过氧化氢对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白表达的影响

目的采用体外研究方法探讨过氧化氢（H2O2）对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白（Grx）表达的影响。方法体外分离培养原代人结肠上皮细胞;通过相同浓度H2O2或不同浓度H2O2刺激原代人结肠上皮细胞,使细胞处于氧化应激状态,应用MTT比色法检测不同浓度的H2O2对细胞活力的影响,半定量RT—PCR检测H2O2对细胞Grx基因表达的影响。结果400μmol／L以上的H2O2降低细胞活力,300μmol／L浓度的H2O2在一定时间内随刺激时间的延长Grx基因表达相应增加（P〈0．05）,且在各时间点与对照组相比,H2O2组Grx基因表达均显著增加,在30min时表达量最多;在300μmol／L以下,随着H2O2浓度的增加,Grx基因表达水平亦相应增加（P〈0．05）,而500μmol／L浓度的H2O2组Grx基因表达与400μmol／L组相比有所下降（P〈0．05）。结论H2O2引起的氧化应激可明显上调原代人结肠上皮细胞Grx基因的表达,可能在基因水平上参与了对抗H2O2的的作用,但另一方面也赋予了细胞良好的抗凋亡能力,值得深入探讨。     

氧化应激对血管内皮细胞Grx表达的研究

目的采用体外实验，研究人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells．HUVEC）是否受氧化应激而高表达Grx。方法体外分离培养HUVEC；用不同浓度H2O2处理HUVEC，MTT法检测HUVEC活力。RT—PCR半定量检测GrxmRNA表达水平的差异。结果成功获得体外培养的HU—VEC；300-500mol／L H2O2均在不同程度上抑制细胞增殖（P〈0.05）。RT—PCR结果表明，GrxmRNA的表达随着200umol／L H2O2作用时间的增加而增加，30min时与正常对照组差异显著（P〈0．01）；不同终浓度H2O2作用30min结果表明，300umol／L H2O2作用可使GrxmRNA的表达量最高（P〈0．01）。结论建立了分离培养HUVEC的方法；氧化应激可上调HUVEC Grx mRNA表达，且HUVEC内Grx的表达与H2O2刺激呈时间剂量依赖关系。     

姜黄素抑制ECV304细胞增殖及对基质金属蛋白酶2表达的影响

目的：探讨姜黄素对人脐静脉内皮细胞（ECV304）的作用以及对ECV304表达的基质金属蛋白酶2（MMP-2）的影响。方法：采用MTT法，台盼蓝染色法测定姜黄素对ECV304的量效关系和时效关系，Giemsa染色观察姜黄素对ECV304的抑制作用；通过RT-PCR检测姜黄素作用ECV304后MMP-2mRNA表达，明胶酶谱法检测MMP-2的活性，免疫组化检测细胞MMP-2表达。结果：姜黄素对ECV304的押制作用呈浓度依赖性和时间依赖性，Giemsa染色显示浓度为8μg/mL和10μg／mL的姜黄素可诱导ECV304凋亡，凋亡率分别是21．6％和34．7％；在10μg／mL姜黄素作用24h下，MMP-2的mRNA显著减少，其分解明胶的活性也显著降低，免疫组化显示与阴性对照组相比内皮细胞MMP-2表达减少。结论：姜黄素能够抑制血管内皮细胞的生长、降低血管内皮细胞MMP-2的表达。     

