间日疟原虫红内期SSUrRNA基因片段的扩增、测序及诊断应用

目的：体外扩增间日疟原虫（深圳株）红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因（SSUrDNA）片段，克隆测序分析，并探讨其诊断应用。方法：设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应（PCR）从间日疟患血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段；用PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列；以SSUrDNA为靶基因，PCR诊断间日疟，双盲法检测40份血样（28份镜检阳性的血样，12份健康血）。结果：间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与SalI株顺序相比，仅在第151位处缺失1个碱基C；以SSUrDNA为靶基因，双盲法检测镜检阳性及健康人血样，结果完全正确。结论：所克隆的间日疟原虫SSUrDNA片段序列在间日疟原虫虫株间高度保守，以其为靶基因建立的PCR检测方法适用于间日疟的诊断。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析

目的克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段,并进行序列特征分析。方法采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征。结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%。结论成功克隆间日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守。     

不同地理株间日疟原虫SSUrRNA基因序列比较

目的测定我国间日疟原虫不同地理株红内期SSUrRNA基因序列,比较分析其分子特征。方法收集深圳、海南、湖北和河南四地间日疟患者血样5份（其中海南2份）,并提取核酸DNA,采用PCR从核酸提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后分别与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAsT和MEGA4软件分析序列相互关系特征。结果5株间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小一致,约为998bp;核酸序列测定结果显示,所克隆的SSUrRNA基因片段均含有998个核苷酸,不同地理株间SSUrRNA基因序列有9个位点存在变异的可能,两两比对的同源性均高于99．5％,其中河南与湖北株序列的同源性为100．0％;与GenBank中报道的国外6株间日疟原虫相同序列作分子系统进化分析。国内5株间日疟原虫SSUrRNA基因序列与Sa11株遗传距离小,亲缘关系接近。结论测定的国内间日疟原虫SSUrRNA基因序列在不同地理株间相对保守．其间存在的单核苷酸多态性与地理变化有一定程度的关系。     

间日疟原虫部分乳酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定我国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的部分基因序列并进行生物信息学分析。方法根据PvLDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从间日疟原虫基因组DNA中扩增LDH基因,定向克隆入pMD18质粒。阳性质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用生物信息学网站www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.ch对获得的基因及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的间日疟原虫LDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明,获得的间日疟原虫LDH基因全长897bp,编码299个氨基酸。DNAMAN预测PvLDH存在10个潜在抗原表位,均与PfLDH的相应预测表位间有同源序列。同源性分析显示,我国间日疟原虫与SalvadorⅠ株和Belem株间日疟原虫的氨基酸序列同源性为99%,与其它疟原虫LDH的同源性为88%～90%。结论成功克隆了我国间日疟原虫LDH基因,其基因序列与其它疟原虫LDH基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

【目的】克隆并测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)肝期抗原 1基因 (LSA 1) 3′端序列 ,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA 13′端序列的差异。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA 13′端序列 ,用T A克隆法将其克隆入pMD18 T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA 13′端序列的同源性分析。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HNLSA 13′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pT LSA 1重组质粒。测序表明 ,所克隆的LSA 13′端大小为 795bp ,编码 2 6 4个氨基酸。序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF5 4、T9/ 96、KEN、PNG及BRA株LSA 13′端编码的氨基酸序列只在 3个位点存在不同。【结论】克隆了恶性疟原虫FCC1/HNLSA 13′端片段。序列测定及同源性分析表明 ,FCC1/HNLSA 13′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3＇端的克隆及序列分析

[目的]克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)肝期抗原1基因(LSA-1)3＇端序列,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA-13’端序列的差异.[方法]应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA-13’端序列,用T-A克隆法将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA-13’端序列的同源性分析.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN LSA-13’端序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-LSA-1重组质粒.测序表明,所克隆的LSA-1 3 ＇端大小为795bp,编码264个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF4、T9/96、KEN、PNG及BRA株LSA-13’端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同.[结论]克隆了恶性疟原虫FCC1/HN LSA-13’端片段.序列测定及同源性分析表明,FCC1/HNLSA-1 3＇端序列与其它分离株有高度的同源性.     

