银屑病和SLE患者血清抗亲环素A抗体的检测及意义

亲环素Ａ (ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡ ,ＣｙＰＡ )是免疫抑制剂环孢菌素Ａ (ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ ,ＣｓＡ )的结合蛋白 ,位于细胞内 ,是一组具有酞酰脯氨酰顺反异构酶活性的蛋白质家族中的主要成员。ＣｙＰＡ除介导ＣｓＡ的药理作用外 ,还具有其他重要的免疫调节功能[1] 。已有报道抗ＣｙＰＡ抗体存在于系统性红斑狼疮 (ＳＬＥ )等自身免疫病患者血清中 ,其抗体水平与疾病的活动存在相关性[2 ,3] 。银屑病是临床上常见的一种慢性炎症性皮肤病 ,其病因与遗传、感染、免疫等密切相关。目前 ,国内外已有较多应用ＣｓＡ治疗ＳＬＥ、银屑病…     

活化淋巴细胞及其染色质诱导抗核抗体生成

系统性红斑狼疮 (ＳＬＥ)是自身免疫病的原型 ,其最重要特征是血清中出现以抗双链ＤＮＡ(ｄｓＤＡＮ)、抗Ｓｍ等为主的致病性抗核抗体 (ＡＮＡ)。阐明抗ｄｓＤＮＡ和抗Ｓｍ抗体生成的机制 ,对了解ＳＬＥ发病机制有重要意义。虽然多种假说来解释ＡＮＡ生成的机理 ,但许多证据提示是抗原驱动ＡＮＡ生成。令人困惑不解的是哺乳类动物ｄｓＤＮＡ、组蛋白、核小体等核成分并不具有免疫原性 ,因此启动生成的激发原迄今不明。一、活化的淋巴细胞同系免疫诱导抗核抗体生成1 细菌活化的淋巴细胞 :1 996年 ,我们首次发现经空肠弯曲菌 (ＣＪ- 1 0 1 )…     

狼疮样小鼠IL-6、IL-10水平和抗DNA抗体动态变化

系统性红斑狼疮 (ＳＬＥ)是典型的自身免疫复合性疾病 ,我们以ＳＬＥ模型之一的慢性移植物抗宿主病 (ｃＧＶＨＤ)小鼠为对象 ,以探讨ＴＨ2细胞因子动态变化与肾脏病变之间的关系。采用慢性移植物抗宿主病 (ｃＧＶＨＤ)小鼠模型。取 2 4只模型动物 ,分别于 0、8、10、12周处死动物 ,分离血清 ,同时留取尿液。另设对照组 ,同期处死。测定血清ＩＬ 6、ＩＬ 10、抗ｄｓ ＤＮＡ抗体含量 ,采用ＥＬＩＳＡ方法 ,具体步骤按试剂盒说明书。用ＢＵＮ试剂盒测定血清尿素氮(ＢＵＮ)浓度 ,用考马斯亮蓝法测定尿蛋白质浓度。资料统计采用Ｏｎｅ ＷａｙＡＮ…     

胶质瘤单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的 构建并高效表达抗胶持瘤单链抗体（ＳｃＦｖ）,为基因工程双功能抗体的制备及进一步用于脑肿瘤的诊治奠定基础。方法 以重、轻链可变区基因构建ＳｃＦｖ基因,并克隆入表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１,在大肠杆菌ＢＬ２１ＤＥ３中诱导表达。以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达产物。结果 以限制性内切酶酶切及ＤＮＡ测序证实,基因构建正确,表达产物的相对分子质量（Ｍｒ）为５２０００,与理论值相符,表     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

