Bax、Bcl-2ASODN联合转染增强宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的实验研究

目的:研究凋亡抑制基因bcl-2反义寡核苷酸(ASODN)和促凋亡基因bax联合转染对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响,进而探求其放射增敏作用。方法:用逆转录病毒颗粒感染HeLa细胞,获得HeLa-bax细胞后,将bcl-2ASODN转染HeLa及HeLa-bax细胞,36h后放射治疗,通过MTT法、细胞形态学及流式细胞仪检测细胞增殖与凋亡,半定量RT-PCR测bcl-2及bax基因的表达。结果:(1)HeLa细胞经bcl-2ASODN及bax联合转染并放疗后,光镜观察有明显凋亡趋势;(2)MTT法及流式细胞仪检测其凋亡率明显高于单基因转染+放疗组(P<0.05);(3)RT-PCR结果显示,bax基因表达显著增强,而bcl-2基因表达较各对照组明显减弱。结论:凋亡抑制基因bcl-2ASODN和促凋亡基因bax联合转染诱导HeLa细胞凋亡效果明显优于单基因转染,可有效提高HeLa细胞的放射敏感性。     

黄芩素诱导人子宫颈癌HeLa细胞凋亡

目的:探讨黄芩素对人子宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法:MTT法测定黄芩素作用后人子宫颈癌HeLa细胞的生长抑制率;Hoechst 33258荧光染色法和Annexin-V/PI双染流式细胞术检测黄芩素诱导HeLa细胞凋亡的作用;Westernblot观察黄芩素对HeLa细胞bcl-2、Bax、caspase 3及p53表达的影响。结果:(1)不同浓度黄芩素作用24h后均可抑制HeLa细胞生长(P<0.05);(2)黄芩素作用24h后,HeLa细胞呈典型的凋亡形态学改变,凋亡率亦显著增加(P<0.01);(3)细胞内Bax、p53和caspase 3表达显著上调,bcl-2表达明显下调(P<0.05)。结论:黄芩素通过调控凋亡相关基因的表达,诱导HeLa细胞凋亡。     

microRNA-99b表达调控对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨上调microRNA-99b(miR-99b)表达对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的作用及可能的机制。方法:利用转染试剂将Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor转染宫颈癌HeLa细胞,荧光实时定量PCR方法检测miR-99b表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测其靶基因CDC-25A蛋白的表达。结果:转染Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor的HeLa细胞,miR-99b表达增高86.45倍,细胞增殖能力下降,细胞凋亡率增加,同时细胞CDC-25A蛋白表达降低。结论:上调miR-99b表达可通过降低靶基因CDC-25A表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,miR-99b可能成为治疗宫颈癌的靶基因。     

健康人CIK细胞对宫颈癌细胞杀伤作用及其机制的探讨

目的:观察健康人的CIK细胞对宫颈癌细胞的体外细胞毒活性,并对其杀伤机制进行初步探讨,为宫颈癌的过继免疫治疗临床应用提供实验依据。方法:分离获得健康人的外周血单个核细胞(PBMC),加入各种细胞因子体外诱导成CIK细胞,流式细胞仪对细胞作动态表型分析;用MTT法检测CIK细胞对宫颈癌细胞HeLa的细胞毒活性,用DNA凝胶电泳检测CIK细胞诱导HeLa细胞凋亡情况,用RT-PCR技术检测杀伤前后宫颈癌细胞Fas mRNA的表达水平。结果:健康人CIK细胞对HeLa细胞具有明显的杀伤活性,且随着作用时间的延长及效靶比的增加其杀伤活性逐步增加;DNA凝胶电泳结果显示,经CIK细胞作用后HeLa细胞DNA被降解,在DNA凝胶电泳图上呈现特异的梯状条带(DNA Ladder);RT-PCR结果显示经CIK细胞作用后HeLa细胞中Fas mRNA基因表达上调。结论:健康人CIK细胞对宫颈癌细胞具有较强的杀伤活性,其作用机制可能是通过上调癌细胞Fas基因的表达从而抑制癌细胞的增殖促进其凋亡直至死亡。为临床应用CIK细胞治疗宫颈癌提供了进一步的实验依据。     

