HBV与HCV融合DNA疫苗的构建及其体液免疫应答

目的 构建含乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原基因（S区基因）与丙型肝炎病毒（HCV）核心抗原基因（C区基因）的嵌合真核表达载体,观察preS1和preS2基因对HBV表面抗原及HCV核心抗原体液免疫的影响。方法 用PCR方法,分别扩增HBV S区基因和HCV C区基因。将S区基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,酶切鉴定后,大量提取质粒并免疫Balb/c小鼠,用ELISA法检测抗HBs和抗HCV抗体。结果 成功地扩增出目的基因片段,克隆后酶切鉴定结果正确,序列分析与文献报告相一致。免疫后检测到抗HBs和抗HCV抗体。preS1与preS2基因对构建的融合DNA疫苗的体液免疫应答有一定的抑制作用。抗HBs抗体的产生低于只含S基因的真核表达载体;preS1基因对抗HCV抗体的产生具有抑制作用,而preS2无影响。结论 不同长度的HBV S区基因可影响抗HBs和抗HCV抗体的产生。     

乙型肝炎病毒preS1与肿瘤坏死因子融合肽基因的克隆和表达

为提高hTNFα和HBVpreS1(1～65)肽融合蛋白在大肠杆菌中的表达率,以及研究hTNFα和preS1(1～65)肽之间的联接肽段对hTNFα的影响,并引进蛋白酶切位点以利于融合蛋白中酶切制备preS1(1～65)肽,本文构建了5种含有两类不同基因接头和preS15′端经改造的hTNFα和HBVpreS1(1～65)肽的融合基因。然后分别将其插入表达载体pSB92中,并获得表达。SDSPAGE显示,不同结构的融合基因的表达水平不同,表达水平最高的pTPS5表达量达菌体总蛋白的60%。该表达产物经Westernblot验证,能分别特异地与抗hTNFα抗体与抗preS1抗体结合。稀释复性后,该融合蛋白还具有hTNFα的生理功能(对L929细胞的细胞毒活性),为一具有双功能活性的新的融合蛋白。经DNA序列测定表明,preS1(165)肽基因正确地融合在hTNFα基因之后。     

汉坦病毒部分S基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的 构建并表达汉坦病毒(HV)Z10株(HV-Z10)S基因蛋白编码区前300 bp核苷酸序列,研究该基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其产物的生物活性.方法 根据HV-Z10 S基因前300 bp(S300)的核苷酸序列,按照编码氨基酸的密码子转换成酵母偏爱的形式,设计合成8条引物,通过连续PCR,获得人工合成Z10株S基因前300 bp的基因序列SP300,经测序,SP300与S300的核苷酸相似性为76.2%,但编码的氨基酸序列完全一致.将SP300克隆到酵母穿梭载体pPICZaA,构建含α-factor分沁信号肽的重组表达载体pPICZaA-SP300.将pPICZaA-SP300、pPICZaA-S300化学法转化酵母GS115菌株,筛选重组转化子.结果 重组了SP300与S300的酵母转化子经甲醇诱导,表达出重组蛋白rNP300及rN300,SDS-PAGE显示相对分子质量为12×10~3左右.经ELISA检测及Westem Blot分析,表达产物能与抗汉坦病毒抗体起免疫反应.结论 SP300和S300基因在毕赤酵母中获得分泌表达,使用酵母偏爱密码子的SP300基因在毕赤酵母中的表达量与S300的表达量基本一致,表达量在诱导24 h后最高.     

C3d对基因免疫诱导的HBV特异性体液免疫应答的调节作用

观察补体C3d对HBV基因免疫诱导的特异性体液免疫应答的调节作用 ,为增强HBV基因疫苗免疫效果寻求新途径。将HBV preS2 /S编码基因分别插入真核表达载体TR4 2 1和含有 3拷贝C3d编码基因的TR4 2 1 C3d3质粒 ,构建重组质粒TR4 2 1 preS2 /S和TR4 2 1 preS2 /S C3d3。采用肌肉注射法对BALB/c小鼠实施基因免疫 (10 0 μg/ 10 0 μl/只小鼠 ) ,以空质粒为对照 ,定期采集血清。ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗 HBs IgG及其亚型 ,并采用NaSCN竞争ELISA法检测其亲合力。结果表明 ,TR4 2 1 preS2 /S C3d3重组质粒免疫组诱导的特异性抗 HBs IgG水平明显高于TR4 2 1 preS2 /S重组质粒免疫组 (P <0 0 5 ) ;而且TR4 2 1 preS2 /S C3d3重组质粒免疫组诱导的抗 HBs IgG抗体的亲合力 (ED50 :1 375 )显著高于TR4 2 1 preS2 /S重组质粒组 (ED50 :0 875 ) ,但C3d并不改变基因免疫诱导的特异性抗HBs IgG各亚型水平的格局 ,仍以IgG2b和IgG2a为主。提示C3d可增强基因免疫诱导的HBV特异性体液免疫应答 ,并促进特异性抗体亲和力的成熟 ,这为提高HBV基因疫苗的免疫效果提供了新的途径。     

HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达

目的：研究GM-CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用。方法：采用PCR方法，扩增HBV preS2 S基因约846 bp的片段和rhGM-CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过T-A克隆技术和基因定向克隆，构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒HBV preS2S-rhGM-CSF成功地构建。将其转染HepG2细胞后，目的基因的转录通过RT-PCR得到证实，而且表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-preS2和抗-GM-CSF单克隆抗体(mAb)均产生特异性反应。结论：融合基因表达载体pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙肝DNA疫苗奠定了实验基础。     

C3d-P28增强乙型肝炎病毒特异性基因免疫效果的研究

目的　观察补体C3d P2 8对基因免疫的调节作用及其不同拷贝数对调节作用的影响 ,为增强基因免疫效果寻求新方法。方法　PCR法获得补体C3d P2 8编码基因并以头尾串连方式将1～ 4拷贝C3d P2 8编码基因克隆至pVAON33,构建pVAON33 P2 8.[1～ 4 ]重组质粒 ,然后将HBV preS2 S编码基因分别插入pVAON33和pVAON33 P2 8.[1～ 4 ]质粒获得pVAON33 S2 S和pVAON33 S2 S P2 8.[1～ 4 ]重组质粒。肌肉注射各重组质粒DNA(每只 10 0 μg 10 0 μl)初次免疫小鼠 ,并以pVAON33为对照 ;12周后皮下注射HBsAg蛋白加强免疫各组小鼠 ,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗 HBs IgG。结果　pVAON33 S2 S重组质粒免疫小鼠可诱导产生特异性抗 HBs IgG ,含不同拷贝C3d P2 8编码基因的重组质粒可诱导更高的特异性抗体 ,其中pVAON33 S2 S P2 8.4重组质粒诱导的抗体水平最高 (P <0 .0 1)。蛋白加强免疫后 ,含C3d P2 8编码基因重组质粒免疫组抗 HBs IgG迅速上升 ,并明显高于pVAON33 S2 S重组质粒免疫组 (P <0 .0 5 ) ,pVAON33 S2 S P2 8.4重组质粒诱导的抗体仍维持最高水平。结论　不同拷贝的C3d P2 8能不同程度地增强HBV preS2 S基因免疫诱导的特异性体液免疫及其蛋白加强后的回忆反应 ,其中 4拷贝C3d P2 8的增强作用较为显著。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒pVAX-S2S的构建及DNA免疫

目的为探索更安全的乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒,并观察其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫应答情况.方法采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出乙肝表面抗原中蛋白(preS2+S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,酶切鉴定,按不同剂量一次性肌内注射免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗-HBs.结果酶切鉴定重组质粒pVAX-S2S为正向插入的阳性克隆.HBVDNA疫苗(pVAX-S2S)高(100μg/只)、中(50μg/只)、低(10μg/只)三组剂量一次性免疫健康BALB/c小鼠,均能在2 w诱导抗-HBs产生,抗体效价随时间延长而增长.血清抗体水平比较,高剂量组(97.83±38.78)mU/ml较中剂量组(45.13±21.12)mU/ml、低剂量组(19.74±11.92)mU/ml差异均具显著性(P＜0.05),以后的4,8 w高、中剂量组间差别缩小,但两者较低剂量组差异均具显著性(P＜0.05)和非常显著性(P＜0.01).结论卡那霉素抗性的重组质粒pVAX-S2S能有效诱导正常小鼠产生体液免疫应答.     

