SLC25A13 基因分析

目的：Citrin 缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症（NICCD）是一种由SLC25A13基因突变引起的常染色体隐性遗传病,临床可表现为肝内胆汁淤积性黄疸、低出生体重、生长迟缓和低蛋白血症等。本研究通过DNA测序技术探讨中国NICCD患儿 SLC25A13 基因突变类型。方法：针对 SLC25A13 基因的 18 个外显子及其侧翼区碱基序列设计引物,应用 PCR 技术扩增目的片度。PCR 扩增、纯化后直接测序,确定其突变类型。IVS16ins3kb 突变则采用巢式 PCR 和 RT-PCR 进行检测。结果：发现7种SLC25A13基因突变类型,包括851del4、1638ins23、IVS16ins3kb、IVS6+5G>A、c.775C>T（p.Q259X)、c.1505C>T（p.P502L） 和 c.1311C>T（p.C437C）;并确认一种复合突变类型［1638ins23+IVS16ins3kb］。其中c.775C>T（p.Q259X）、c.1505C>T（p.P502L）和 c.1311C>T（p.C437C）为新发现的基因突变类型。在20例NICCD患儿中,6 例为 851del4 纯合突变,7 例为杂合突变,另有 7 例为单一突变类型的杂合子。突变类型以 851del4 为主,占所有突变类型64%;其次为 1638ins23、IVS16ins3kb 和 IVS6+5G>A（分别占15%、12% 和 6%）。结论：851del4突变在 NICCD 患儿中最为常见。     

Phenylketonuria genotypes correlated to metabolic phenotype groups in Norway

In order to establish a genotype-phenotype relationship, we have identified both mutant phenylalanine hydroxylase (PAH) genes in 108 phenylketonuria (PKU) patients (27 different alleles, 54 different genotypes). One major group of patients with very high pretreatment phenylalanine values (classical PKU) exclusively comprised homozygotes of the PKU mutations I65T, G272X, F299C, Y356X, R408W, IVS12nt1, and compound heterozygotes of various combinations of these alleles with G46S, R261Q, R252W, A259T, R158Q, D143G, R243X, E280 K, or Y204C. A second major group of patients with lower phenylalanine values (mild PKU) comprised mutations A300S, R408Q, Y414C in various compound heterozygous states, and R261Q, R408Q, Y414C in homozygotes. The phenylalanine values in these groups were non-overlapping. In addition, a smaller group of patients formed the transition between the two main groups. In sib pairs 4 of 15 had discordant pretreatment phenylalanine values.     

以小分子蛋白尿为主要表现的Dent病六例临床及基因分析

目的 分析和总结6例儿童Dent病的临床及基因特征.方法 总结6例Dent患儿的临床资料,采用聚合酶链反应及直接测序的方法检测CLCN5基因.结果 6例患儿均有不同程度的小分子量蛋白尿和高钙尿症.其中3/6有血尿,4/6有肾钙化,3/6有低磷血症,1/6有佝偻病.在这6个家系中发现了6个CLCN5基因突变,包括3个无义突变、1个剪切位点突变、2个错义突变,分别为L594fsX595、R637X、R467X、IVS4-2A>G、S244L和V505G.其中,IVS4-2A>G和V505G是新突变.结论 小分子蛋白尿和高钙尿症是6例Dent病患儿的主要临床特征;Dent病可有Bartter综合征样表现,需要基因诊断进一步确诊.     

Assessment of tetrahydrobiopterin responsiveness in Turkish hyperphenylalaninemic patients

Tetrahydrobiopterin (BH4) therapy is the latest alternative approach in phenylalanine hydroxylase (PAH) deficiency, and is suggested for a number of hyperphenylalaninemic (HPA) patients with certain mutations. In our unit, therapeutic efficacy of BH4 was evaluated in 20 HPA patients (4 mild HPA, 9 mild phenylketonuria-PKU, 7 moderate PKU) by a single oral dose of BH4. Overall, 60% of the patients responded (45% favorably, 15% partially). All of the mild HPA patients and 55% of mild PKU patients responded to BH4 favorably and an additional 11% of mild PKU patients responded partially. Of 7 moderate PKU patients, 2 responded partially (28%). The genotypes of the patients who responded to BH4 favorably were: DelF39/-, L48S/L48S, R261Q/- (4 patients), A300S/IVS2nt5g > c, A300S/-, E390G/E390G. The genotypes of the patients who exhibited a partial response were: L48S/L48S, R261Q/ R261Q, IVS10nt546/-. We concluded that since there are too many mutations and many patients are compound heterozygote, it is difficult to predict BH4 responsiveness based solely on genotype, especially for the mutations which show inconsistent phenotypes. The best way to identify the patients who are more likely to benefit from BH4 administration is performing BH4 loading test. Long-term BH4 loading test should be performed in classical and moderate PKU patients to confirm that they are not responsive to BH4.     

Rapid detection of phenylketonuria mutations by non-radioactive single-strand conformation polymorphism analysis

A non-radioactive single-strand conformation polymorphism (SSCP) method was used to detect various phenylketonuria (PKU) mutations in Japanese and Chinese patients. Arginine⁴¹³-to-proline (R413P) mutation in exon 12 of the phenylalanine hydroxylase gene was identified in a Japanese patient by this method. The segregation of the R413P mutation in the proband's family was clearly demonstrated and the carrier status of each family member was determined. Analysis of DNA fragments containing exon 7 originated from Chinese patients revealed two mutations, arginine²⁴³-to-glutamine (R243Q) and arginine²⁶¹-to-glutamine (R261Q), and a polymorphism, valine²⁴⁵-to-valine (V245V). Although R261Q has been identified previously among Caucasian subjects, this report is the first to describe this mutation among Orientals. Since the non-radioactive SSCP method employs pre-cast acrylamide gels and pre-made gel buffer strips combined with semi-automated temperature-controlled electrophoresis, it can be performed without much expertise in molecular biological techniques. The ability of this method to detect various mutations as demonstrated in this study and its ease of use make it feasible to detect PKU mutations in a routine DNA diagnostic laboratory.