布氏姜片吸虫（Fasciolopsis buski）线粒体DNA的限制性内切酶分析及物理图谱构建

本文报告了采用ＢｇｌⅡ，ＥｃｏＲⅠ，ＥｃｏＲⅤ，ＨｉｎｄⅢ，ＰｓｔⅠ，ＰｖｕⅡ，ＳａｌⅠ七种识别六对碱基的限制性内切酶对布氏姜片吸虫（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ　ｂｕｓｋｉ）线粒体ＤＮＡ进行酶切分析的结果。发现ＥｃｏＲⅠ，ＥｃｏＲⅤ和ＢｇｌⅡ在该线粒体ＤＮＡ上分别有２，３和４个酶切位点，而ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ．ＰｖｕⅡ和ＳａｌⅠ则不能切割该线粒体ＤＮＡ。根据该线粒体的ＤＮＡ的单酶，双酶完全酶解及单酶部分酶解所产生片段的分子量和片段数量，建立了布氏姜片吸虫线粒体ＤＮＡ的限制性酶切物理图谱。     

我国北方地区献血员庚型肝炎病毒感染的研究

我们对我国北方某地区健康献血员血浆中的庚型肝炎病毒 (ＨｅｐａｔｉｔｉｓＧｖｉｒ ｕｓ ＧＢｖｉｒｕｓＣ ,ＨＧＶ)ＨＧＶＲＮＡ及抗 ＨＧＶ抗体进行了检测 ,初步探讨了我国北方地区单采浆献血员血浆中ＨＧＶ感染情况。1　材料和方法1 1　标本和试剂　北方某地区单采浆献血员血浆 176份。经检测血浆ＨＢｓＡｇ、抗 ＨＣＶ、抗 ＨＩＶ抗体均为阴性 ,血清丙氨酸转氨酶 (ＡＬＴ)水平正常。异硫氰酸胍、琼脂糖均为Ｓｉｇｍａ公司产品 ;ＰｗｏＤＮＡ聚合酶为Ｒｏｃｈｅ公司产品 ;限制性内切酶、Ｔ4ＤＮＡ连接酶、ＡＭＶ逆转录酶、ＲＮＡ酶抑…     

表达反义hREV3基因片段的真核细胞表达质粒的构建

目的：构建真核细胞表达重组体,为今后利用反义核酸阻断技术研究ｈＲＥＶ３基因功能４及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法：用内切酶ＢａｍＨⅠ及Ｂａｍ ＨＩ＋ＨｉｎｄⅢ分别对ｐＢＳ－ｈＲＥＶ３进行单酶切和双酶切,从而得到含ｈＲＥＶ３ ｃＤＮＡ特异性保守序列的两种长度片段,分别将两者插入真核细胞载体;ｐＢＫ－ＲＳＶ和ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐ＾－。     

TSHR蛋白表达质粒的构建和TSHR蛋白的表达

目的：为获得足量的ＴＳＨＲ蛋白及建立Ｇｒａｖｅｓ’病的动物模型。方法：将构建于ｐＣＲ＾ＴＭ３中的ＴＳＨＲ ｃＤＮＡ经限制性内切酶处理后,重新构建于表达型载体ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘ质粒中,经酶切分析和ＰＣＲ检测,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ免疫印迹法检测其免疫活性．结果：证明ＴＳＨＲ ｃＤＡ基因正确地重组于ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘ中,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达     

自身免疫性疾病患者血清抗双股DNA抗体RIA的临床应用

由于抗ｄｓＤＮＡ抗体对ＳＬＥ有较好的特异性 ,1982年修订的美国及 1985年我国制定的诊断ＳＬＥ的标准中 ,都已列入抗ｄｓＤＮＡ抗体的测定[1] 。目前 ,抗ｄｓＤＮＡ抗体的测定方法很多 ,如酶联免疫吸附法、间接免疫荧光法、斑点免疫结合试验、放射免疫分析法等。本文用Ｆａｒｒ法对 15 3例自身免疫性疾病患者及 5 0例无偿献血体检健康合格者血清抗ｄｓＤＮＡ抗体进行了测定分析 ,现报道如下。材料和方法一、患者组血清标本 :来自于临床已确诊的自身免疫性疾病患者 15 3例 (女性 10 2例 ,平均年龄 35岁 ;男性 5 1例 ,平均年龄 43岁 ) ,其中…     