构建分泌型HBsAg单链抗体在毕赤酵母菌中的表达研究

为了从巴氏毕赤酵母中获得分泌表达的非融合人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv ) ,设计引物从pGEM HBscFv上扩增HBscFv,亚克隆至P pastoris表达载体pPICZαA中 ,然后转化P pastorisGS115、KM71,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子 ,甲醇诱导目的蛋白表达并对其性质进行鉴定。结果发现 ,3%～ 5 %的转化子具有 2 0 0 0mg/LZeocin抗性 ;转化子诱导后 ,可以合成并分泌相对分子质量为 32 0 0 0的HBscFv ,表达量占酵母培养上清中总蛋白的 2 2 % ;酵母表达产物可被针对大肠杆菌来源HBscFv的单克隆抗体特异性识别 ,并具有结合HBsAg活性。     

HBV-preS2/S-C3d联合基因疫苗诱导的特异性免疫应答及其意义

目的：研究HBV—preS2／S—C3d联合基因疫苗诱导的特异性体液和细胞免疫应答及其意义。方法：CR2结合实验检测C3d融合蛋白的结合特性；分别用TR421、TR421-preS2／S和TR421—preS2／S—C3d3重组质粒免疫小鼠．ELISA法检测特异性抗HBs—IgG的亲合力，^3H-TdR掺入法检测其特异性淋巴细胞增殖活性（SI），半定量RT—PCR法检测IL-4、IFN-γ、T—bet和GATA-3基因表达的水平。结果：C3d融合蛋白可有效地结合CR2；TR421—preS2／S—C3d3质粒基因免疫诱导的抗HBs—IgG水平、亲合力以及SI均明显高于TR421-preS2／S组，并且前者诱导的IL-4、IFN-γ、T—bet和GATA-3基因表达水平也均高于后者。结论：C3d通过结合CR2、上调IL-4和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV特异性免疫应答。     

重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc对HBV preS2S DNA疫苗免疫作用的影响

目的 探讨IL-2/Fc融合表达后对HBVpreS2S基因疫苗诱导免疫反应的佐剂效应.方法 采用HBV preS2S DNA疫苗作为基础免疫,重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc作为佐剂加强免疫BALB/c小鼠,采用0、2、4周的方案接种,检测各次接种后抗体水平.初次免疫后7周,测定免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性和细胞因子的分泌水平.结果 pcDNA3.1IL-2/Fc作为佐剂在HBV preS2S注射3 d后免疫组小鼠抗体滴度、免疫脾细胞的杀伤活性和增殖活性、TH1型细胞因子的分泌水平,均比各对照组明显增强.结论 IL-2/Fc是有效的HBV preS2S DNA疫苗佐剂之一.     

人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的:构建人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext -Fc,并在毕赤酵母GS115中表达.方法:以pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc为模板PCR扩增人Delta-like1胞外段.通过DNA重组构建毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext.-Fc.用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE、Western blot分析表达蛋白.结果:hDll1基因的胞外段被有效地扩增.序列分析表明,所构建的含hDll1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,融合蛋白hDll1extFc得到正确表达.结论:成功地扩增了人Delta-likel胞外段,构建了hDll1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体PIC-hDll1extFc,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究奠定了实验基础.     

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

Secreted expression of dengue virus type 2 full-length envelope glycoprotein in Pichia pastoris

The full-length envelope glycoprotein gene of dengue virus type 2 was cloned using an RT-PCR method from the infected C6/36 cells and inserted into pPICZaB vector. The recombinant plasmid was integrated into Pichia pastoris by electroporation and the expressed product was identified by SDS-PAGE and Western blotting. High-level secreted expression was performed by determining the Mut(+) phenotype and screening multi-copy integrants in the recombinant yeast cells. A recombinant protein with a molecular size of approximately 69 kDa was secreted into the supernatant from the yeast cells when induced with methanol. The expressed supernatant was able to bind with mouse polyclonal antibody or E-specific monoclonal antibody of dengue-2 virus. Purified E-poly (His)-tagged fusion protein was obtained from the expressed product by passing through a metal-chelating affinity chromatographic (MCAC) column. The results of Western blotting and solid-phase ELISA using dengue virus antibodies indicated that the purified recombinant E glycoprotein retained its antigenicity. High-level production of the recombinant E protein up to 100 mg/l indicates that P. pastoris is an efficient expression system for dengue virus full-length envelope glycoprotein.     

