加味独活寄生合剂含药血清对兔退变软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的观察加味独活寄生合剂含药血清对兔退变软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法将体外培养的兔关节软骨细胞按随机数表分为6组:空白对照组,模型组,加味独活寄生合剂含药血清低、中、高剂量组及Wnt信号通路阻断剂组,后五组予白介素-1β诱导为退变软骨模型,然后予不同剂量的含药血清及s FRP-3干预。采用流式细胞仪检测细胞生长及周期情况,实时荧光定量PCR检测Wnt/β-catenin mRNA的表达。结果流式细胞仪检测结果显示,与空白对照组比较,模型组及加味独活寄生合剂含药血清低、中、高剂量组细胞生长情况明显减慢。实时荧光定量PCR检测结果显示,与模型组相比,加味独活寄生合剂含药血清低、中、高剂量组β-catenin mRNA均有降低。结论加味独活寄生合剂含药血清对白介素-1β诱导为退变软骨模型有一定的保护作用,其作用机制可能与调控Wnt信号通路有关。     

富血小板血浆对硝普钠诱导的软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:观察富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对硝普钠诱导的软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:取5月龄新西兰大白兔耳静脉血制成富血小板血浆。取兔双膝关节软骨,分离、培养软骨细胞。取培养的第2代软骨细胞,分为空白对照组、硝普钠对照组、PRP组和Wnt蛋白生成抑制剂2(the inhibitor of Wnt production-2,IWP-2)组,空白对照组与硝普钠对照组加入生理盐水、PRP组加入PRP、IWP-2组加入IWP-2干预1 h后,除空白对照组外,其余3组再加入硝普钠干预24 h。采用实时荧光定量PCR法检测各组软骨细胞Wnt1、β-catenin和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)mRNA的表达情况,采用Western-blot法检测各组软骨细胞Wnt1、β-catenin和GSK-3β蛋白表达情况。结果:经甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定所培养细胞为软骨细胞。干预后,4组软骨细胞Wnt1、β-catenin和GSK-3βmRNA相对表达量组间总体比较,差异均有统计学意义(0.429±0.015,0.968±0.058,0.693±0.019,0.228±0.012,F=4.673,P=0.013;0.434±0.021,0.948±0.067,0.702±0.024,0.191±0.011,F=3.918,P=0.008;0.816±0.039,0.225±0.017,0.459±0.018,0.929±0.118,F=3.015,P=0.005)。PRP组软骨细胞Wnt1、β-catenin mRNA相对表达量均较空白对照组和IWP-2组高(P=0.036,P=0.000;P=0.026,P=0.000),但均较硝普钠对照组低(P=0.017;P=0.013)。PRP组软骨细胞GSK-3βmRNA相对表达量较空白对照组和IWP-2组低(P=0.001,P=0.000),但较硝普钠对照组高(P=0.016)。干预后,4组软骨细胞Wnt1、β-catenin和GSK-3β蛋白相对表达量组间总体比较,差异均有统计学意义(0.565±0.017,0.941±0.134,0.725±0.031,0.251±0.013,F=5.062,P=0.017;0.526±0.024,0.872±0.016,0.653±0.016,0.262±0.018,F=3.592,P=0.006;0.753±0.014,0.262±0.015,0.579±0.024,0.823±0.025,F=2.384,P=0.002)。PRP组软骨细胞Wnt1和β-catenin蛋白相对表达量较空白对照组和IWP-2组高(P=0.031,P=0.000;P=0.041,P=0.002),但低于硝普钠对照组(P=0.032,P=0.025);PRP组软骨细胞中GSK-3β蛋白相对表达量较空白对照组和IWP2组低(P=0.035,P=0.011),但高于硝普钠对照组(P=0.010)。结论:PRP可抑制兔膝关节软骨细胞中Wnt1、β-catenin的表达,促进GSK-3β的表达。PRP可抑制硝普钠诱导的软骨细胞Wnt/β-catenin通路活性;但与Wnt蛋白生成抑制剂–2相比,PRP对软骨细胞Wnt/β-catenin通路活性的抑制作用较弱。     