尿酸盐对血管内皮细胞表达血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)mRNA的影响

目的观察不同浓度或不同时间范围内尿酸盐对人血管内皮细胞（endothelial cell of vessels,ECV）血管细胞粘附分子（VCAM-1）mRNA表达的影响。方法体外培养人血管内皮细胞,分别用710μmol／L、1070μmol／L、1430μmol／L（低、中、高）等不同浓度的尿酸盐刺激,用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术测定血管内皮细胞VCAM-1的mRNA表达;尿酸盐终浓度为1070μmol／L,分别孵育细胞8h、16h、24h、48h后用RT-PCR技术测定血管内皮细胞VCAM-1的mRNA表达。结果（1）低、中、高浓度尿酸盐刺激组细胞VCAM-1的mRNA表达均较空白对照组显著提高（P〈0．01）,以中浓度尿酸盐刺激组表达为最高。（2）内皮细胞在中浓度尿酸盐刺激下,8h、16h、24h、48h VCAM-1的mRNA表达均较空白对照组显著升高（P〈0．01）,但其表达于16h达到峰值。结论尿酸盐能直接作用于人的血管内皮细胞,诱导炎症分子的超表达,这也可能是其促进动脉粥样硬化斑块形成的重要机制之一。     

过氧化氢对胰岛微血管内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A2表达的影响

目的：研究过氧化氛（H2O2）对胰岛内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A2（iPLA2）mRNA表达的影响。方法：用0,30,100和300μmol／L H2O2诱导IMECs8h后进行RT-PCR检测;用300μmol／L H2O2分别诱导0,4,8和12h后应用RT-PCR技术进行iPLA2基因表达的检测。采用Annexin V-FITC／PI双染色检测细胞的凋亡率;采用DIOC6（3）染色检测细胞线粒体膜电位.结果：①300μmol／L H2O2作用12h的电泳条带亮度与其他组（0,30,100μmol／L）相比明显减弱,300μmol／L H2O2作用8h及12h的电泳条带亮度与0,4h相比明显减弱。②各浓度H2O2处理组（0,30,100和300μmol／L）IMECs凋亡率差异具有统计学意义[分别为（2.0±0.5）％,（19.1±5.8）％,（28.4±4.9）％,（40.1±5.1）％,P〈0.01];300μmol／L H2O2处理0,4,8,12h后,各时间点IMECs凋亡率差异具有统计学意义（P〈0.01）;③各浓度及各时间点H2O2处理组IMECs细胞内DIOC6（3）的荧光强度差异具有统计学意义（P〈0.01）.结论：H2O2对IMECs iPLA2的表达具有抑制作用,其抑制作用呈量效及时效关系。     

N-硬脂酰酪氨酸对H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的影响

目的研究N-硬脂酰酪氨酸（NsTyr）预处理对过氧化氢（H2O2）诱导的PC12细胞氧化应激损伤的影响。方法体外培养传代的PC12细胞分为空白对照组、H2O2损伤组（不同浓度H2O2诱导16h）和NsTyr预处理组（不同浓度NsTy预处理30min后加入100μmol／LH2O2诱导16h）。流式细胞仪检测细胞凋亡率及活性氧类（ROS）生成,Westernblotting检测Bax和Bcl-2的表达。结果与H2O2（100μmol／L）损伤组比较,5、10μmol／LNsTyr预处理组PC12细胞存活率显著升高（P〈0．01）,凋亡细胞率降低（P〈0．05）,细胞内ROS生成减少（P〈0．05,P〈0．01）,Bcl-2／Bax比值升高（P〈0．05）。结论NsTyr能提高PC12细胞的抗氧化应激损伤能力,上调Bcl-2表达和下调Bax表达,抑制细胞凋亡。     

AOPP对 ECV304细胞表达 SDF-1α的影响及其可能的机制

目的：观察晚期氧化蛋白产物（ advanced oxidation protein product ,AOPP）对内皮细胞表达基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor -1α,SDF-1α）的影响,并探讨其作用机制。方法 ECV304细胞分别经0,50,100,200μmol/L AOPP处理后,用RT-PCR法检测其SDF-1αmRNA的表达,观察AOPP对ECV304细胞的SDF-1α表达的影响。 ECV304细胞先经NF-κB通路特异性阻断剂BAY11-7082处理,再经AOPP处理,用RT-PCR法检测其SDF-1αmRNA的表达,观察BAY11-7082对AOPP促ECV304细胞SDF-1αmRNA表达作用的影响。结果 AOPP促进ECV304细胞SDF-1αmRNA 表达,并且随AOPP浓度的升高,SDF-1αmRNA 的表达增加。对照组、AOPP 50μmol/L组、AOPP 100μmol/L组及AOPP 200μmol/L组SDF-1αmRNA/GAPDH mRNA值分别为0．034±0．005、0．109±0．019、0．226±0．037及0．322±0．043,组间比较差异均有显著性意义,P＜0．05。BAY11-7082抑制AOPP促ECV304细胞SDF-1αmRNA表达,两组细胞SDF-1αmRNA/GAPDH mRNA值分别为0．256±0．035和0．322±0．043,P＜0．05。结论 AOPP可上调ECV304细胞表达SDF-1α,NF-κB通路可能是介导这一作用的重要途径之一。     