恶性疟虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

目的：克隆并测定恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）肝期抗原1基因（LSA－1）3′端序列,比较FCC1／HN株与国外分离株LSA－1,3′端序列的差异。方法：应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增LSA－1,3′端序列,用T－A克隆法将其克隆入pMD18－5载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA－1,3′端序列的同源性分析。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN LSA－1,3′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT－LSA－1重组质粒。测序表明,所克隆的LSA－1,3′端大小为795bp,编码264个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株国外的NF54、T9／96、KEN、PNG及BRA株LSA－1,3′端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN LSA－1,3′端片段。序列测定及同源性分析表明,FCC1／HNLSA－1,3′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序

目的克隆、测定恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)成熟疟原虫感染红细胞表面抗原(MESA)基因序列，并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫palo-alto株MESA基因已知序列，设计合成四对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列，拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因片段，酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明，FCC1／HN株MESA全基因编码区长4102bp，A T含量为72．11％，G C含量为27．89％，有1个内含子；编码1323个氨基酸残基，分子量为154470u。序列分析表明，FCC1／HN株与Palo-aho、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性，序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析，有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因序列。FCC1／HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

恶性疟原虫核糖体小亚基rRNA部分基因片段的克隆及序列分析

目的了解我国恶性疟原虫云南地理株核糖体小亚基rDNA的核苷酸序列。方法根据已知恶性疟原虫核糖体小亚基rDNA序列．在其基因的中下游分别设计引物,采用聚合酶链式反应（PCR）技术,从云南省来源的恶性疟体外培养原虫的基因组DNA中扩增出的基因片段酶切后将其插入pUC118／119载体,用Biosystems373ADNA序列分析仪测定。结果我国恶性疟原虫云南地理株核糖体小亚基rDNA核苷酸序列,与巴西IMTM22／7G8株的序列比较,在该基困的第1563位有一个A被T替换。结论该突变点位于真核生物核糖作小亚基rRNA基因已知序列种类的第三个可变区域内。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的　建立鉴别人体四种疟原虫的套式 PCR技术 ,检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法　选用两组疟原虫引物 ,扩增 SSU r DNA特定片段 ,经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色 ,紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果　采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为 10 4bp、10 2 bp和 115 bp特异片段。所检测的 138份疟疾患者血样中 ,四川名山县 95份均为间日疟单纯感染 ,筠连县 37份中 10份为与间日疟和 /或恶性疟呈混合感染的三日疟 ,云南金平县的 6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论　所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点 ,在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

大肠癌相关基因ST13转录启动区的增强子研究

目的:探讨大肠癌相关基因ST13上游5'近端调控区(-595～ 74)中增强子碱基序列.方法:设计系列缺失PCR引物,扩增ST13基因5'近端碱基序列片段,pGEMT-EASY克隆、测序,再亚克隆到pGL2系列瞬间报告载体上,等量转染SW620细胞,检测荧光酶活性.结果:系列扩增碱基序列片段669 bp、263 bp、163 bp对pGL2-Basic中的荧光素酶基因均具有较强的启动表达作用,片段101 bp、47 bp则几乎没有启动下游基因表达的作用.而101 bp片段与系列报告载体pGL2重组的分子,在其中含有启动子的报告基因表达载体中具有明显的增强作用(P＜0.01),但作用强度小于阳性对照pGL2-Control(P＜0.05).结论:位于ST13基因上游5'近端调控区的碱基序列101 bp片段(-595～-494),是一个基因转录调控增强子.     

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的：构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法：以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果：PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论：成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

人源蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)病毒部分基因的克隆及序列分析

目的：从我国蓝氏贾第虫（Giardia lamblia)中寻找贾第虫病毒。方法 对人源贾第鞭毛虫北京株进行了体外纯培养，将其总核酸电泳，并用DNA酶和RNA酶处理。根据已发表的蓝氏贾第虫病毒基因序列合成一对引物并进行RT－PCR，将产物回收后连接到Pmd18-T载体上进行克隆并测序，通过BLAST对Gen Bank进行同源性搜索。在贾第虫总核酸电泳图谱上观察到一个分子量约7．0kb的片段。该核酸不能被DNA酶（100μg/ml）降解。但可被RNA酶（10μg/ml）降解。经RT－PCR扩增后得到1条预计856bp的片段，所得序列与蓝氏贾第虫病毒基因同源性为98％。结论 在我国人源贾第鞭毛虫北京株中发现贾第虫病毒，该病毒属于蓝氏贾第虫病毒。     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.