雌、孕激素对人宫颈癌HeLa细胞体外生长影响的研究

目的 :探讨雌二醇 (E2 )、孕酮 (P)对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖及凋亡的影响。方法 :体外培养人宫颈癌HeLa细胞 ,免疫组化方法 ,测定其雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR)的表达 ;不同浓度的E2 、P和E2 +P作用于HeLa细胞 ,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观测HeLa细胞的增殖 ;流式细胞仪 (FCM)检测细胞周期、细胞凋亡率及细胞内bcl 2蛋白的表达 ;光学、电子显微镜检测其形态学和超微结构变化。结果 :HeLa细胞PR表达明显高于ER(P <0 .0 1)。E2 对HeLa细胞有明显促生长作用 (P <0 .0 1) ,P和E2 +P对细胞生长有明显的抑制作用 (P <0 .0 1) ,增殖抑制率与浓度呈正相关 (P <0 .0 5 )。FCM显示E2 组细胞周期S期比例上升 ,凋亡率下降 ,细胞内bcl 2蛋白表达上升 ;P组和E2 +P组G0 /G1期细胞比例上升 ,S期细胞比例下降 ,凋亡率上升 ,细胞内bcl 2蛋白表达下降 (P <0 .0 1)。光镜和电镜可见E2 组细胞生长良好 ,P组和E2 +P组可见细胞凋亡的形态学改变。结论 :E2 对宫颈癌HeLa细胞具有促进增殖、抗凋亡作用 ;P则抑制HeLa细胞增殖 ,并诱导其凋亡 ;E2 +P显示了抑制增殖、诱导凋亡的增强作用。足量的P可拮抗E2 对宫颈癌细胞的促增殖作用。     

米非司酮对人早孕期蜕膜细胞凋亡及其调控基因bcl-2/bax的影响

目的 :探讨米非司酮对早孕期蜕膜组织细胞bcl 2 /bax的影响及与妊娠终止的关系。方法 :用琼脂糖凝胶电泳、TUNEL法检测凋亡的发生及凋亡细胞的定位 ,用免疫组化法检测bcl 2 /bax蛋白的表达和相互关系。结果 :(1)正常早孕 4 0 + 天蜕膜组织细胞大量凋亡 ,bcl 2蛋白表达量较低 ,bax蛋白有较强表达 ;(2 )正常早孕 5 0 + 天 ,凋亡细胞明显减少 ,bcl 2的表达显著增强 ,bax蛋白表达减弱 ;(3)早孕 5 0 + 天应用米非司酮 ,蜕膜组织出现大量凋亡细胞及明显凋亡带 ,bcl 2蛋白表达明显降低 ,bax蛋白表达较前明显增强。结论 :早孕期米非司酮流产的机制可能与蜕膜组织细胞凋亡异常相关 ,bcl 2 /bax途径可能是其诱导早孕期蜕膜细胞凋亡的重要因素。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对人宫颈癌HeLa细胞的凋亡作用

目的 现察不同浓度肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对宫颈癌HeLa细胞的凋亡作用.方法 2006年于重庆医科大学,采用不同浓度的TRAIL作用于HeLa细胞,采用MTT(噻唑蓝)法检测细胞存活分数AO/EB(丫碇橙/嗅乙啶)双重荧光染色观察凋亡细胞结构;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率.结果 TRAIL作用于HeLa细胞24 h后,TRAIL对细胞生长抑制率及细胞凋亡率具有量效关系;AO/EB双重荧光染色可见到早期、晚期凋亡细胞;流式细胞仅检测有王二倍峰出现;细胞周期发生改变.结论 TRAIL对HeLa细胞生长有抑制作用,并可诱导其凋亡.     

