α1肾上腺素能受体阻滞剂降低肝硬化门脉高压的实验研究

目的探究α₁肾上腺素能受体(α₁AR)阻滞剂在降低肝硬化门脉高压中的作用。方法采用随机数字表法将50只小鼠分成5组,肝硬化小鼠造模采用四氯化碳(CCl₄)造模法,α₁AR阻滞剂选用多沙唑嗪。分为5组:橄榄油组;CCl₄组;CCl₄+多沙唑嗪2.5 mg/(kg·d)组;CCl₄+多沙唑嗪5 mg/(kg·d)组;CCl₄+多沙唑嗪10 mg/(kg·d)组。干预结束后,进行门静脉压力测定,并进行统计学分析。结果α₁AR阻滞剂(多沙唑嗪)可降低肝硬化小鼠的死亡率。与橄榄油组相比,其他4组小鼠的门静脉压力均有明显增高(P均<0.05)。与CCl₄组相比,CCl₄+多沙唑嗪2.5 mg/(kg·d)组及CCl₄+多沙唑嗪5 mg/(kg·d)组的小鼠门静脉压力水平均有降低,但差异均无统计学意义。与CCl₄组相比,CCl₄+多沙唑嗪10 mg/(kg·d)组的小鼠门静脉压力水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论α₁AR阻滞剂(多沙唑嗪)可抑制肝硬化小鼠门静脉压力升高,降低肝硬化小鼠的死亡率,可能为肝硬化门脉高压的治疗提供新思路。     

肝X受体激动剂对人THP-1细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1和肝X受体α、β亚型表达的影响

目的研究肝X受体激动剂3β-羟基-5α,6α-环氧胆烷酸甲酯和进口肝X受体激动剂激动剂T-0901317对THP-1细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1、肝X受体激动剂a和肝X受体激动剂β亚型mRNA表达的影响.方法应用逆转录-聚合酶链反应检测3β-羟基-5α,6a-环氧胆烷酸甲酯和T-0901317作用前后THP-1细胞源性巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体Al、肝X受体激动剂α和肝X受体激动剂β的mRNA表达,免疫组织化学检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白水平的表达.结果3β-羟基-5α,6α-环氧胆烷酸甲酯和T-0901317均能显著上调THP-1细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体Al和肝X受体激动剂α的mRNA表达(P＜0.01),并呈时间和剂量依赖性;在对肝X受体激动剂β表达的影响方面,低浓度的T-0901317能明显上调肝X受体激动剂β的表达,而3β-羟基-5α,6α-环氧胆烷酸甲酯只有在较高浓度时(10μmol/L)才表现出上调肝X受体激动剂β表达的作用(P＜0.05).结论3β-羟基-5α,6α-环氧胆烷酸甲酯以激动肝X受体激动剂α为主,并与T-0901317一样,可上调THP-1细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1和肝X受体激动剂α的表达.     