毛冬青甲素促进骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的观察毛冬青甲素（ilexonin A, IA）干预大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）后基质细胞衍生因子（SDF-1）特异性受体CXCR4和Wnt通路中β-连环蛋白（β-catenin）、糖原合成激酶（GSK-3β）的表达情况,探讨IA预处理促进BMSCs体外迁移的分子机制。方法采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠并行BMSCs鉴定。将BMSCs分为对照组、Wnt3a组、IA组、IA + Wnt3a组、IA + Dkk1组、Dkk1组。以Wnt 信号通路的激动剂Wnt3a、抑制剂Dkk1干预,Western blot法观察β-catenin、GSK-3β与CXCR4的表达关系。结果与对照组比较,Wnt3a组、IA组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著增强、GSK-3β蛋白表达显著减弱;（P<0.05）,Dkk1组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与Wnt3a组、IA组分别比较,IA+Wnt3a组CXCR4蛋白显著增强,GSK-3β蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与Dkk1组比较,IA+Dkk1组CXCR4、β-catenin蛋白表达显著增强,GSK-3β蛋白表达显著减弱（P<0.05）;与IA组比较,IA+Dkk1组β-catenin的表达显著减弱,GSK-3β蛋白表达显著增强（P<0.05）。结论IA上调CXCR4 的表达,可能与 BMSCs 的Wnt/β-catenin信号通路激活有关,发挥其促迁移的作用。     

Klf4抑制Wnt/β-catenin信号通路调控软骨细胞增殖的研究

目的探讨Klf4基因对大鼠软骨细胞增殖影响及相关机制。方法从出生24 h SD幼鼠的股骨头提取软骨细胞,细胞免疫荧光鉴定Col2a1和Sox9基因的表达。转染慢病毒载体PCDH-GFP-Klf4和辅助质粒PSPAX2及PMD2.0G至293ft细胞中产生慢病毒,48 h后收集病毒上清,用其感染大鼠软骨细胞作为Klf4组,用PCDH-GFP慢病毒感染细胞作为对照组。采用CCK8法检测2组细胞生长增殖变化;采用Western blot方法,分别检测2组细胞中Klf4基因表达、增殖相关基因PCNA和CyclinD1蛋白表达、Wnt/β-catenin信号通路上下游基因表达情况。结果原代培养软骨细胞均强表达Col2a1和Sox9基因。慢病毒PCDH-GFP-Klf4和PCDH-GFP成功感染软骨细胞,Klf4基因在软骨细胞过表达。Klf4组软骨细胞生长明显受到抑制,PCNA和CyclinD1蛋白表达和Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达均明显下调。结论过表达Klf4基因可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达而抑制软骨细胞增殖。     

Wnt/β-catenin通路在糖尿病肾病大鼠的表达及化瘀通络中药的干预作用

目的探讨Wnt/β-catenin通路在糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏的表达及化瘀通络中药对其的干预作用。方法 60只大鼠中选取10只为对照组,其余大鼠给予高糖高脂饲料喂养联合ip小剂量链脲佐菌素(STZ)制备DN模型。成模大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组、化瘀通络中药组,各组ig给药,20周末检测24 h尿蛋白定量,RT-PCR法检测Wnt4、β-catenin m RNA表达,免疫组化及Western blotting法检测Wnt4、β-catenin蛋白的表达。结果与对照组比较,模型组大鼠24 h尿蛋白定量及Wnt4、β-catenin m RNA和蛋白的表达量明显升高(P0.01)。与模型组比较,中药组及厄贝沙坦组24 h尿蛋白定量及Wnt4、β-catenin m RNA和蛋白的表达量明显降低(P0.05、0.01)。结论化瘀通络中药可减少DN大鼠尿蛋白,且能够抑制大鼠肾脏存在的Wnt/β-catenin通路高表达,该作用可能是其减少蛋白尿排泄的主要途径之一。     