三氧化二砷诱导卵巢癌细胞系SKOV3凋亡的实验研究

目的:探讨三氧化二砷对体外培养的SKOV3细胞的生物学效应和作用机制。方法:用MTT法、流式细胞术、电镜检测体外培养的SKOV3细胞在三氧化二砷作用下的增殖抑制及凋亡程度,用RT-PCR法检测P53/Bcl-2/Bax的mRNA水平。结果:(1)三氧化二砷对SKOV3细胞的增殖抑制作用随浓度升高和作用时间延长而明显增强,其72hIC50约6μmol/L;(2)流式细胞术证实6μmol/L三氧化二砷作用24h能使SKOV3出现G2M阻滞,作用72h诱导细胞凋亡达高峰,凋亡率为18.60％,作用96h则趋向坏死;6μmol/L三氧化二砷作用72h用电镜术也检测到凋亡细胞存在。(3)RT-PCR法显示SKOV3细胞在6μmol/L三氧化二砷作用2h、6h、24h、48h均显示Bax上调和Bcl-2的下调,其中Bax的上调以2h最显著。而Bcl-2的表达则随作用时间延长而逐渐下降,P53则未检测到表达。结论:在体外三氧化二砷能抑制SKOV3细胞增殖,诱导其凋亡,72h IC50约为6μmol/L。其诱导凋亡机制可能与Bax的上调和Bcl-2的下调相关。     

NS-398对宫颈癌细胞系的增殖抑制作用及对survivin基因表达的影响

目的:研究选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对宫颈癌HeLa,SiHa细胞系的增殖、凋亡作用及其对凋亡抑制基因survivin表达的影响。方法:体外培养宫颈癌HeLa,SiHa细胞系,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析不同浓度的NS-398分别作用于HeLa,SiHa细胞系24h、48h后对细胞增殖的作用;流式细胞仪(FCM)检测对细胞凋亡的作用;RT-PCR分析对凋亡抑制基因survivin表达的影响。结果:MTT检测显示,NS-398可抑制宫颈癌HeLa,SiHa细胞系增殖,并有浓度时间依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测提示,NS-398可诱导HeLa,SiHa细胞系凋亡,有浓度依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR分析表明,NS-398可抑制HeLa,SiHa细胞系凋亡抑制基因survivinmRNA表达,与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:NS-398可抑制宫颈癌HeLa,SiHa细胞增殖,诱导凋亡,其机制与抑制凋亡抑制基因survivin mRNA表达有关,为宫颈癌治疗提供了新的靶点和理论依据。     

丙基戊酸钠对宫颈癌细胞HeLa增殖的影响机制

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACI)丙基戊酸钠(sodium valproate,VPA)影响宫颈癌细胞HeLa增殖的机制。方法:用MTT法检测不同浓度VPA对HeLa细胞增殖的影响;倒置相差显微镜观察药物作用后细胞形态的变化;流式细胞仪(FCM)分析不同浓度VPA对HeLa细胞凋亡及细胞周期的影响;Western blot观察不同浓度VPA处理后caspase-3、bcl-2蛋白的表达变化。结果:VPA能明显抑制HeLa细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖关系;经4mmol/L VPA处理48h后,HeLa细胞缩小变形成长梭状、胞膜皱缩、贴壁不良;VPA诱导HeLa凋亡、阻滞细胞于G2/M期,同时抑制细胞增殖;随浓度增加,VPA能明显增加caspase-3蛋白表达,并可见到蛋白裂解产物,表明VPA可以促进caspase-3活化,但下调bcl-2蛋白的表达。结论:VPA有抗宫颈癌作用,其重要作用机制之一是诱导HeLa细胞凋亡、直接抑制细胞增殖,有望成为新的抗宫颈癌药物。     