丙型肝炎病毒核心蛋白下调沉默信息调节因子1导致肝窦内皮细胞功能障碍

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝窦内皮细胞(LSEC)沉默信息调节因子1(SIRT1)表达及LSEC功能的影响。方法 HepG2细胞或表达HCV核心蛋白的HepG2细胞与LSEC共培养。应用液体闪烁计数仪、实时荧光定量-PCR(RT-PCR)、Western印迹检测LSEC SIRT1活性、mRNA和蛋白的表达,以及LSEC脂联素受体2(AdipoR2)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、第Ⅷ相关抗原(Von Willebrand factor,vWf)、分化抗原簇31(CD31)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和CD14蛋白的表达。应用流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,检测共培养上清液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、脂联素、一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)的水平。计量资料采用t检验。结果与LSEC和HepG2细胞共培养组相比,LSEC和表达HCV核心蛋白HepG2细胞共培养组SIRT1活性(0.3±0.1比1.0±0.3,t=5.422,P0.01)、mRNA(0.4±0.1比1.0±0.2,t=6.573,P0.01)和蛋白(0.3±0.08比1.0±0.3,t=5.613,P0.01)水平下降;脂联素[(3.41±0.61)比(5.82±0.87)μg/mL,t=5.556,P0.01]分泌减少且AdipoR2蛋白(0.3±0.1比0.8±0.2,t=5.477,P0.01)表达下降;eNOS蛋白(0.4±0.1比0.9±0.3,t=3.873,P0.01)表达下降;vWf蛋白(0.8±0.3比0.4±0.1,t=3.098,P0.01)、CD31蛋白(0.9±0.2比0.3±0.1,t=6.573,P0.01)、VEGF蛋白(0.9±0.3比0.5±0.1,t=3.873,P0.01)表达增加;CD14蛋白(0.4±0.1比0.9±0.3,t=3.873,P0.01)表达下降。共培养上清液中NO和SOD水平下降,ET-1和MDA水平升高。结论 HCV核心蛋白下调SIRT1活性及表达,下调脂联素及受体表达,引起LSEC收缩和肝窦毛细血管化,增加氧化应激反应,导致肝窦微循环障碍。     

α1肾上腺素受体阻滞剂降低大鼠门静脉高压的实验研究

目的观察α1肾上腺素受体(α1AR)阻滞剂能否降低和拮抗α1AR激活导致的大鼠门静脉高压, 为临床治疗门静脉高压提供新思路。方法α1AR激动剂选用去氧肾上腺素, α1AR阻滞剂选用阿呋唑嗪, 采用门静脉穿刺注射给药并测量门静脉压力。将32只雄性Sprague-Dawley大鼠按随机数字表法分为4组。所有大鼠均在给药前测量基础门静脉压力;对照组大鼠按体重经门静脉注射0.9%氯化钠溶液(1 L/g), 门静脉高压模型组大鼠经门静脉注射去氧肾上腺素(1.5 μg/g), 以上两组在给药5和10 min后分别测量门静脉压力;阿呋唑嗪治疗组大鼠经门静脉予去氧肾上腺素(1.5 μg/g)5 min后测压, 再予阿呋唑嗪(0.9 μg/g), 在5 min后再次测压;阿呋唑嗪预防组大鼠经门静脉给予阿呋唑嗪(0.9 μg/g)预处理1 min后测压, 再予去氧肾上腺素(1.5 μg/g), 在1、5和10 min后测压。采用单因素方差分析、Dunnett-t检验进行统计学分析。结果对照组、门静脉高压模型组、阿呋唑嗪治疗组和阿呋唑嗪预防组分别有4、6、8、5只大鼠门静脉穿刺成功。门静脉高压模型组大鼠给药...     

基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝方抗肝纤维化的作用机制

目的基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝方抗肝纤维化的作用及机制。方法将16只Wistar雄性大鼠分为抗纤软肝方组和对照组,每组各8只。抗纤软肝方组生药40 g/kg大鼠体质量灌胃,对照组用生理盐水给大鼠灌胃。将抗纤软肝方制备成含药血清与对照血清分别处理原代肝窦内皮细胞模型。采用Western-Blot检测血管内皮标志物分化抗原簇31(CD31)和血管性血友病因子(vWF)的蛋白表达水平;采用免疫细胞化学的方法检测细胞中CD31、vWF的细胞因子表达水平。扫描电镜检测肝窦内皮细胞窗孔的变化。计量资料两组间比较采用t检验。结果抗纤软肝方对肝窦内皮细胞形态学无明显影响。对照组肝窦内皮细胞窗孔狭小,结构将近闭塞,数量较少;抗纤软肝方组肝窦内皮细胞窗孔结构清晰,窗孔增多增大,明显可见。免疫细胞化学测定结果显示:与对照组比较,抗纤软肝方组CD31和vWF表达水平显著降低(CD31:0. 069±0. 015 vs 0. 115±0. 011,t=4. 257,P 0. 05;vWF:0. 092±0. 009 vs 0. 132±0. 014,t=4. 274,P 0. 05)。Western-Blot检测结果显示:与对照组相比,经抗纤软肝方组治疗后CD31、vWF的蛋白水平显著下降(CD31:0. 334±0. 029 vs 0. 448±0. 013,t=6. 245,P 0. 01; vWF:0. 560±0. 047 vs 0. 709±0. 045,t=3. 966,P 0. 05)。结论抗纤软肝方可明显抗肝窦毛细血管化,可以通过抗肝窦毛细血管化阻止肝纤维化的进程。     

