石蜡包埋表皮组织中β-连环蛋白基因扩增技术的建立

目的：建立从石蜡包埋表皮组织中提取DNA，进行β-连环蛋白基因3号外显子聚合酶链反应(PCR)扩增的方法。方法：从14例不同重量、不同年代石蜡包埋皮肤鲍温氏病病变组织中提取DNA，再进行β-连环蛋白基因3号外显子PCR扩增。结果：5mg组织提取DNA的PCR扩增未获成功，而用10mg和20mg组织提取的DNA可成功扩增；已包埋10年以上的5例标本仅2例成功扩增，而9例10年以内的标本全部成功。结论：10mg及10mg以上且10年以内的石蜡包埋表皮组织可用于目标基因PCR扩增。     

石蜡包埋表皮组织中β-连环蛋白基因扩增技术的建立

目的∶建立从石蜡包埋表皮组织中提取DNA ,进行 β 连环蛋白基因 3号外显子聚合酶链反应 (PCR)扩增的方法。方法∶从 14例不同重量、不同年代石蜡包埋皮肤鲍温氏病病变组织中提取DNA ,再进行 β 连环蛋白基因 3号外显子PCR扩增。结果∶5mg组织提取DNA的PCR扩增未获成功 ,而用 10mg和 2 0mg组织提取的DNA可成功扩增 ;已包埋 10年以上的 5例标本仅 2例成功扩增 ,而 9例 10年以内的标本全部成功。结论 :10mg及 10mg以上且 10年以内的石蜡包埋表皮组织可用于目标基因PCR扩增。     

rDNA⁃ITS序列分析鉴定皮肤癣菌的应用评价

目的：探讨对核糖体RNA（ribosomal RNA,rDNA）内转录间隔区（internal transcribed space,ITS）的基因扩增测序技术在皮肤癣菌鉴定中的应用价值。方法：从39株临床收集的皮肤癣菌临床标本和经培养后的标本中分别提取DNA,应用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增和基因测序,测序结果在NCBI的基因库中查询,通过BLAST工具比对分析进行rDNA?ITS序列分析分子鉴定。同时根据形态特征、生长特性以及生理生化指标对经培养后的标本进行表型鉴定,并与分子鉴定结果相比较。结果：两组标本均成功扩增到ITS靶基因,经测序分析,临床标本和经培养后标本rDNA?ITS序列分析结果一致,与表型鉴定结果相吻合。结论：直接从临床标本中提取致病菌DNA并进行ITS基因序列扩增和测序分析可快速、有效鉴定皮肤癣菌。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

散发性甲状旁腺癌一例分子遗传学分析

目的 通过对一例散发性甲状旁腺癌患者的临床特点、病理特点、基因突变分析研究和免疫组化分析研究,初步探讨散发性甲状旁腺癌的发病机制.方法 收集患者临床资料、病理标本及外周血,提取外周血和石蜡包埋组织标本的DNA,PCR扩增HRPT2基因的17个外显子及其与内含子的边界,测序确定HRPT2基因的突变位点,应用免疫组化的方法检测该基因编码的蛋白表达.结果 患者临床表现、内分泌功能检查及病理特点均符合甲状旁腺癌,以其血液和肿瘤组织基因组DNA为模板的PCR产物测序发现,患者携带-HRPT2基因杂合性胚系突变,其HRPT2基因第222位密码子从CGA变成TGA终止密码子,导致其编码的蛋白成为一个只包含221个氨基酸的截短蛋白.免疫组化结果示HRPT2编码的蛋白(parafibromin)表达完全缺失.结论 HRPT2基凶突变导致其编码的蛋白不能正常表达,为散发性甲状旁腺癌发病的分子机制之一.     