姜黄素对血管内皮细胞过氧化氢损伤的保护作用及其机制研究

目的研究不同浓度姜黄素（Cur）对正常血管内皮细胞活力的影响,及Cur对血管内皮细胞过氧化氢（H2O2）损伤的保护作用及机制。方法用不同浓度Cur（12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）处理体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）8 h,MTT法检测不同浓度Cur对HUVECs存活率的影响;H2O2（250μmol/L）孵育建立HUVECs损伤模型,不同浓度Cur（12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）与H2O2共同处理HUVECs 4 h,检测细胞存活率,黏附能力和培养液中乳酸脱氢酶（LDH）释放量;Griess法测定培养液中NO2-浓度,反映内皮细胞释放一氧化氮（NO）量。结果不同浓度Cur处理内皮细胞8 h后,内皮细胞的存活率无统计学差异（P〉0.05）;Cur能明显提高H2O2损伤的内皮细胞存活率和黏附能力（P〈0.01）,降低内皮细胞LDH的释放（P〈0.01）;增加H2O2损伤后HUVECs培养液中NO含量（P〈0.01）。其中Cur浓度为25μmol/L时效果最明显。结论不同浓度Cur（12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）对内皮细胞的存活率均无影响;Cur对血管内皮细胞氧化损伤具有保护作用,机制可能与其促进NO的合成有关。     

Celebrex对VEGF诱导的内皮细胞迁移的影响及其机制

目的:观察选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂celebrex对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞细胞迁移能力的影响及其与细胞内MMP-9表达的关系。方法:体外培养内皮细胞系ECV304,将细胞分为4组:①空白对照组(ECV304);②VEGF组(ECV304+VEGF);③celebrex+VEGF组(ECV304+VEGF+cele-brex);④celebrex组(ECV304+celebrex)。观察:①用损伤修复实验观察不同浓度celebrex对ECV304细胞迁移能力影响及对VEGF诱导下ECV304细胞迁移速度影响;②用半定量RT-PCR法检测VEGF及celebrex对ECV304细胞MMP-9 mRNA表达的影响。结果:ECV304细胞的迁移速度随VEGF浓度(0.02,0.2,2μmol/L)的增加呈降低趋势;celebrex+VEGF组(2μmol/L celebrex+5μg/L VEGF)迁移速度为(3.55±0.02)μm/h与VEGF组(5μg/L VEGF)迁移速度(7.66±0.02)μm/h比较,两者有显著差异(P<0.01);celebrex+VEGF组(2μmol/L celebrex+5μg/L VEGF)的MMP-9表达量明显低于VEGF组(5μg/L VEGF)。结论:celebrex能抑制VEGF诱导的ECV304细胞迁移,并使COX-2下游的MMP-9表达量显著下调,这是可能的机制之一。     