苯肾上腺素对低氧肺损伤大鼠肺泡液体清除的作用

目的探讨α肾上腺素能受体激动剂苯肾上腺素对低氧肺损伤大鼠肺泡液体清除率(AFC)的作用及机制。方法低氧大鼠暴露于10%的氧浓度,分别于24 h和48 h测定AFC、总肺水量(TLW)。苯肾上腺素分别与α1受体阻滞剂哌唑嗪、α2受体阻滞剂育亨宾、β1受体阻滞剂阿替洛尔、β2受体阻滞剂ICI-118551、钠通道阻断剂氨氯吡咪及Na+-K+-ATP酶阻断剂哇巴因混合后灌注到低氧48 h大鼠的肺泡腔内,测定AFC的变化。结果大鼠暴露于10%的氧浓度24 h后AFC(17.09±2.36)%/h与正常大鼠AFC(16.85±2.87)%/h比较没有明显变化;48 h时AFC(8.41±2.67)%/h明显降低。苯肾上腺素能明显增加低氧大鼠AFC。苯肾上腺素增加低氧大鼠AFC的作用能够被哌唑嗪、阿替洛尔、ICI-118551、氨氯吡咪和哇巴因抑制。结论α肾上腺素能受体激动剂苯肾上腺素通过调节Na+-K+-ATP酶及钠通道的活性增加低氧肺损伤大鼠肺泡液体清除能力,促进肺水肿液的吸收。     

四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝窦毛细血管化的形成

目的：观察四氯化碳（CCl4）诱导的大鼠肝纤维化过程中肝窦毛细血管化的形成过程,探讨其与肝纤维化的关系。方法32只清洁级雄性SD大鼠,随机分为正常对照组,肝纤维化模型组,正常对照组大鼠腹腔注射0．9％氯化钠溶液2 mL/kg ,模型组大鼠腹腔注射50％ CCl4-蓖麻油混合液2 mL/kg ,每周2次,共8周;分别于造模第2、4、6、8周处死大鼠,观察肝组织炎症及纤维化程度,放射免疫法检测血清中透明质酸（HA）的含量,透射电镜观察肝窦窦壁结构,S-P 免疫组织化学检测各组大鼠肝组织CD31、层黏连蛋白（LN）、IV型胶原（Col-IV）的表达。结果肝脏组织学证实CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型构建成功,6周可见纤维间隔形成;透射电镜显示,CCl4诱导2周时,部分肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells ,LSEC）窗孔减少,内皮下未见基底膜（Basement membrane,BM）,随着造模的进程,LSEC 窗孔进一步减少,部分甚至消失,第6、8周时局部肝窦内皮下形成连续的BM。同时,随着肝纤维化的进程,HA浓度逐渐升高,肝窦内皮细胞表面标志物CD31及基底膜主要成分Col-IV、LN表达逐渐增强。结论在CCl4诱导大鼠肝纤维化过程中,肝窦毛细血管化是逐渐形成的,LSEC失窗孔早于纤维间隔的形成,而肝窦内皮下基底膜出现在纤维间隔形成以后。     

