人源性rhG-CSF单链抗体基因的克隆和表达

从构建的噬菌体表面展示文库中，筛选出全新的人源抗重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）特异单链抗体（ScFv）的噬菌体克隆。ScFv被克隆到pCANTAB 5E载体上，以E. coli TG1为宿主，进行噬菌体表面呈现，以rhG-CSF为靶抗原进行免疫亲和富集筛选，经酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定，得到一株高亲和力克隆。DNA序列分析表明，该ScFv基因全长733 bp，其中重链可变区（VH）为366 bp，轻链可变区（VL）为322 bp。抗rhG-CSF的ScFv在E. coli HB2151中以可溶形式分泌表达，产物主要分布于周质中，占周质总蛋白的质量分数为20%～25%，经免疫印迹试验（Western-blot）分析显示该单链抗体黏均分子量为31 kD。     

LC-1 ScFv偶联GFP基因的构建及表达

从具有高效蛋白表达及活力的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株（LC-1）抽提总RNA，反转录成cDNA。根据肿瘤单链抗体（ScFv）基因设计引物，用多聚酶链式反应（PCR）克隆出抗体的重链和轻链基因，并通过重叠延伸PCR法将重链基因与修饰后的轻链基因连接为单链抗体基因。改造后的ScFv与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建表达质粒ProGFP-ScFv，随后转化大肠杆菌JM109，用诱导剂IPTG进行诱导表达。表达产物采用Ni-NTA树脂进行纯化，进行SDS-PAGE电泳分析其纯度。酶联免疫检测（ELISA）表明该蛋白已具有抗体活性。395 nm激光激发显示绿色荧光，表明目的基因在原核生物中存在表达。     

对抗BCMA单链抗体体外亲和力成熟关键位点的模拟

为提高人源化的抗B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)单链抗体(scFv)的亲和力,本研究通过计算机模拟初步探索其体外亲和力成熟的关键位点.首先利用ELISA检测噬菌体表面展示的抗BCMA的亲本单链抗体的结合活性,再通过同源模建搭建抗原-抗体复合三维结构,分析抗原-抗体间的相互作用,保留其互作界面处的关键残基,以增加其相互作用为目标而设计突变体,并利用重叠延伸PCR对scFv进行定点突变以构建突变体质粒,最后通过ELISA初步检测突变体的结合活性.结果显示:噬菌体表面展示的抗BCMA的亲本scFv具有结合抗原BCMA的活性,抗原-抗体间的非键相互作用主要为氢键和疏水相互作用,为增加抗原-抗体静电相互作用而设计了3株突变体,但根据ELISA检测结果显示静电相互作用并不是决定scFv和BCMA结合的关键因素,通过创造额外的静电作用,未能明显提高scFv的亲和力.通过计算机模拟构建了抗原-抗体复合物结构模型,确定了其亲和力成熟中应保留的关键位点,并发现静电作用并不是决定scFv与抗原亲和力的关键作用,推测氢键或其他作用力可能对亲和力的提高作用更大,为后续通过引入氢键等其他设计以提高抗体亲和力奠定了基础.     

人APOBEC3G基因克隆、表达、纯化及多克隆抗体制备

为了获得人APOBEC3G蛋白及其多克隆抗体,从H9细胞中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得人APOBEC3G基因.将测序鉴定过的APOBEC3G基因克隆到原核表达载体pET-32a上,以包涵体的形式在E.coli BL21(DE3)中高效表达,由于APOBEC3G蛋白C端融合了6×His标签,有助于对蛋白的纯化及鉴定.应用酶切技术、SDS-PAGE及Western Blot等方法确保基因片段的正确性和蛋白的特异性.纯化后的APOBEC3G蛋白用来免疫日本大耳白兔,用间接ELISA法测定兔多克隆抗体滴度,获得了纯度超过80%的APOBEC3G融合蛋白,抗APOBEC3G多克隆抗体滴度高达1:102 400.     