硫胺素和核黄素对H2O2诱导的DNA氧化损伤的影响

目的 探讨硫胺素和核黄素对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞ECV304的DNA氧化损伤的影响.方法 于细胞培养液中分别加入硫胺素(终浓度为10、100、500、1000 mg/L)或核黄素(终浓度为20、100、300、500 nmol/L)预处理24 h,给予H2O2(终浓度为25 μmol/L)反应30 min,采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)分析DNA氧化损伤情况.以不加H2O2、硫胺素和核黄素者为阴性对照组;以加H2O2而不加硫胺素、核黄素者为阳性对照组.结果 H2O2诱导ECV304细胞DNA断裂损伤,SCGE分析显示,阳性对照组拖尾细胞率、彗星尾长、尾部DNA含量和Olive尾矩等指标均较阴性对照组升高;经10、100、500 mg/L硫胺素或20、100、300 nmol/L核黄素预处理后,各DNA损伤指标均较阳性对照组显著下降(P<0.05或P<0.01);经1000 mg/L硫胺素或500 nmol/L核黄素预处理后,各DNA损伤指标与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 适宜浓度的硫胺素和核黄素能降低H2O2诱导的DNA氧化损伤,高浓度的硫胺素和核黄素不能保护H2O2诱导的DNA氧化损伤.     

硫胺素和核黄素对H2O2诱导的DNA氧化损伤的影响

目的 探讨硫胺素和核黄素对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞ECV304的DNA氧化损伤的影响.方法 于细胞培养液中分别加入硫胺素(终浓度为10、100、500、1000 mg/L)或核黄素(终浓度为20、100、300、500 nmol/L)预处理24 h,给予H2O2(终浓度为25 μmol/L)反应30 min,采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)分析DNA氧化损伤情况.以不加H2O2、硫胺素和核黄素者为阴性对照组;以加H2O2而不加硫胺素、核黄素者为阳性对照组.结果 H2O2诱导ECV304细胞DNA断裂损伤,SCGE分析显示,阳性对照组拖尾细胞率、彗星尾长、尾部DNA含量和Olive尾矩等指标均较阴性对照组升高;经10、100、500 mg/L硫胺素或20、100、300 nmol/L核黄素预处理后,各DNA损伤指标均较阳性对照组显著下降(P<0.05或P<0.01);经1000 mg/L硫胺素或500 nmol/L核黄素预处理后,各DNA损伤指标与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 适宜浓度的硫胺素和核黄素能降低H2O2诱导的DNA氧化损伤,高浓度的硫胺素和核黄素不能保护H2O2诱导的DNA氧化损伤.     

Effect of polysaccharide sulfate 916 on the production of nitric oxide in ECV3 04 cells induced by cytokines and H2O2

Objective To investigate the effect of polysaccharide sulfate 916 (PS916) on the productio n of nitric oxide (NO) in ECV304 cells induced by tumor necrosis factor-α (TNF α), interleukin-1β (IL-1β) and H(2)O(2) in vitro. Methods Production of NO in ECV304 cells was measured by the Griess method and the proli feration of cells was tested by the MTT method. The activity of NO synthase was detected spectrophotometrically.Results Production of NO in ECV304 cells decreased after treatment with 40 ng/ml IL-1 β and 40 ng/ml TNFα, but increased in the presence of H(2)O(2) 0.1 mmol/L . PS916 significantly enhanced NO production in ECV304 cells in a dose-depende nt manner in the TNFα and IL-1β treated groups and decreased it in the H2O 2 treated group. Proliferation of ECV304 cells was inhibited by TNFα and H 2O2 and no effect was found in the IL-1β treated group. PS916 increased the proliferation of cells treated with TNFα and H(2)O(2) dose-dependently. In vitro, PS916 has no effect on the activity of NO synthase. Conclusion PS916 has a protective effect on ECV304 cells exposed to IL-1β, TNFα and H2 O2.     

三氧化二砷对血管内皮细胞增殖和周期的影响

目的:观察As2O3对血管内皮细胞增殖、凋亡和细胞周期的干扰,探讨As2O3对血管内皮细胞生长的直接影响。方法:血管内皮细胞EVC-304体外培养,As2O3干预。采用MTT测定细胞活性,流式细胞仪测定细胞周期、细胞凋亡。结果:ECV-304细胞经过As2O3干预,其存活率明显降低,并且呈剂量依赖性。As2O3干预后,进入S期的细胞减少,细胞周期被阻在G1期,细胞可能在G1期进入凋亡。As2O3诱导早期凋亡是对照组的2.88～5.1倍,并且呈剂量依赖性;其晚期凋亡是对照组的1.17～1.67倍。结论:As2O3可直接干扰血管内皮细胞的细胞周期,阻滞细胞在G1期,并诱导细胞凋亡,进而抑制血管内皮细胞的增殖。     