NF-κB、TGF-β1在肝纤维化中的改变及护肝片的影响

目的探讨中、晚期纤维化大鼠肝组织核转录因子-κB(NF-κB)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)的变化及护肝片对其影响。方法采用12.5%CCl₄诱导的大鼠肝纤维化模型,自造模之日起,大鼠分组灌胃给药(护肝片921 mg·kg^-1)或溶媒,每日1次,直至8或13周末,分别处死动物,取左叶肝组织石蜡包埋,制作组织芯片,免疫组化S-P法检测大鼠肝组织NF-κB p65、TGF-β₁蛋白的表达,并用MetaMorph图像分析系统对NF-κB p65、TGF-β₁蛋白表达量进行定量分析。结果(1)模型复制8和13周,模型组的肝损伤及其纤维化分级均明显高于正常组(P＜0.01),护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组。(2)模型复制8和13周,模型组NF-κB p65、TGF-β₁蛋白的表达较正常组明显增强(P＜0.01);NF-κB p65蛋白和TGF-β₁蛋白的表达之间呈显著的正相关(P＜0.01);(3)护肝片显著抑制8、13周纤维化肝组织NF-κB p65、TGF-β₁蛋白的表达(P＜0.01)。结论护肝片可减轻肝组织的损伤及其纤维化程度,抑制NF-κB、TGF-β₁的表达可能是其抗肝纤维化作用的靶点之一。     

去甲肾上腺素对大鼠肝星状细胞作用的实验研究

目的 探讨交感神经系统在肝纤维化发生和发展中的作用. 方法采用免疫荧光和RT-PCR检测体外培养的肝星状细胞(HSC)中α1、β2-肾上腺素能受体的表达;用四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度的去甲肾上腺素(NE)对HSC增殖活性的影响.同时用RT-PCR检测受NE作用后HSC的活化指标胶原蛋白-1、转化生长因子β(TGF β)及α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达.用高效液相色谱-电化学法测定活化的HSC中交感神经递质NE的水平. 结果α1和β2-肾上腺素能受体表达于HSC的胞膜和胞质内;NE可呈剂量依赖性地促进HSC增殖,在浓度为100μmol/L时达到最大效应,F=140.464,P<0.05,差异有统计学意义.以NE 100 μmol/L作用细胞24h后,可显著促进反应HSC活化的指标上升,胶原蛋白-1表达为0.3022±0.0610,TGF β表达为2.2080±0.2151,α-SMA mRNA表达为0.5469±0.0108,与对照组胶原蛋白-1(0.1040±0.0556)、TGF β(1.1190±0.0070)、α-SMA mRNA表达(0.0759±0.0449)比较,t值分别为-4.160、-8.763和-17.651,P值均<0.05,差异均有统计学意义.HSC可以合成并释放NE,且受血小板衍生生长因子(10ng/ml)刺激后HSC中NE含量为(14.24±0.21)ng/ml,对照组为(11.34±0.15)ng/ml,两组比较,t=-32.907,P<0.05,差异有统计意义.结论 抑制交感神经系统使HSC活性降低对临床上治疗肝纤维化有一定的指导意义.     

多房棘球蚴感染诱导肝窦内皮细胞发生毛细血管化的动态研究

目的 观察泡型棘球蚴病发展过程中肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)毛细血管化现象及与肝纤维化的关系,为探索LSEC在泡型棘球蚴病所致肝损伤和肝纤维化发生和转归中的作用机制奠定基础。方法 取40只C57BL/6小鼠(6～8周龄),随机分为对照组和感染1、2、4周组,每组各10只。感染1、2、4周组每只小鼠经肝脏直视穿刺注射接种2 000个多房棘球蚴原头节,对照组用相同方法注射等量磷酸盐缓冲液。在感染后1、2、4周,取小鼠肝脏,经苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色后观察肝脏病理变化,经Masson三色染色后对染色阳性区域面积进行半定量分析以判断肝纤维化程度,采用免疫组织化学染色法评价α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白α1(collagen typeⅠalpha 1,COL1A1)表达水平以判断肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积,用扫描电子显微镜观察LS...     