抗PD-L1CAR基因的构建及CAR-T的功能活性研究

鉴于嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)疗法应用于肿瘤治疗的临床试验已取得很大突破,设计了程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1)特异性CAR-T细胞以体外杀伤肺癌细胞。通过克隆表达PD-L1_((73-739)),并纯化PD-L1蛋白以免疫BALB/c小鼠制备获得PD-L1单克隆抗体;克隆PD-L1单克隆抗体单链可变区片段,与CD28、4-1BB、CD3-ζ链的基因体外融合构建第三代CAR基因,并克隆于慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-copGFP上,包装成慢病毒。该慢病毒感染CD~(8+)T细胞,扩增5d,测定CAR的表达,表达率可达到22%以上。PD-L1靶向的肿瘤细胞杀伤作用分析显示,抗PD-L1CAR-T细胞有一定的体外杀伤活性。     

HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

对构建HPV16 E6基因的原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6进行研究.从宫颈癌细胞株CaSki细胞中提取的的DNA基因组为模板,设计一对特异性引物,用PCR法扩增出HPV16E6基因片段.HPV16E6基因片段和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后用T4 DNA连接酶连接.构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6转化大肠杆菌DH5α,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21 Star-DE3 Plyss中,构建了HPV16 E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16E6.HPV16E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6的构建为HPV16 E6重组蛋白的制备和为宫颈组织HPV16型感染的早期诊断和相关治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

从噬菌体展示随机肽库中定量筛选人血清白蛋白黏附肽

人血清白蛋白作为长效化载体蛋白可用于改善蛋白质药物的半衰期。除了以人血清白蛋白融合方式提高蛋白质药物的半衰期,黏附人血清白蛋白也已成为改善蛋白质药物药代动力学特性的策略。本研究以人血清白蛋白为靶分子,利用噬菌体表面展示技术对随机七肽库进行生物淘选,挑取噬菌体单克隆进行特异性鉴定。经4轮生物淘选后回收率和选择比都有了一定提高,使用滴度检测方法对所挑选的噬菌体阳性克隆进行了相对亲和力的测定,并经过DNA测序得到了4个特异性黏附肽HSA-1、HSA-5、HSA-6和HSA-10的序列。将此类多肽插入到蛋白质药物上,将有助于提高蛋白质药物在血清中的半衰期,从而达到长效目的。     

利用GST融合多肽制备人源膜受体多抗的研究

膜受体是一类膜蛋白,而全长的膜蛋白很难通过基因工程获得,这给制备该类蛋白的抗体增加了难度。为了探索一条制备膜受体多克隆抗体的新途径,通过基因重组技术,将膜受体的抗原决定簇与GST标签进行融合表达,然后免疫新西兰兔,获得了相应的多克隆抗体。结果表明,利用融合GST的多肽进行抗体制备的方法是可行的。     

苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备研究

研究制备抗苏丹红Ⅰ的多克隆抗体.采用混合酸酐法合成免疫抗原苏丹红Ⅰ明胶,按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备抗苏丹红Ⅰ多克隆抗体.采用酶联免疫吸附法鉴定抗血清中抗苏丹红Ⅰ多克隆抗体效价.结果表明,苏丹红Ⅰ抗体的效价为1:8 000,可用于苏丹红Ⅰ的免疫学检测.     

环境中甾体激素降解菌的筛选及功能基因的克隆

利用生物技术解决环境中日益增长的甾体类激素污染的环境问题,寻找相关的菌及其关键基因就非常重要。本研究利用含1.6-4.1%NaCl的SIN培养基从大连海港附近所取海水样中筛选能够降解并利用甾体激素作为唯一碳源和能源的微生物。ELISA检测3-羟基类固醇脱氢酶/羰基还原酶(3-HSD/CR)活性。利用PCR技术克隆3,17-羟基类固醇脱氢酶基因,ELISA技术检测该基因的活性。结果表明筛选到的微生物为一种革兰氏阴性菌,命名为H5-1,具有3-HSD/CR活性,对PCR克隆的3,17-羟基类固醇脱氢酶基因经测序比对同源性为99%,ELISA检测初步证实了该基因的活性。该基因的成功克隆为后期转入受体细胞进行目的蛋白的表达、酶活性鉴定及构建甾体激素降解工程菌株等工作奠定基础。     