买朱尼对骨性关节炎大鼠关节软骨中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用研究

目的观察维药买朱尼对骨性关节炎模型大鼠关节软骨中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用,探讨买朱尼对软骨细胞的保护作用机制。方法将30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和买朱尼组,每组10只。模型组和买朱尼组采用改良Hulth造模法建立膝骨关节炎模型,建模第2周开始买朱尼组灌胃买朱尼10.31 mg/(kg·d),模型组和假手术组灌胃等量生理盐水,均连续4周。末次灌胃后24 h取3组大鼠膝关节软骨标本进行大体评分和组织学评分,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测Wnt/β-catenin通路中β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a的表达水平。结果模型组大鼠膝关节软骨标本大体评分、软骨组织学Mankin评分及软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a蛋白及mRNA表达水平均明显高于假手术组(P均0.05),而买朱尼组均明显低于模型组(P均0.05)。结论维药买朱尼可以减轻大鼠膝关节软骨退变的程度,其可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路来发挥保护关节软骨细胞的作用。     

壮骨健膝方含药血清对经IL-1β诱导的大鼠膝关节退变软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路抑制因子蛋白表达的影响

目的观察壮骨健膝方含药血清对大鼠膝关节退变软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路抑制因子Dkk-1、sFRP-3蛋白表达的影响,揭示该方保护膝关节软骨细胞的可能分子机制。方法取清洁级2周龄SD大鼠膝关节软骨细胞,采用含10 ng/mL IL-1β的10%FBS/DMEM培养,干预24 h后制备退变软骨细胞模型,模型鉴定成功后随机分为空白血清组和含药血清组,分别采用含10%大鼠空白血清、10%壮骨健膝方大鼠含药血清的DMEM进行干预,干预24、36、48、72 h时分别采用Western blot法检测软骨细胞Dkk-1、s FRP-3蛋白的表达水平。结果空白血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平随着干预时间延长而逐渐下降,干预48 h和78 h均显著低于24 h(P均0.05);含药血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平随着干预时间延长而逐渐增强,其中干预36 h高于24 h(P0.05),干预48 h和72 h显著高于24 h(P均0.01),干预48 h和72 h高于36 h(P均0.05);与空白血清组同一时间点比较,含药血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平在干预36 h、48 h和72 h时均显著增高(P0.05或0.01)。结论壮骨健膝方含药血清可能通过提高Dkk-1、s FRP-3蛋白的表达水平,抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,从而对经IL-1β诱导退变的大鼠膝关节软骨细胞起保护作用,其效果在一个细胞培养换液周期内随培养时间延长而增强。     

独活寄生汤水提物对软骨细胞G1期调控因子mRNA表达的影响

目的: 探讨独活寄生汤水提物对软骨细胞G₁期的影响。 方法: 取4周龄雄性SD大鼠,建立软骨细胞体外培养体系,第3代软骨细胞进行干预,采用MTT法检测不同浓度的独活寄生汤水提物对软骨细胞活性的影响;RT-PCR检测空白组、独活寄生汤水提物低、中、高剂量组(100,200,400 mg·L^-1)软骨细胞Cyclin D1,CDK4,CDK6及P21 mRNA的表达。 结果: MTT法检测显示,在一定的药物质量浓度范围内(50~800 mg·L^-1),软骨细胞活性显著上升(P<0.01);干预24 h后,Cyclin D1,CDK4及CDK6 mRNA表达量各剂量组明显增加(P<0.05),200 mg·L^-1表达量最大(P<0.01);P21 mRNA表达量降低,且200 mg·L^-1抑制作用最明显(P<0.01)。 结论: 独活寄生汤水提物通过影响软骨细胞G₁期调控因子mRNA的表达,促进软骨细胞的增殖。     