肝孤核受体激动剂对间充质干细胞的抗缺氧复氧损伤作用及机制

目的探讨肝孤核受体(LXR)激动剂对脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)缺氧损伤的保护作用及可能机制。方法酶消化法分离稳定表达萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的小鼠AD-MSCs,流式细胞术检测CD90、CD44、CD34、CD45细胞表面标记物。3代AD-MSCs分为7组:对照组;缺氧6 h/复氧2 h组(缺氧复氧组);缺氧/复氧+DMSO组(DMSO组);缺氧复氧+不同浓度LXR激动剂T0901317干预组(1μmol/L组、5μmol/L组、10μmol/L组、15μmol/L组)。运用Fluc报告基因生物发光成像技术对AD-MSCs细胞增殖进行定量评价,免疫印迹法检测细胞NF-κB表达水平,ELISA法检测AD-MSCs的白细胞介素6(IL-6)、TNF-α分泌水平。结果流式细胞术结果显示.AD-MSCs呈CD44(+)、CD90(+)、CD34(-)、CD45(-)。光学成像结果显示,AD-MSCs细胞数与Fluc平均生物发光信号强度呈正相关(r~2=0.97)。与对照组比较,缺氧复氧组AD-MSCs分泌TNF-α、IL-6、NF-κB明显升高;与缺氧复氧组比较,10μmol/L组AD-MSCs分泌TNF-α、IL-6、NF-κB明显减少(P<0.05,P<0.01)。结论 LXR激动剂可以促进缺氧复氧损伤后AD-MSCs的存活,并能通过NF-κB信号途径抑制炎性因子IL-6、TNF-α的释放,可为干细胞移植治疗心肌缺血再灌注损伤提供新的细胞保护方法。     

CCl4诱导的肝纤维化小鼠和HSC-T6细胞miR-122水平变化及其意义探讨*

目的 研究微小RNA(miR)-122在肝星状细胞活化/增殖及肝纤维化发生过程中的水平变化及其可能的作用机制。方法 建立CCl₄诱导的C57BL/6小鼠肝纤维化模型,以10 ng/ml转化生长因子-β1(TGF-β1)处理HSC-T6细胞,分别在小鼠体内和肝星状细胞转染miR-122 激动剂和miR-122模拟物以过表达miR-122。采用RT-PCR和Western-blot法检测组织和细胞miR-122、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原、金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)和血小板衍生生长因子(PDGF)表达,采用CCK-8法检测HSC-T6细胞增殖。结果 模型组小鼠肝组织α-SMA表达水平显著高于对照组(9.92±2.12对1.12±0.54,P＜0.01),而miR-122水平显著低于对照组(0.95±0.31对2.07±0.28,P＜0.01);在CCl₄诱导的肝纤维化小鼠,miR-122激动剂转染组肝组织miR-122水平显著高于miR-122激动剂对照组(6.27±1.73对2.78±0.21,P ＜ 0.01);miR-122 激动剂转染组肝组织α-SMA、I型胶原、TIMP-1和PDGF蛋白水平显著下降;在TGF-β1处理的HST-T6细胞,随着处理时间的延长,肝星状细胞α-SMA水平逐渐升高(0h:0.61±0.02,12 h:0.69±0.05, 24 h:0.75±0.01,48 h:1.01±0.03,P＜0.05),而miR-122水平随TGF-β1处理时间的延长而逐渐下降(0 h:0.72±0.05,12 h:0.45±0.01, 24 h:0.37±0.03,48 h:0.29±0.08, P＜0.05);与miR-122 阴性对照转染组比,miR-122模拟物转染组细胞miR-122水平显著增加(178.45±30.62对12.18±2.39,P ＜0.01);Western Blot检测发现miR-122模拟物转染组细胞α-SMA蛋白表达水平显著下调;采用TGF-β1处理HST-T6细胞,与miR-122 阴性对照转染组比,miR-122 模拟物转染组细胞增殖活力显著降低(P＜0.05)。结论 肝纤维化组织细胞miR-122水平下调,而过表达miR-122可抑制肝星状细胞的活化和增殖,从而可能抑制肝纤维化的发生和发展。     