石蜡包埋组织快速DNA提取方法在诊断病理PCR分析中的应用研究

目的 改良石蜡组织DNA快速提取方法的流程,评价其提取效率,探讨其应用于病理诊断PCR分析的可行性.方法 选取包括淋巴瘤及反应性病变的52例存档蜡块,以缓冲液煮沸方法快速提取DNA,并以传统酚-氯仿抽提法和试剂盒提取法作为对照,采用PCR反应扩增看家基因β-Globin以确定模板DNA质量,并通过测序确定结果的可靠性;同时根据临床病理诊断选择性的进行免疫球蛋白重链基因(IgH)或T细胞受体γ基因(TCRγ)重排检测.结果 快速法提取DNA的浓度虽低于对照方法,但β-Globin扩增效率与对照方法相比差异没有统计学意义(P＞0.05),对IgH和TCRγ重排的检出率与对照相比差异亦没有统计学意义(P均＞0.05).测序结果显示扩增片段与目的基因序列完全符合.DNA可在-20 ℃保存至少4周.结论 快速DNA提取法可以从存档的石蜡包埋组织中提供足量的PCR反应模板,结果稳定可靠,且省时省力,在病理诊断PCR分析中具有应用价值.     

PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中突变的研究

目的探讨PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中突变的关系。方法选取200例乳腺癌患者组织标本,其中luminal A、luminal B、HER-2过表达型、besal-like型各50例。提取DNA,用紫外光分光光度仪来测定浓度及含量,对exon9及exon20进行PCR扩增,扩增产物纯化后测序,另取20例乳腺腺病组织标本用作为对照,与基因库序列对比分析其突变的情况。结果200例乳腺癌组织中发现突变64例,突变率32％,其中exon9突变26例（40％）,exon20突变38例（60％）,在乳腺癌分子亚型中：luminal A型中22例（44％）,luminalB型中16例（32％）,HER-2过表达型20例（40％）,besal—like型6例（12％）,突变分布有统计学意义（P〈0．05）。在20例良性对照组中均没发现突变。PIK3CA基因突变与乳腺癌肿瘤患者肿瘤大小、年龄、淋巴结状态之间无明显相关性（P〉0．05）。结论PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中的突变有差异,与乳腺癌其他临床病理特征之间无明显相关性。     

p15基因缺失分析在食管癌研究中的意义

目的：探讨p15基因在食管癌中的表达以及与食管癌临床病理及预后的关系。方法：应用酚：氯仿法提取46例食管癌患者的肿瘤及癌旁正常组织中高分子量的基因组DNA，并对p15基因外显子1和2进行PCR扩增，以1．5％琼脂糖凝胶电泳及溴化乙烷染色，分析PCR产物中p15基因的纯合性缺失。结果：正常食管粘膜组织中未见p15基因的纯合性缺失。食管癌肿瘤组织中，p15基因的纯合性缺失率为63．04％(29／46)，且与食管癌的临床病理分级及DNA含量有关。结论：p15基因的纯合性缺失在食管癌发生、发展中起重要作用，可作为肿瘤标志物判断食管癌患者的预后。     

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的 以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排，探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法 盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA，TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增，检测降落式PCR的灵敏度。结果 琼脂糖电泳中，18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性。阳性标本经SSCP进一步分析，呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1％以上时可得到阳性扩增结果。结论 TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排，可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。     

石蜡包埋胃镜组织幽门螺杆菌菌体DNA探索性研究

目的探讨从石蜡包埋胃镜组织中提取幽门螺杆菌菌体DNA的方法和策略。方法选取2008年5月~2010年5月中国医科大学263例胃癌术后石蜡包埋标本及2011年6月~2014年6月医学院附属中心医院和沈阳医学院附属第二医院206例幽门螺杆菌阳性石蜡包埋标本,利用试剂盒提取菌体DNA、PCR扩增,对扩增的结果进行统计分析。结果 263例胃癌大体标本中,231例检测出随意选取基因片段,阳性率为87.83%;206例胃镜标本中,194例检测出幽门螺杆菌cag A基因,阳性率为89.81%。胃大体标本和胃镜标本DNA提取阳性率之间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论从石蜡包埋胃镜组织中提取幽门螺杆菌菌体DNA是高效可行的。     