结核杆菌Ag85B DNA疫苗的制备及其免疫效应初探

将结核杆菌抗原Ａｇ85Ｂ基因克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ3中 ,构建成重组ｐｃＤＮＡ3 Ａｇ85Ｂ ,作为抗结核的ＤＮＡ疫苗 ,观察其对小鼠免疫应答的能力 ,为进一步研制抗结核疫苗提供依据。1 结核杆菌抗原Ａｇ85Ｂ真核表达载体的构建及在Ｃｏｓ 7细胞中的瞬时表达 :由本室构建的重组质粒ｐＵＣ1 8 Ａｇ85Ｂ ,经ＥｃｏＲⅠ /ＳａｌⅠ酶切 ,获得 860ｂｐＤＮＡ片段 ,插入经ＥｃｏＲⅠ /ＸｈｏⅠ酶切的载体ｐｃＤＮＡ3中 ,用ＨｉｎｄⅢ和ＸｈａⅠ酶切分析鉴定阳性克隆 ,获得表达载体ｐｃＤＮＡ3 Ａｇ85Ｂ。用 5μｇ纯化的重组质粒ｐｃＤＮ…     

多聚乙酸亚胺介导基因转移

目的 采用一种新的多聚阳离子化合物－多聚乙酰亚胺（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ,ＰＥＩ）,作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物。方法 骨骼肌细胞取生新生ＳＤ大鼠,经胰酶消化后培养,将ＬａｃＺ基因ＤＮＡ－ＰＥＩ复合物导入骨骼肌细胞内,最后用Ｘ－ｇａｌ组织化学染色法检测已转染的细胞。结果 ＰＥＩ可作为介导剂使ＬａｃＺ基因在培养的骨骼肌细胞中表达,其表达率可达到３０％。结论 ＰＥＩ在真核细胞中实施     

用噬菌体抗体库分离NK细胞抑制受体特异性的ScFv片段

目的探讨从噬菌体抗体库分离杀伤细胞抑制受体（ＫＩＲｓ）特异性ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖ）的可行性及其特征。方法所用ＫＩＲ为ＮＫＡＴ２,其可溶性形式为ＮＫＡＴ２－ＩｇＧ１。噬菌体抗体库为Ｎｉｓｓｉｍ等报道的半合成抗体库。抗体库经包被免疫管的ＮＫＡＴ２－ＩｇＧ１５次筛选后,可溶性ＳｃＦｖ由ＩＰＴＧ诱导细菌而获得,筛选效果由测定噬菌体的菌落形成单位及ＤＮＡ酶切图谱分析。ＥＬＩＳＡ、聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹分析ＳｃＦｖ特异性及免疫学特征,并进行ＤＮＡ的序列测定。结果５次筛选后,噬菌体得到２００倍的富集,酶切图谱也显示某种构型噬菌体的富集。４０个克隆的细菌上清经测试,３７个显示与ＮＫＡＴ２有较强的反应。ＳｃＦｖ经聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示相对分子质量为３０×１０３,其ＤＮＡ序列完全相同,重链ＣＤＲ３区编码氨基酸为ＥＳＮＬＶＴＣ,重链其它部分与ＤＰ３５一致。结论研究初步结果表明,用噬菌体抗体库可以快速、简便地产生用于ＫＩＲ研究的较高特异性的试剂。     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

CXC趋化因子CRG—2真核表达载体的构建及表达

１材料和方法１．１材料克隆质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ／ｃｒｇ－２为本室建立４。真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。胶回收试剂盒及转染用质粒小量提取试剂盒购自Ｇｉｂｃｏ公司。内切酶、Ｔ４连接酶、Ｔａｑ酶及转染脂质体Ｔｆｘ－２０购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞ＬＬＣ为本室保存。山羊抗ＣＲＧ－２多抗购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。１．２方法１．２．１重组真核表达载体的构建和鉴定将含有ｃｒｇ－２全长ｃＤＮＡ的重组质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ／ｃｒｇ－２，用ＸｂａＩ和ＫｐｎＩ双酶切亚克…     