Cathepsin L调节ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质蓄积

目的探讨非诺贝特对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导3T3-L1成熟脂肪细胞中炎症相关蛋白CD40L/CD40表达的影响及其是否通过Sirt1-NF-κB途径调控TNF-α诱导的3T3-L1脂肪细胞炎症反应。方法 3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化成为成熟脂肪细胞后,免疫荧光检测Sirt1及CD40L/CD40的表达定位。TNF-α刺激细胞以及加入非诺贝特、Sirt1特异性激动剂和抑制剂和NF-κB信号通路阻断剂后,采用免疫印迹法检测细胞内Sirt1、CD40和NF-κB蛋白表达水平,采用RT-Q-PCR检测Sirt1和CD40 mRNA表达水平。结果油红O染色结果表明成功建立诱导分化体系。Sirt1在3T3-L1成熟脂肪中有表达且主要定位于细胞核。免疫荧光和逆转录PCR结果表明,3T3-L1成熟脂肪细胞表达CD40且主要定位于细胞膜上,但不表达CD40L。非诺贝特剂量依赖性下调TNF-α(10μg/L)诱导的成熟脂肪细胞中CD40蛋白和mRNA的表达,上调TNF-α诱导的成熟脂肪细胞中Sirt1蛋白和mRNA的表达。Sirt1特异性激动剂白藜芦醇增强非诺贝特对TNF-α诱导的成熟脂肪细胞中CD40蛋白和mRNA...     

交感神经递质及其受体在小鼠血吸虫肝纤维化中的作用

目的 研究交感神经递质及其受体在正常小鼠及血吸虫病肝纤维化小鼠体内的变化情况.方法 应用腹部敷贴尾蚴法制备血吸虫病小鼠模型.30只昆明小鼠随机分为正常对照组和肝纤维化模型组.采用HE和Van Gieson染色,光镜观察肝组织病理学改变及纤维化程度,免疫荧光组织化学染色结合激光共聚焦扫描检测肝组织中α1A、β2肾上腺素能受体表达情况,同时用高效液相色谱-电化学法检测血浆中去甲肾上腺素和多巴胺的水平. 结果 正常组α1A、β2肾上腺素能受体散在表达于肝细胞胞质和肝窦内,模型组在门静脉和虫卵结节周围肝细胞胞质中阳性表达明显增加(α1A受体的平均灰度值分别为18.28±7.56、30.53±8.88,β2受体的平均灰度值分别为28.67±6.42、42.29±4.56,t值分别为-2.888和-6.648,P值均＜0.05);血吸虫肝纤维化小鼠和正常小鼠去甲肾上腺素含量分别为(7.83±4.36)、(2.72±0.94)ng/ml,多巴胺的含量分别为(6.97±4.33)、(0.74±0.34)ng/ml,t值分别为-3.372和-4.428,P值均＜0.05.结论 交感神经递质及其受体表达的上调可能是血吸虫肝纤维化发展的作用机制之一.     

NHE-1与肝星状细胞增殖的关系及姜黄素对其的影响

目的:研究NHE-1与肝星状细胞增殖的关系及姜黄素对其的影响, 初步探讨肝纤维化的形成机制.方法:选择肝星状细胞系作为体外研究对象,用不同浓度(1、10、20 μmol/L)的姜黄素处理大鼠肝星状细胞; 以MTT比色法测定肝星状细胞的增殖; 酶联免疫吸附法(ELISA)测定Ⅰ型胶原含量, RT-PCR法检测肝星状细胞Na+/H-泵(NHE-1 mRNA)的表达.结果:各浓度姜黄素可明显下调肝星状细胞NHE-1 mRNA表达(0.6401±0.0063, 0.2391±0.0039, 0.1437±0.0044 vs 0.7214±0.0155,P <0.05), 降低培养上清液中Ⅰ型胶原的水平(199.40±16.22, 182.37±14.72, 169.91±15.80 ng/mg pro vs 216.35±17.19 ng/mg pro,P <0.05), 抑制肝星状细胞的增殖, 并呈剂量依赖性.结论:姜黄素可能通过调控肝星状细胞NHE-1mRNA的表达来抑制HSC的增殖及Ⅰ型胶原的合成等机制, 从而抑制肝纤维化的形成.     