多重二次PCR在微量DNA标本检验中的应用

目的：探讨用多重二次PCR扩增极微量DNA标本供后续SSCP和DNA测序分析。方法：对照组取微量组织提取的DNA为模板，分别用不同的4对引物各自行PCR，同一PCR反应体系里加入4对引物扩增。然后将此扩增产物稀释1000倍为模板，再以相同引物进行第二次PCR。实验组：取微量组织提取的DNA为模板，以与对照组相同的4对引物各自进行PCR。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，用DNA测序方法检验二次PCR扩增产物的特异性。结果：微量的DNA标本可同时被多对引物二次扩增。实验组与对照组比较，各自引物扩增的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳显示区带速率相同，测序显示碱基序列相同。结论：因极微量的DNA模板不能满足多引物多次PCR时，可用多重二次PCR扩增，本方法在法医学、考古和组织活检等方面将有广阔的用途。     

hTERT片段真核表达质粒的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法：从肿瘤组织中提取总RNA．采用RT—PCR法扩增hTERT基因并克隆人PGEM—T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3．1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定。结果：PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98．73％,氨基酸序列的同源性为99．68％。结论：成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

大鼠心肌组织中细胞间粘附分子-1基因部分CDS克隆

目的：克隆大鼠心肌组织中细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因。方法：采用RT—PCR法,从大鼠缺血性损伤的心肌组织mRNA中扩增出ICAM—1基因部分CDS区片段,克隆人T载体,筛选阳性克隆,酶切鉴定,最后测序鉴定。结果：经RT—PCR法扩增出的特异性产物与预期扩增的片段长度110bp相符,DNA测序结果与GenBank提供的已知序列比较,所克隆的ICAM-1基因片段与目的扩增的序列完全相同,与ICAM-1基因100％同源。结论：采用RT—PCR和T载体技术获得了大鼠心肌组织中ICAM-1基因克隆。     

石蜡组织DNA提取方法的比较

目的 :选择一种高效、简便、稳定的从蜡块中提取基因组DNA进行聚合酶链反应 (PCR)扩增的方法。　方法 :分别采用四种不同的方法从石蜡组织中提取DNA ,比较所提取的DNA质量 ,PCR扩增cyclinD1基因的效率。对其中的一种方法进行了改良。　结果 :四种方法提取的DNA质量都能达到相关分子生物学实验的要求 ,但在操作程序、扩增效率等方面存在差异。　结论 :微波脱蜡法操作简单、快速、扩增成功率高 ,适合于应用PCR技术对病理标本进行相关研究。     

石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善

目的：建立和完善石蜡组织RNA提取的方法。方法：收集临床病理诊断用石蜡包埋组织块共100例，经RNA灭活处理后，进行组织切片、脱蜡、清洗、消化等一系列提取前预处理，用TRIZOL试剂提取组织的RNA，并在-20℃长时间沉淀RNA。对提取的RNA以核酸测定仪检测RNA的浓度和纯度，并通过RT—PCR检查提取RNA的β-actin基因，以检测提取RNA的质量。结果：100例石蜡包埋组织中提取的RNA经过核酸测定仪测定后，浓度在20～50mmol／L，260nm及280nm光密度比在1．75～2．0；经过RT—PCR反应，提取的RNA都能扩增出190bp的pactin目的片段。结论：通过RNA提取前对材料的一系列合理处理，从福尔马林固定、石蜡包埋档案组织材料中提取小片段RNA进行目的基因mRNA检测，可以成为一种稳定成熟的方法应用于临床病理诊断。     

ARMS 法在检测肺癌晚期患者肿瘤组织和血浆表皮生长因子受体基因突变中的应用

目的：应用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（ ARMS－PCR）检测晚期肺癌患者血清游离DNA和肿瘤组织中表皮生长因子受体（ EGFR）基因突变,探索两者间的一致性。方法同时收集53例未经治疗的肺癌Ⅲb～Ⅳ期患者的原发灶肿瘤组织和外周血,分别提取DNA,采用ARMS－PCR扩增EGFR基因的第18、19、20和21外显子突变,对结果不一致的标本用微滴式数字PCR法对外周血标本进行验证。结果血浆EGFR基因突变检测的灵敏度为51.4％（17／33）,特异度为100％;血浆EGFR基因的突变率为29.4％;16例血浆和组织结果不一致的标本,数字PCR检测的结果与血浆游离DNA检测的结果一致。结论血浆游离DNA为监测Ⅲb～Ⅳ期肺癌患者原发肿瘤中EGFR基因突变提供了新的来源, ARMS法是检测血浆游离DNA中EGFR基因突变的可靠有效方法。     