熊果苷拮抗H2O2损伤的研究

目的通过体外细胞学实验观察熊果苷拮抗H2O2的作用.方法体外培养人脐静脉内皮细胞ECV-304,将细胞分为对照组、损伤组和熊果苷组,熊果苷组提前12h加入熊果苷,500μmol/L H2O2诱导细胞氧化应激状态.光镜实验比较各组细胞形态学的变化;MTT实验比较各组细胞增殖活力的改变.结果光镜下可见,对照组细胞结构清晰,呈单层铺路石状紧密排列;损伤组细胞变形、皱缩、排列紊乱、脱落明显,胞浆内出现空泡;熊果苷组细胞形态结构基本清晰,但细胞有轻度肿胀,其它接近于正常对照组;MTT结果显示,与损伤组相比,熊果苷能明显保护ECV-304细胞增殖活力(P<0.05).结论本实验结果提示,熊果苷可以抵御H2O2所致ECV-304细胞氧化应激损伤.     

夹竹桃麻素对兔原代左心房肌细胞氧化应激损伤的保护作用

目的利用低浓度过氧化氢（H2O2）建立兔原代左心房肌细胞氧化损伤模型,研究夹竹桃麻素对心房肌细胞氧化损伤的影响。方法将18只新西兰白兔随机分为对照组、H2O2组和夹竹桃麻素组,分别进行左心房肌原代培养。H2O2组直接在培养好的原代心房肌细胞中加入终浓度为100μmol/L的H2O2培养2h;夹竹桃麻素组以100μg/ml浓度的夹竹桃麻素处理细胞1h,之后加入终浓度为100μmol/L的H2O2共同培养2h。检测氧化和抗氧化指标的变化。结果与对照组比较,H2O2组和夹竹桃麻素组的SOD活力及GSH含量显著减少（P〈0.05）,MDA含量和细胞内钙浓度,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亚基p22phox表达均显著升高增加（P〈0.05）,H2O2组的线粒体mRNA表达增加。与H2O2组比较,夹竹桃麻素组SOD活力及GSH含量显著增加（P〈0.05）,MDA含量和细胞内钙浓度、NADPH氧化酶亚基p22phox和线粒体mRNA表达显著降低（P〈0.05）。结论夹竹桃麻素能够通过抑制NADPH氧化酶,对心房肌细胞的氧化损伤起保护作用。     

alphastatin抑制体外内皮细胞血管生成及其作用机制的实验研究

目的探讨人纤维蛋白原α链末端的24个氨基酸片断alphastatin对人脐静脉来源内皮细胞(ECV304)血管生成抑制作用及机理。方法体外培养ECV304细胞,分别测定alphastatin对其迁移、增殖和体外管状结构形成的作用。用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)定性检测ECV304细胞中鞘氨醇激酶(SPK)mRNA的表达。分别以10、100、1000nmol/Lalphastatin处理ECV304细胞,提取细胞蛋白质,通过三磷酸腺苷(ATP)检测细胞SPK酶活性。结果不同浓度alphastatin处理组中ECV304细胞迁移的数目,分别为(103±4)个、(75±3)个、(13±1)个,低于对照组的(131±4)个,均P<0·05。alphastatin浓度为100nmol/L、1000nmol/L时,形成管状结构的面积分别为(1509±30)μm2/视野和(1301±20)μm2/视野,也明显低于对照组的(2996±31)μm2/视野,均P<0·05。alphastatin对ECV304细胞增殖的影响差异无统计学意义。RT-PCR证实ECV304细胞SPKmRNA的表达。与对照组比较,alphastatin降低ECV304细胞内1-磷酸鞘氨醇(S1P)生成量,当其浓度为100nmol/L,作用时间为12h时,效应最明显。结论体外实验证实alphastatin具有明显抑制ECV304细胞血管生成的作用,这种效应与降低细胞SPK活性、减少S1P的生成有密切关系。     