中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

目的：将中国流行株B亚型HIV－1结构蛋白基因gag和gp120的巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。方法：以酵母分泌型表达质粒pPIC9为载体，构建含HIV－1 gag和gp120嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用Sac I将pPICGP线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115，用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE和Western blot进行分析，并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果：12个酵母转化子中共筛选到了8个阳性酵母转化子，其整合率为66．7％。SDS－PAGE和Western blot分析显示，在相对分子质量（Mr）为57000处有1条特异蛋白带，且能与抗p24单抗（mAb)和抗gp120mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代10次后，其外源基因未丢失。结论：在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV－1 gag-gp120嵌合基因，且表达蛋白具有特异性，但其Mr较预计计算的值要小，说明嵌合基因中的gp120基因只有部分进行了表达。     

汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7，然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连，电转化E.coli JM109，获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA，转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒，滴度可达10^13～10^15 PFU／L；该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后，表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗（mAb）所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

乙型肝炎病毒S基因密码子最佳化及在毕赤酵母中的高效表达

目的 制备适合酵母表达的乙型肝炎病毒S基因,在毕赤酵母中高效表达重组乙型肝炎病毒S蛋白.方法 选用酵母偏爱的同义密码子替换野生型S基因的酵母稀有密码子,采取基因搭桥法及递归式聚合酶链反应,制备合成基因,捕入酵母表达载体pPICZB.携带有合成S基因的重组质粒转化毕赤酵母菌株KM71 H,经甲醇诱导表达乙型肝炎病毒S蛋白.结果 酶切电泳及DNA测序证实合成的S基因正确克隆到表达载体中;聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示优化后的乙型肝炎病毒S基因在毕赤酵母中的重组蛋白表达量远高于野生型基因.结论 密码子优化的S基因能明显提高重组S蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量.     

庚型肝炎病毒(HGV)E2区cDNA的克隆与表达

目的　克隆ＨＧＶ Ｅ２ 基因并在原核细胞系统中表达ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白。方法　从ＨＧＶＲＮＡ 阳性血浆中抽提病毒ＲＮＡ,利用半巢式ＲＴＰＣＲ 法扩增ＨＧＶ Ｅ２ 基因片段并进行序列分析。然后将该片段克隆到ｐＧＥＸ５ｘ１ 表达载体上,进行诱导表达。表达产物用抗ＨＧＶ 阳性血浆作Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 活性鉴定。结果　获得ＨＧＶ Ｅ２ Ｎ 端长度为７７９ 个核苷酸的基因片段。该片段与美国株ＨＧＶ（Ｕ４４４０２） 、西非株ＧＢＶＣ（ Ｕ３６３８０） 、中国株ＨＧＶ（ Ｕ７５３５６） 的核苷酸序列同源性分别为８４ ％ 、８５ ％ 、９１ ％ ,推测的氨基酸序列同源性分别为８８ ％ 、９３ ％ 、９４ ％ 。表达产物为相对分子质量约５０ ×１０３的ＧＳＴＥ２ 融合蛋白,在细胞内形成包涵体。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 反应中在约５０ ×１０３ 处有显色条带。结论本研究成功地在原核细胞系统中表达了具有抗原性的ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白,为进一步研究ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白及Ｅ２ 抗体的生物学功能打下了基础。     

人IL-10基因的克隆表达及表达产物活性的初步鉴定

目的:构建含人IL-10全基因序列的原核表达载体,并进行表达及产物活性的鉴定。方法:利用RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2的总RNA中扩增IL-10的全长编码序列。编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体PET-28 a( ),构建IL-10基因的重组原核表达载体。在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western blot和ELISA进行鉴定。结果:表达产物主要位于包涵体内。经Western blot分析和ELISA检测显示,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期的结果相符,有结合抗体活性。结论:成功地扩增人IL-10全基因序列,并构建了含该基因序列的原核表达载体,在大肠杆菌中高效表达的表达产物具有抗原活性,为下一步制备抗IL-10的单克隆抗体(mAb)提供了必要的前提。     

跨膜区缺失的流感病毒M2蛋白表达纯化及其抗原性检测

目的 表达并纯化缺失跨膜区的流感病毒M2蛋白，并检测其抗原性。方法 利用RT．PCR方法从流感病毒A／PR／8／34（H1N1）的cDNA中扩增全长M2基因，利用两套引物扩增出缺失跨膜区26—43位氨基酸的sM2基因，并克隆到pET30a载体中表达融合蛋白，用镍柱纯化后的融合蛋白免疫小鼠获得抗血清，免疫荧光检测其抗原性。结果 sM2融合蛋白在大肠埃希菌中可高效表达，纯化后可获得高纯度的重组蛋白。免疫小鼠获得的血清进行免疫荧光检测，显示表达的融合蛋白有免疫原性。结论 跨膜区缺失的流感病毒M2融合蛋白与完整M2蛋白有相同的抗原性。