活检组织结核杆菌NA检测在临床病理应用的探讨

目的：探讨活检标本石蜡组织中结核分枝杆菌DNA检测在临床病理诊断与鉴别诊断中的价值。方法：采用PCR杂交梳法及抗酸染色法检测本院90例病理组织学改变不典型的可疑活检标本。结果：PCR杂交梳法检测可疑组织中结核杆菌DNA阳性率23．33％（21／90）；抗酸染色阳性率10％（9／90），两有显差异（P＜0．05）。PCR杂交梳检测阳性病例经随访证实临床抗结核治疗后均有好转。结论：临床活检标本石蜡组织中结核分枝杆菌DNA检测具有特异性强，敏感性高，操作简便省时的特点，有助于组织学改变不典型病例的病理诊断与鉴别诊断，具有重要临床意义和应用价值。     

胃癌组织中SOX4基因的突变分析

目的研究胃癌中SOX4基因的碱基及其编码的氨基酸突变情况，探讨其在胃癌发生中的作用。方法提取胃癌肿瘤及癌旁组织的DNA，PCR扩增胃癌SOX4基因的HMG—box框，并对其进行PCR—SSCP分析，对有差异的样本进行DNA测序。将测序结果用ClustalX软件与正常的HMG—box框序列比对，用DNAStar软件将HMG—box框碱基序列转化成氨基酸序列，再用ClustalX软件与正常的氨基酸序列比对。结果经序列测定发现在27例胃癌样本中有12例出现点突变，而在癌旁组织中没有发现突变，晚期胃癌的突变率明显高于早期胃癌。结论SOX4基因突变可能与胃癌的发展和转移有相关性。本研究为探索SOX4基因突变与人类肿瘤发生之间的关系提供了分子资料。     

天麻总DNA提取及聚合酶链反应扩增鉴定

目的：改良常用的植物DNA提取的CTAB，SDS法，以有效去除天麻多糖类杂质。方法：用CTAB法提取天麻鲜品不同部位（块茎、花序轴和胚芽）DNA；用生理盐水浸泡天麻干品之后，在应用CTAB，SDS法提取天麻干品的DNA；通过已知序列的天麻抗真菌蛋白基因片段的聚合酶链反应（PCR）扩增和PCR产物测序鉴定天麻DNA及其质量。结果：提取了44份天麻样本DNA，用CTAB法提取天麻鲜品不同部位的DNA，成功地用于PCR扩增，并通过DNA测序进一步鉴定；应用改良的CTAB，SDS法提取天麻干品DNA可用于PCR扩增，但DNA测序未成功。结论：用CTAB法提取的天麻鲜品各个部位DNA均可用于基因分析，而用天麻胚芽提取DNA的效果最理想；改良CTAB法能有效提取天麻干品DNA。提取的DNA可用于基因扩增。     

人MAGE-12基因的克隆与序列分析

目的克隆人MAGE-12基因并测序。方法从人肺癌组织中提取mRNA,用RT—PCR从中扩增出MAGE-12基因片段,对其进行PvuⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM—Teasy载体中,转化JM109菌;进行蓝白筛选后,运用pGEM Teasy质粒的TT／SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果PCR扩增得到944bp的基因片段,经PvuⅡ酶切初步证实为MAGE-12基因;阳性克隆经筛选鉴定连接有目的基因;目的基因测序结果与GenBank比较,结果完全相同,表明靶基因成功插入pGEM—Teasy。结论成功克隆MAGE-12基因,为MAGE-12用于肿瘤的生物治疗做出准备工作。