过表达CREB减轻内皮细胞氧化应激损伤

目的 探讨过表达CAMP反应元件结合蛋白(CREB)在内皮细胞氧化损伤中的作用. 方法 建立H2O2诱导的血管内皮细胞损伤模型,将内皮细胞ECV304分为对照组、H2O2组、转染PCI空载体组、转染PCI空载体+ H2O2组、转染PCI-CRESAP组和转染PCI-CREB+H2O2组,采用MTT法检测细胞存活率,硫代巴比妥酸检测丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性. 结果 转染CREB+ H2O2组的细胞存活率和SOD活性明显高于H2O2组(P＜0.05),而转染CREB+ H2O2组的MDA含量明显低于H2O2组(P＜0.05). 结论 过表达CREB对H2O2诱导的内皮细胞氧化损伤具有保护作用.     

蜕皮甾酮对H2O2诱导的PC12细胞毒的保护作用

目的观察蜕皮甾酮(ecdysterone,ECR)对H2O2作用不同时间诱导PC12毒的保护作用。方法通过MTT(3-4,5-d im ethylth iazolyl-2,5-d iphenyltetrazolium brom ide,MTT)法检测H2O2对PC12的毒性及ECR的保护作用。PC12细胞的形态学改变通过荧光显微镜观察(acrid ine orange/eth id ium brom ide染色,AO/EB),完整无损的PC12细胞呈绿色,受损或死亡细胞呈橘黄色和红色。结果1、25、50和100μmol.L-1ECR与PC12细胞分别作用6h,12hand 24h时,PC12细胞的MTT吸光值无明显改变;50、100、200μmol.L-1H2O2分别与PC12作用6h,12h,24h时,PC12细胞的MTT吸光值明显降低(P<0.05,P<0.01 andP<0.01);如果用不同浓度的ECR(1、25、50 and100μmol.L-1)预处理PC12细胞0.5 h后,再加入H2O2(100μmol.L-1)并分别作用6h,12h,24h,则PC12细胞的MTT吸光值相对增加(P<0.05 at 50μmol.L-1,P<0.01 at 100μmol.L-1)。AO/EB染色后荧光显微镜下观察,ECR对H2O2引起的PC12细胞损伤有保护作用。结论ECR能够相对增加PC12细胞的存活率,对H2O2的PC12细胞毒性有保护作用。     

过氧化氢诱导HUVECs氧化应激模型的构建

目的 利用过氧化氢 (H2O2) 诱导人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 构建体外氧化应激细胞模型.方法 H2O2分6个浓度梯度处理HUVECs不同时间, 倒置显微镜观察细胞形态变化, CCK-8法检测细胞存活率, 流式细胞术检测细胞凋亡率, DCFH-DA荧光探针和流式细胞仪检测细胞内活性氧水平, 筛选H2O2的最佳作用浓度和时间.结果 不同浓度H2O2处理细胞不同时间, 对HUVECs均有损伤作用;400、600、800μmol/L H2O2处理HUVECs 24 h, 细胞存活率显著降低 (P<0.05) , 800μmol/L H2O2作用HUVECs不同时间, 细胞存活率随处理时间延长逐渐降低 (P<0.01) ;各组H2O2处理HUVECs 24 h, 细胞凋亡率显著增加 (1 000μmol/L除外, P<0.05) , 坏死率亦显著增加 (100μmol/L除外, P<0.05) ;800μmol/L H2O2处理HUVECs不同时间, 细胞凋亡率随处理时间延长逐渐增加, 24 h时达到最高 (P<0.05) , 细胞坏死率亦逐渐增加, 48 h时达到最高 (P<0.05) ;各组H2O2作用HUVECs 24 h, 浓度400μmol/L时, 细胞内ROS水平达到最高 (P<0.01) , 800μmol/L H2O2处理HUVECs, 胞内ROS水平随处理时间延长而递增 (P<0.01) .结论800μmol/L H2O2与HUVECs作用24 h可构建体外细胞氧化应激模型.