清热活血方药对CIA大鼠Wnt信号通路成骨细胞相关因子的影响

目的:分析清热活血方(QRHX)对类风湿关节炎大鼠Wnt信号通路相关因子表达的影响,探讨清热活血方药对CIA大鼠骨破坏的保护机制。方法:SD大鼠40只按随机数字表法分为正常组、模型组、清热活血方药组、依那西普组。通过滑膜病理切片观察各组大鼠关节滑膜病理改变,采用RT-PCR方法对各组大鼠滑膜DKK-1、β-catenin基因mRNA表达水平进行对比分析,通过ELISA检测各组大鼠血清DKK-1、β-catenin、TCF、LRP5的蛋白含量。结果:滑膜病理显示清热活血方药组大鼠滑膜中的炎症水平较模型组明显减轻,清热活血方药组大鼠滑膜中DKK-1mRNA表达水平和血清中DKK-1含量较模型组明显减少,β-catenin mRNA表达水平及血清β-catenin、TCF、LRP5含量与模型组比较显著升高。结论:清热活血方药能降低滑膜炎症水平,抑制Wnt信号通路中DKK-1细胞因子的表达,促进β-catenin、TCF、LRP5的表达,可能通过作用于Wnt/β-catenin通路在CIA大鼠骨破坏过程中发挥骨保护作用。     

基于Wnt 通路探讨生地黄水提物对单侧输尿管梗阻大鼠肾纤维化 的作用机制

目的观察生地黄水提物对单侧输尿管梗阻（UUO）模型大鼠肾纤维化的影响,并基于Wnt 通路探讨其 延缓肾纤维化进程的可能机制。方法通过结扎左侧输尿管建立UUO 大鼠模型。将SD 大鼠随机分为假手术 组、模型组和生地黄低、中、高剂量组（0.8、1.6、3.2 g·kg-1）,术后连续灌胃给药14 d。采用HE 染色法及 Masson 染色法观察生地黄水提物对梗阻侧肾脏病理损伤和纤维化的改善作用;采用免疫组化法检测肾脏纤维 化相关蛋白CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin 的表达和分布;免疫荧光法检测上皮间质转化标志蛋白α-SMA、 E-cadherin 的表达;Western Blot 法检测Wnt 通路关键蛋白Wnt5a、GSK-3β 和β-catenin 的表达。结果与假 手术组比较,模型组大鼠肾脏病理损伤和间质胶原纤维沉积严重,E-cadherin 表达和分布减少,CollagenⅠ、 α-SMA、Vimentin 以及Wnt5a、GSK-3β、β-catenin 蛋白表达明显上调（P＜0.01）。与模型组比较,生地黄各 剂量组能够改善UUO 大鼠的肾小管扩张、小管上皮细胞空泡变性以及坏死等病理学改变和间质胶原沉积,增 加E-cadherin 表达和分布,并明显下调CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin、Wnt5a、GSK-3β 和β-catenin 蛋白表 达（P＜0.05,P＜0.01）。结论生地黄水提物能够改善UUO 模型大鼠肾脏病理损伤和纤维化程度,其机制可 能与抑制Wnt 通路活化,阻抑上皮间质转化,从而减少细胞外基质沉积,延缓纤维化进程有关。     

加味独活寄生合剂促进膝骨关节炎软骨修复疗效及作用机制研究

目的探讨加味独活寄生合剂促进膝骨关节炎(KOA)软骨细胞增殖的临床疗效及其作用机制。方法采用随机数字表法将60例患者随机分为治疗组和对照组各30例。治疗组予加味独活寄生合剂,每次62.5 m L,每日2次,口服;硫酸氨基葡萄糖胶囊,每次1粒,每日3次,口服。对照组予双醋瑞因胶囊,每次1粒,每日2次,口服;硫酸氨基葡萄糖胶囊,用法用量同治疗组。嘱患者行股四头肌舒缩功能锻炼,注意保暖。连续治疗6周。观察2组治疗前后视觉模拟评分法(VAS)评分、西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC),检测患膝关节液白细胞介素-1(IL-1)、一氧化氮(NO)、Wnt5a、β-连环蛋白(β-catenin)、Sox9、胶原蛋白Ⅱ(CollagenⅡ)含量,监测不良反应。结果与本组治疗前比较,2组治疗后IL-1、NO、Wnt5a、β-catenin含量明显降低(P0.05),Sox9、CollagenⅡ含量明显升高(P0.05),VAS评分、WOMAC明显降低(P0.05),以上指标2组治疗后比较差异无统计学意义(P0.05)。2组均未见明显不良反应。结论加味独活寄生合剂可降低关节液中炎症因子水平,抑制Wnt信号通路,通过调节通路中Sox9、CollagenⅡ表达促进KOA软骨细胞的增殖分化,有效缓解疼痛并改善关节功能。     