地高辛标记大鼠下丘脑生长激素释放因子cRNA探针的制备及应用

制备地高辛标记大鼠下丘脑释放因子ｃＲＮＡ探针；方法；大鼠下丘脑生长激素释放因子的重组质粒ｃＤＮＡ＝ＰＧＥＭ４经转化扩增后，用碱性裂妥法获取质粒ｃＤＮＲ并纯化。用限制性内切酶ＥＣＯＲＩ酶切，以线性ｃＤＮＡ为模板，在Ｔ７和Ｓｐ６ＲＮＡ聚合酶作用下，采用体外转录法分别合成地高辛素标记的大鼠下丘脑生激素释放因子ｃＲＮＡ和ＲＮＡ探针。     

CpGDNA的免疫原性与系统性红斑狼疮发病机理的关系

系统性红斑狼疮患者血浆中不仅游离ＤＮＡ 含量显著增高, 且出现非甲基化ＣｐＧＤＮＡ以及凋亡小体, 它们很可能是由于自身淋巴细胞活化后引起的。这种自身ＤＮＡ 量和质的变化, 很可能是诱导致病性ＩｇＧ 类抗ｄｓＤＮＡ抗体生成的真正原因, 是诱发ＳＬＥ的自身免疫原。     

从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1…

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌ ｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ的大片段经直     

CLONING AND EXPRESSION OF cDNA FOR HUMAN LYMPHO-TOXIN

人淋巴毒素（ｈＬＴ）系由淋巴细胞经抗原或有丝分裂原活化后产生的一类细胞因子，它具有抗瘤、抗病毒活性和许多重要的免疫调节作用，是一种非常有前途的生物制剂。近年来发现的膜相关型淋巴毒素更提示ｈＬＴ可能具有尚未被揭示的免疫调节活性。因此，克隆人ＬＴｃＤＮＡ并在大肠杆菌表达重组ｈＬＴ，对于ｈＬＴ的开发利用和研究其功能都具有重要意义。本实验按照公布的ｈＬＴｃＤＮＡ序列，经计算机分析并结合实验要求设计并合成一对ＰＣＲ引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化２４ｈ的人Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ扩增出一５４１ｂｐＤＮＡ片段；经α－互补筛选，质粒小量快速抽提，限制性内切酶酶切鉴定，将该片段定向克隆于ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９质粒载体。限制性内切酶图谱分析和Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法序列测定表明：该ＤＮＡ片段与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致。它包括编码人淋巴毒素成熟肽的全部ｃＤＮＡ序列。再进一步将该ｃＤＮＡ片段克隆于原核表达载体ｐＢＶ２２０，经地高辛标记探针菌落原位杂交筛选，限制性内切酶酶切鉴定方向，筛选出一阳性重组子ｐＢＶ－ｈＬＴ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析表明：经温控诱导，该重组菌成功     

猪卵透明带-3α基因在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的通过遗传工程获得ＺＰ３α融合蛋白,以便用表达产物制备ＺＰ３α单克隆抗体。方法根据重新测序的猪ＺＰ３αｃＤＮＡ５＇端非编码碱基数,ｐＷＲ４５０表达质粒家族的ｐＷＲ４５０－２被选用来表达β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）／ＺＰ３α融合蛋白。带５＇端非编码区和信号顺序的全长ＺＰ３αｃＤＮＡ片段,用ＥｃｏＲⅠ酶切自ｐＺ５８质粒,然后被重组插入ｐＷＲ４５０－２质粒中被截短ＬａｃＺ＇基因的３＇端多克隆区。此重组质粒转化大肠杆菌ＴＧ１后,ＺＰ３α融合蛋白的表达通过ＩＰＴＧ诱导。结果在１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ存在下可观察到ＬａｃＺ／ＺＰ３α融合蛋白在大肠杆菌中的表达,表达量约占总细菌蛋白的５％。在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上,融合蛋白显示相对分子质量为１０．２×１０４。在蛋白印迹实验中,融合蛋白显示了与兔抗猪ＺＰＩｇＧ的特异免疫学反应。结论猪ＺＰ３α融合蛋白的可获得性将有助于今后开展制备抗ＺＰ３α单抗和评价它的抗生育功效等研究