泡球蚴蛋白通过Wnt/β-Catenin信号通路调控小鼠肝星状细胞二肽基肽酶-4的表达研究

目的 探讨泡球蚴蛋白对肝星状细胞中纤维化关键基因二肽基肽酶-4(Dipeptidyl Peptidase 4,DPP4)表达的调控机制。方法 免疫组织化学法检测二肽基肽酶-4在泡型棘球蚴病患者肝脏病灶近端与远端的表达情况。体外培养小鼠肝星状细胞系JS1,以60μg/mL浓度的泡球蚴蛋白(Echinococcus multilocularis Protein, EmP)刺激JS1细胞,检测细胞活化及Wnt通路的激活情况,Wnt通路抑制剂(IWP-2)和激动剂(LY2090314)靶向干预检测肝星状细胞活化标志物COL1A1、α-SMA与PPARγ,Wnt通路关键分子Wnt5a、β-catenin、GSK3β以及DPP4的表达水平。结果 免疫组化检测结果显示泡型棘球蚴病患者肝脏病灶近端DPP4的表达(5927±987.1)显著高于病灶远端(2478±696.9),差异有统计学意义(t=9.026,P<0.05);EmP可显著促进JS1细胞活化并促进DPP4的表达,差异有统计学意义(F_DPP4=10.65,P<0.05);与对照组相比,EmP刺激组Wnt通路...     

肾小管缺氧损伤中肾损伤分子-1表达信号通路的调节

目的:观察肾损伤分子-1(KIM-1)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在人近端小管上皮细胞(HK-2)缺氧复氧过程中的表达及相互关系,探讨HIF-1α对KIM-1表达的调控作用及机制.方法:收集缺氧、缺氧复氧后不同时段培养的HK-2细胞,用RT-PCR和Western-Blot检测KIM-1及HIF-1α表达,同时观察HIF激动剂(CoCl2)及抑制剂(雷帕霉素)对KIM-1表达的影响;应用凝胶迁移实验(EMSA)和染色质免疫沉淀实验(ChIP)验证KIM-1启动子区和HIF-1结合情况.结果:HK-2细胞缺氧复氧过程中KIM-1和HIF-1在mRNA水平和蛋白水平表达相关,HIF-1激动剂CoCl2或抑制剂雷帕霉素可上调或下调KIM-1表达,并呈剂量依赖性;EMSA表明HIF-1α可以和KIM-1启动子区HRE结合位点为模板所设计的双链寡核苷酸探针特异性结合,而且这种特异性结合受HIF-1α调节,同时ChIP实验证实了KIM-1启动子区和HIF-1α的结合.结论:KIM-1在近端肾小管上皮细胞缺氧损伤时的表达受HIF-1α调控,KIM-1可能作为HIF-1的下游分子参与肾损伤及修复过程.     

机械牵张力和氧化型低密度脂蛋白协同激活大鼠血管平滑肌细胞LOX-1受体-ERK1/2信号通路

目的为证实α1-肾上腺素能受体(α1-AR)是否介导了机械牵张力和/或去甲肾上腺素(NE)对小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的协同激活并加速血管重构。方法静息培养的小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)经有或无Prazosin(α1-AR抑制剂)预处理后,给予机械牵张力和/或NE刺激,Western Blotting检测ERK1/2的磷酸化水平,免疫荧光检测ki-67的表达(细胞增殖),RT-PCR检测细胞α1-AR亚型(α1A-,α1B-和α1D-AR)mRNA的表达。分别用三种亚型的α1-AR-siRNA预处理细胞,观察α1-AR各亚型基因沉默对机械牵张力诱导的VSMC ERK1/2磷酸化的影响。结果机械牵张力可分别上调α1B-和α1D-AR mRNA表达,但α1A-AR mRNA未检测到。机械牵张力和/或NE均可激活ERK1/2,引起ERK1/2磷酸化增加,而两种因素共同存在时ERK1/2激活更加明显;ki-67的表达呈现类似效应;这种由机械牵张力和/或NE激活的作用均可被Prazosin部分抑制。α1B-和α1D-AR-siRNA预处理可分别减少α1B-和α1D-AR ...     