基于Wnt信号通路研究黄芩汤干预炎症微环境下结肠癌细胞上皮间质转化与细胞周期进程的作用机制

目的 研究黄芩汤对炎症微环境下结肠癌HT-29细胞上皮间质转化与细胞周期进程的影响。方法 使用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导淋巴瘤THP-1细胞,取细胞上清液作为条件培养基,将条件培养基加入HT-29细胞培养体系中构建炎症微环境下结肠癌细胞模型,给予黄芩汤（500、250、125μg/mL）干预后,Transwell法检测细胞迁移与侵袭能力;Western blotting检测海马无翅基因3a(recombinant wingless type MMTV integration site family member 3a,Wnt3a)、β-连环蛋白（β-catenin）、E-cadherin、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthasc kinase-3β,GSK-3β)、细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达;qRT-PCR检测Wnt3a、β-catenin、E-cadherin、GSK-3β、CDK4和cyclin D1的m RNA表达。结果 与对...     

胃癌前病变大鼠胃组织GSK-3β、β-catenin及Cyclin D1的表达及意义

目的:探讨胃癌前病变大鼠胃组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白GSK-3β、β-catenin及Cyclin D1的表达及其意义。方法:将50只SD大鼠随机分为正常组10只和模型组40只,正常组予自由饮用清洁水,进食普通颗粒饲料;模型组予150μg/m L的N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)自由饮用,同时自由进食含0.03%盐酸雷尼替丁的颗粒饲料,每4周各处死5只模型组大鼠观察造模情况,28周建立PLGC模型后处死全部大鼠。观察大鼠一般情况(体重、进食量及饮水量)及胃组织大体形态,HE染色观察胃黏膜病理形态,免疫组织化学方法观察胃组织GSK-3β、β-catenin及Cyclin D1蛋白表达情况。结果:(1)大鼠体重及进食量、饮水量比较:与正常组比较,模型组大鼠体重、日进食量及日饮水量均有减少,具有统计学意义(P0.05或P0.01)。(2)病理形态学变化:正常组大鼠胃黏膜腺体形状规则、排列紧密,层次完整;模型组大鼠胃黏膜变薄,腺体减少,胃小凹粗大,或可见潘氏细胞,黏膜肌层增厚。(3)GSK-3β、β-catenin及Cyclin D1等蛋白表达情况:模型组GSK-3β于细胞质表达呈浅棕色或不着色,与正常组比较,阳性细胞平均光密度降低(P0.05);模型组β-catenin于细胞质及细胞核呈棕色或深棕褐色、Cyclin D1于细胞核表达呈深棕褐色颗粒状,与正常组比较,阳性细胞平均光密度较正常组明显升高(P0.01)。结论:PLGC发病与Wnt/β-catenin信号通路相关的异常激活,GSK-3β、β-catenin及Cyclin D1蛋白的异常表达有关。     