特发性胎儿生长受限与胎盘细胞凋亡及bcl-2基因表达的关系

目的 探讨特发性胎儿生长受限(FGR)与胎盘细胞凋亡及bcl-2基因表达的关系.方法 应用透射电镜、脱氧核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL)、流式细胞技术(FCM)检测特发性FGR孕妇(FGR组)及正常妊娠妇女(对照组)各15例的胎盘细胞凋亡情况,并采用RT-PCR技术观察两组胎盘细胞中bcl-2基因相对表达量.结果 电镜下观察到FGR组胎盘合体滋养细胞核膜皱缩,核仁消失,染色质致密、凝聚;TUNEL 检测 FGR 组胎盘细胞凋亡率为13.68%,高于对照组的4.05%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);FCM检测胎盘S期细胞比率FGR组为3.4%,对照组为2.2%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05),FCM检测的胎盘细胞凋亡率变化趋势与TUNEL检测结果一致;FGR组胎盘细胞bcl-2基因相对表达量为0.19±0.13,对照组为0.55±0.17,两组比较,差异也有统计学意义(P<0.05).结论 特发性FGR的发生与胎盘细胞凋亡增加有关,胎盘细胞凋亡增加与胎盘细胞中bcl-2基因表达下调有一定关系.     

格尔德霉素对宫颈癌HeLa细胞中bcl-2表达的影响

目的:观察格尔德霉素(geldanamycin,GA)在体外对宫颈癌HeLa细胞抗凋亡基因bcl-2和mRNA转录、蛋白表达水平的影响。方法:分别给予宫颈癌HeLa细胞0,0.02,0.2,2,10μmol/L浓度GA处理24h,用annexin V方法检测细胞凋亡,半定量PCR检测bcl-2、Hsp90 mRNA转录水平,用10μmol/L的GA处理HeLa细胞3、12、24、48h后,Western blot检测bcl-2、Hsp90蛋白表达水平的变化。结果:宫颈癌HeLa细胞经不同浓度的GA作用24h,细胞凋亡指数呈剂量依赖性增加,bcl-2 mRNA表达呈剂量依赖性降低,bcl-2蛋白表达水平呈时间依赖性降低,处理组与对照组之间的差异有统计学意义;但GA对Hsp90 mRNA和蛋白表达水平无明显影响。结论:GA可抑制宫颈癌HeLa细胞抗凋亡基因bcl-2的转录和表达,促进凋亡。     

The In-Vitro Characterization of Induced Apoptosis in Placental Cytotrophoblasts and Syncytiotrophoblasts

Placental trophoblasts undergo apoptosis as part of normal epithelial turnover and placental ageing. Classically, the induction of apoptosis in in vitro preparations has utilized the cytokines TNFalpha and IFNgamma and has been measured using the TUNEL technique. The aim of this study was to compare apoptotic susceptibility of mononucleated and differentiated trophoblasts using a range of cytotoxic agents. To achieve this, an in vitro model of syncytialization was used, along with isolated placental cytotrophoblasts and an extravillous cytotrophoblast derived cell line (SGHPL-4). Cytotrophoblasts from term placentae (n=12), syncytiotrophoblasts (n=12) and SGHPL-4s (n=8) were cultured under reduced oxygen or with TNFalpha/IFNgamma, dexamethasone or staurosporine. Apoptosis assessments were made using TUNEL, Annexin V binding, fluorescence microscopy and ATP/ADP measurements.Each cytotoxic agent increased apoptosis in all three cell populations. For untreated cells, cytotrophoblasts showed the greatest levels of apoptosis in culture. With stimulation, these levels were significantly elevated using dexamethasone, TNFalpha/IFNgamma and staurosporine and further raised under hypoxic conditions. SGHPL-4 cells showed similar trends to those of cytotrophoblasts, however the syncytiotrophoblasts, although responsive to dexamethasone and TNFalpha/IFNgamma, showed lower levels of apoptosis with staurosporine and hypoxia. ADP : ATP measurements gave similar results to the other techniques and ratios of less than 1.0 were correlated with Annexin V measurements on the flow cytometer (P< 0.001). The typical morphological features of apoptosis i.e. chromatin margination, membrane blebbing and apoptotic body formation were detected in cytotrophoblasts and SGHPL-4 cells. However, only chromatin condensation could be recognized in syncytiotrophoblast preparations. Necrotic cell numbers were also increased under all cytotoxic conditions. Although elevated with dexamethasone, staurosporine and hypoxia, these levels were markedly raised in cytotrophoblasts and SGHPL-4 cells following incubations with TNFalpha/IFNgamma.These observations show variations in apoptosis between mononuclear trophoblasts and differentiated multinucleated syncytiotrophoblasts. Differential effects of stimuli may suggest disparate apoptotic pathways. These variations may reflect functional differences between placental cellular and syncytial components and may highlight the importance of exogenous stimulation in various stages of placental development.     

妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷的MAP激酶及细胞凋亡信号传导机制

目的 :探讨妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷的分子机制。方法 :将雌性SD大鼠分为 3组 :第 1组为正常对照组 ;第 2组为streptozotocin (STZ)构建的妊娠合并糖尿病诱发先天性神经管缺陷的实验组 ;第 3组为STZ构建的糖尿病大鼠模型 ,胚胎不伴有先天性神经管缺陷。于妊娠第 1 2天取出各组胚胎 ,解剖显微镜下进行形态学分析 ;对卵黄囊细胞进行DNA片段分析 ;提取卵黄囊细胞蛋白质 ,应用特异性抗磷酸化抗体进行免疫共沉淀及Westernblot对MAPkinase(MAPK)信号途径上各蛋白激酶活性进行分析。结果 :第 2组中 ,卵黄囊细胞出现细胞凋亡特征性的DNAladder,与正常对照组相比ERK1 /2蛋白激酶活性显著下降 ;与此相反 ,JNK1 /2活性明显升高 ,凋亡相关基因caspase 3、Bax高表达 ,凋亡抑制基因AKT活性明显受抑。结论 :糖尿病诱发的胚胎先天性神经管缺陷的发生 ,与MAPkinase及细胞凋亡信号传导机制异常密切相关     

吉西他滨对人子宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用及其机理研究

目的研究低浓度[即处理24 h时的10％药物致死剂量,24 h IC10]吉西他滨对人宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用及其机理。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选吉西他滨增敏实验的浓度(即24 h IC10);以该浓度吉西他滨处理HeLa细胞4、8、12及24 h,弃药后立刻行60Coγ射线照射(4、6、8 Gy),计数细胞存活分数,计算增敏比;同时采用流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡效应,蛋白印迹杂交法分析p53、bcl-2及box蛋白表达量的变化。结果吉西他滨的24 h IC10,为0.01μmol/L,该浓度吉西他滨分别处理细胞4、8、12及24 h,弃药后立刻照射,增敏比分别为1.19、1.35、1.72、1.93。流式细胞仪分析显示,S期细胞比例随吉西他滨处理时间延长而逐渐升高(P<0.01),其中处理24 h时,S期细胞占51.8％。吉西他滨处理后照射,凋亡细胞比例占21.6％,同时,凋亡相关基因p53、bcl-2及bax蛋白的表达量,与单纯吉西他滨处理及单纯照射相比无明显变化(P>0.05)。结论低浓度吉西他滨对HeLa细胞具有放射增敏作用,其增敏比随吉西他滨处理时间延长而增加。增敏机理与细胞S期阻滞密切相关,而与引发细胞凋亡关系不明显。     

孕激素对人卵巢癌细胞株H08910细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨孕激素（Ｐ）对人卵巢癌细胞株ＨＯ８９１０细胞体外增殖及凋亡的调控作用。方法 选用人卵巢癌细胞株ＨＯ８９１０进行体外培养,实验组中加入含有同浓度Ｐ的培养液,对照组加入等量空白培养液,采用四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）比色法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率,光学显微镜和透射电子显微镜进行形态学观察,终末脱氧核苷酸转移酶介导的ｄＵＴＰ缺口末端标记法（ＴＵＮＥＬ）计数凋亡细胞,流式细胞仪间