二代噬菌体展示淘选PD-1结合肽及其模拟位点分析

阻断PD-1/PD-L1相互作用可以激活肿瘤浸润性T细胞并恢复其抗肿瘤活性,对于恶性肿瘤具有较好的治疗作用。尽管靶向PD-1/PD-L1通路的抗体药物对癌症有一定的疗效,但现有抗体药物存在生产成本高、个体差异大、引发不恰当的免疫反应等问题,而且还伴随着不可避免的缺陷,如器官或肿瘤渗透性差、口服生物利用度差等,因此迫切需要寻求多肽抑制剂等来弥补当前PD-1/PD-L1相互作用抗体阻断剂的缺点。该文以重组人PD-1蛋白为靶标,首次采用二代噬菌体展示技术淘选Ph.D.-7和Ph.D.-12噬菌体展示文库,获得了400条潜在的PD-1结合肽同时基于BLOSUM62打分矩阵对PD-1结合肽数据集进行了聚类分析。最后,对PD-1结合肽数据集进行了氨基酸组成、基于位置的氨基酸偏好性分析以及模拟位点分析。该文获得的PD-1结合肽有望开发成阻断PD-1/PD-L1相互作用的候选多肽药物,研究结果对于PD-1结合肽的计算设计有一定的指导意义。     

重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出的Taq DNA聚合酶由于其热稳定性，在聚合酶链式反应(PCR)中得到广泛的应用，我们根据编码Taq DNA聚合酶的基因序列，设计出一对引物，通过PCR扩增出Taq DNA聚合酶基因，并将其克隆到表达载体pET-15b中，转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中实现了大量表达。经过热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA聚合酶。本研究的生产程序可作为Taq DNA聚合酶生产的一种新方法。     

T C-1-HPV16 L1细胞模型与动物模型的建立与评价

为了解决人乳头瘤病毒16型L1蛋白(HPV16L1)为主要靶点的疫苗缺乏肿瘤模型细胞来验证疫苗的免疫效果的问题,构建了一个细胞模型并可以利用此细胞在实验动物体内形成肿瘤,用于以HPV16L1为主要靶点疫苗的验证实验。利用这个模型细胞或肿瘤模型可以在体内外检测疫苗的免疫学性质和保护功效。首先,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法获得目标基因HPV16L1的基因序列并连接到载体质粒中,将质粒转染到细胞TC-1后在杀稻瘟菌素抗性压力筛选下获得稳定表达HPV16L1的细胞株。对TC-1和TC-1-HPV16L1两种细胞的生长增殖和成瘤特性进行比较发现,外源基因的加入对细胞特性没有影响。通过体外杀伤实验证实细胞TC-1-HPV16L1能够被HPV16L1靶点疫苗免疫过的小鼠脾淋巴细胞杀伤。实验动物被疫苗免疫后,进行攻瘤实验发现疫苗只对TC-1-HPV16L1组具有保护作用。综上,在本研究中成功地构建了可以检测HPV16L1疫苗的抑瘤效果的模型细胞TC-1-HPV16L1,为HPV疫苗的研究提供了一个模型细胞。     

生孢噬纤维菌CMcase基因的分离与表达

从生孢噬纤维菌中分离完整的基因组DNA,经过PstI限制性内切酶部分酶切后,在T4DNA连接酶作用下,将酶切的片段连接到载体pUC18的PstI位点中,然后转化到E.coli DH5α中,构建了基因组文库,经过筛选获得4.2x103个重组子。经过刚果红平板筛选获得了含有CMCase基因片段的重组子,在E.coli中进行表达,E.coli在37℃培养25~30h,培养液中CMCase活力达到22.8U/mL。     

蚕豆中黄曲霉毒素B_1提取方法的研究

主要探讨了高效液相色谱法快速检测蚕豆中黄曲霉素B1的提取条件;分别考察了在不同超声波提取时间、不同超声波提取功率下、不同浓度的甲醇对黄曲霉素B1分离检测效果的影响;并用响应面设计探讨了不同条件的交互作用;找出了最佳工艺参数的范围：甲醇浓度为49.90%～50.35%,提取时间为6.09～6.22 min,超声波提取功率为95.2%～97.1%。可为黄曲霉素B1的检测提供简便、准确、可靠、重复性好的分析方法。     