急性冠状动脉综合征患者外周血CD4+T细胞及CD28null/CD28+亚型活化后Kv1.3钾通道的表达和意义

目的 研究急性冠状动脉综合征(ACS)患者外周血中CD4+T细胞及CD28null/CD28+亚型活化前后Kv1.3钾通道数目的 变化以及Kv1.3钾通道阻滞剂对CD4+T细胞活化表达的影响,探讨Kv1.3钾通道在不稳定斑块中的意义.方法 用免疫磁珠法分离出27例ACS患者外周血中的CD4+T细胞,其中12例进一步分出亚型CD4+CD28null和CD4+CD28+T细胞,采用全细胞膜片钳技术记录细胞活化前及经CD3抗体活化72 h后的Kv1.3钾电流.CD4+T细胞活化时分别加入终浓度为0.1、1、10 nmol/L特异性Kv1.3钾通道阻滞剂rMargatoxin(rMgTX),共同培养72 h后用反转录-PER法检测干扰素-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α及颗粒酶B mRNA的表达.结果 活化后CD4+、CD4+CD28null、CD4+CD28+T细胞的Kv1.3钾通道的峰电流均明显增加,细胞平均通道数分别增加约90%、60%、80%[活化前后每个细胞的通道数分别为(402±88)个比(752±275)个、(553±328)个比(874±400)个、(392±133)个比(716±251)个,均P<0.05].活化前CD4+CD28nullT细胞Kv1.3钾通道的平均数目比CD4+CD28+T细胞多约40%(P<0.05),活化后两者差异无统计学意义(P=0.102).不同浓度的rMgTX均下调CD4+T细胞活化后干扰素-γ、TNF-α、颗粒酶B mRNA的表达,各浓度组间干扰素-γ、TNF-α、颗粒酶B mRNA的表达差异均有统计学意义(均P<0.01),浓度越高,各mRNA表达越低.结论 ACS患者外周血CD4+T细胞及CD28null/CD28+亚型活化后Kv1.3钾通道表达增加,特异性Kv1.3通道阻滞剂rMgTX呈浓度依赖性地抑制CD4+T细胞活化时干扰素-γ、TNF-α及颗粒酶B mRNA的表达,提示CD4+T细胞特别是CD4+CD28nullT细胞的Kv1.3钾通道可作为预防动脉粥样斑块不稳定的潜在治疗靶点.     

细胞生长因子体外对大鼠肝干细胞的影响

目的 研究大鼠肝干细胞系WB-F344细胞在体外地生长分化与多种细胞因子的关系。方法 用^3H掺入法检测细胞因子对WB-F344细胞生长增殖作用。用western blot检测WB-F344细胞因子受体的表达。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 发现肝细胞生长因子（HGF）80ng/mlcpm值为982.95，表皮生长因子（EGF）80ng/ml cpm值为906.32，胰岛素80ng/ml cpm值为968.67，成纤维细胞生长因子（FGFα）80ng/ml cpm值为863.98。促进WB-F344细胞的增殖；白细胞介素-6（IL-6）80ng/ml cpm值为368.67，肿瘤坏死因子α80ng/ml cpm值为372.90对WB-F344细胞的生长无明显影响；而转化生长因子（TGFβ）能够诱导WB-F344细胞凋亡（80ng/ml凋亡率为26.89%)并抑制其生长；western blot检测发现WB-F344细胞表面存在HGF，EGF，FGFα，TGFβ等细胞因子受体，提示细胞因子可能通过与其受体结合方式调控WB-F344细胞的生长分化，进一步用HGF，EGF，胰岛素等细胞因子组成并添加地塞米松的分化培养体系，在体外对WB-F344细胞进行定向诱导分化。发现WB-F344细胞在体外能够向肝实质细胞分化，此外HGF还具有刺激肝干细胞离散作用。结论 肝干细胞的生长分化受多种细胞因子的调控。细胞生长因子可能在严重肝损伤后肝干细胞的动员，增殖及分化调控中起重要作用。