PD-1抗体表达载体的构建以及其功能的探究

通过构建含PD-1抗体基因的重组腺病毒表达载体Ad35-anti-PD-1,表达的PD-1抗体以探究其对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗肿瘤功能的影响。用ELISA实验检测Ad35-anti-PD-1在293细胞中PD-1抗体的表达量;利用Protein G亲和层析法纯化PD-1抗体;通过体外杀伤实验研究PD-1抗体阻断PD-1信号通路的CTL杀伤肝癌细胞能力的变化。显示成功构建重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1,滴度为1×1010 pfu/mL;ELISA实验检测在72h时293细胞上清中PD-1抗体的表达量约在600ng/mL;Westernblotting实验证明PD-1抗体包含正确的重链（50kD）和轻链（25kD）;ELISA实验检测从100mL细胞上清中得到1mL浓度在40μg/mL的PD-1抗体;体外杀伤实验证明CTL在添加PD-1抗体的环境中杀伤肝癌细胞的能力显著增强。     

牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆

根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX 4T 1中,将pGEX 4T 1/bovIFN γ转化到大肠杆菌中DH5α中。     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

Mechanical Properties Amelioration of Hybrid Composites by Concomitant Synergy Between Graphene Oxide and Silica Nanoparticles

氧化石墨烯和二氧化硅纳米颗粒协同作用下的

复合材料力学性能改善

Anchalee Duongthipthewa, 杨树明*,王一鸣

（西安交通大学 机械制造系统工程国家重点实验室,西安 710049）

创新点说明：

本文提出将氧化石墨烯和纳米二氧化硅颗粒组成的纳米复合材料作为填充物添加到环氧树脂/碳纤维复合材料体系中,用于提升其机械性能和湿润环境下的抗腐蚀性。

研究目的：

通过实验研究了氧化石墨烯和纳米二氧化硅颗粒组成的纳米复合材料作为填充物对环氧树脂/碳纤维复合材料体系的机械性能增强作用,以及在湿润环境下的抗腐蚀性。

研究方法：

本文通过真空辅助树脂传递模塑（VARTM）方法制备了环氧树脂/碳纤维复合材料样品,同时也通过该方法向复合材料体系中添加了不同分量的氧化石墨烯和纳米二氧化硅颗粒组成的纳米复合填料;通过三点弯曲测试、冲击实验、硬度测试和动态力学分析等方法对所制备样品的弯曲强度、冲击强度、硬度等机械性能进行了测量;通过分别在纯水和盐水中浸泡2周,对样品的吸湿性、烘干后的重量保留和性能保留进行了分析测试。

结果：

实验结果表明,对于添加了氧化石墨烯和纳米二氧化硅颗粒组成的纳米复合材料作为填充物的环氧树脂/碳纤维复合材料体系,其机械性能表现出全面的明显提升,包括弯曲强度、冲击强度、硬度等;纳米二氧化硅分量的提高还会使其性能得到进一步提升;对于含有复合纳米填充物的样品,其暴露在湿润环境中时虽然吸湿度较高,但烘干后重量损失反而较小,而且再次对其机械性能进行测试后发现其性能保留程度也较高;同样的,含有高分量纳米二氧化硅的样品性能表现最优。为探究其增强原理,通过扫描电子显微镜对样品断面进行了分析。

结论：

实验结果显示,复合填充物的存在使整个复合材料体系的机械强度得到提升,其根本原因在于复合填充材料的存在使环氧树脂与碳纤维骨架的结合更加紧密,在收到外力作用时应力得以迅速传递避免累积,扫描电子显微镜的结果也支持该结论。

关键词：复合材料,纳米填充,机械性能,热分析,吸湿性

     

薄层扫描法定量测定黄曲霉毒素B_1

样品中黄曲霉毒素B_1经提取、浓缩,簿层分离后,在簿层扫描仪上进行扫描,依其含量及峰面积值与标样含量及峰面积值的线性关系,即可准确计算出样品中黄曲霉毒素B_1的含量.本文通过一系列的条件试验,找到了簿层扫描法测定黄曲霉毒素B_1的最佳测定条件;摸索了一些用薄层扫描法测定粮 油、食品、饲料中黄曲霉毒素B_1的方法