基于Wnt/β-catenin通路探讨尪痹片促进去势后胶原诱导性关节炎大鼠骨形成的机制

目的 基于果蝇无翅基因/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路，研究尪痹片（WBT）干预去势后胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠的骨形成机制。方法 48只雌性SD大鼠经随机数字表法分为空白对照组、去势组、CIA组、去势CIA组、去势+WBT组、CIA+WBT组、CIA+甲氨蝶呤（MTX）组、去势CIA+WBT组，每组6只。去势法制备肾虚证模型，CIA法制备类风湿关节炎模型，WBT采用每日0.63 g/kg灌胃，MTX采用每周1.05 mg/kg结合生理盐水灌胃，其余组均予生理盐水灌胃，56日后取材。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）水平，蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测Wnt3a、Wnt10b、β-catenin、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、Dickkopf相关蛋白-1 (DKK-1)、Runt相关转录核心因子2(Runx2)、碱性磷酸酶（ALP）、核酸内切酶Dicer蛋白表达量，逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测DKK-1、微小RNA(miR)-335-5p mRNA表达量。结果 去势后大鼠逐渐...     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨加味二仙颗粒治疗KOA的作用

目的:基于Wnt/β-catenin信号通路探讨加味二仙颗粒治疗绝经期膝骨关节炎的作用。方法:将SD雌性大鼠分为假手术组、模型组、西乐葆组、加味二仙颗粒高、中、低剂量组,采用双侧卵巢切除8周后膝关节腔注射木瓜蛋白酶结合L-半胱氨酸复制大鼠绝经后KOA模型。造模后每天灌胃给药1次,4周后检测大鼠血清雌二醇(E2)水平和相关基因蛋白的表达并观察膝关节组织病理变化。结果:与假手术组相比,模型组大鼠血清E2水平显著下降(P<0.01),关节软骨Wnt-4及β-catenin mRNA表达显著升高、GSK-3βmRNA表达显著降低(P<0.05),膝关节软骨表面粗糙,软骨层明显变薄;与模型组对比,加味二仙颗粒组大鼠E2水平有明显提高(P<0.01),膝关节软骨Wnt-4及β-catenin mRNA表达显著降低(P<0.05),Ⅱ型胶原密度升高,MMP-13密度降低,膝关节软骨表面回复平整,软骨细胞数量较多且密集规整。结论:加味二仙颗粒能够提高体内E2水平,通过调节Wnt/β-catenin信号通路影响软骨细胞影外基质降解和软骨细胞凋亡,从而保护膝关节软骨,发挥治疗绝经期膝骨关节炎的作用。     

跳骨片含药血清抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制研究

目的:探讨跳骨片含药血清抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制。方法:将10只8周龄雄性SD大鼠随机分为跳骨片组和空白组,跳骨片组以0.32 g·kg-1剂量的跳骨片灌胃,空白组给予等量生理盐水灌胃;每天灌胃1次,连续7 d;末次灌胃1 h后,经腹主动脉取血,分别制备跳骨片含药血清和空白血清,低温保存备用。从10只4周龄SD大鼠膝关节软骨中分离软骨细胞并培养,光学显微镜下观察软骨细胞形态,并用Ⅱ型胶原酶免疫组化鉴定。将培养好的第2代软骨细胞随机分为空白血清组、模型组、跳骨片含药血清组,其中空白血清组以含10%空白血清的培养基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)培养;模型组以浓度为10 ng·mL-1的脂多糖和含10%空白血清的DMEM培养;跳骨片含药血清组以浓度为10 ng·mL-1的脂多糖和含10%跳骨片含药血清的DMEM培养;3组均连续干预培养8 h,采用酶联免疫吸附法检测软骨细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)3、MMP9含量,采用荧光定量RT-PCR法检测软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达水平,采用Western blot法检测软骨细胞中β-链蛋白(β-catenin)、卷曲蛋白-2(Frizzled-2)的蛋白表达量,采用免疫荧光检测法检测软骨细胞中β-catenin、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasc kinase-3β,GSK-3β)、蛋白多糖1(proteoglycans 1,PGS1)的蛋白表达量。结果:(1)软骨细胞免疫组化鉴定结果。第2代软骨细胞胞浆及细胞膜呈棕黄色阳性染色,具有典型的软骨细胞生物学特征。(2)软骨细胞MMP3、MMP9含量。脂多糖干预8 h后,空白血清组、模型组和跳骨片含药血清组的软骨细胞MMP3、MMP9含量比较,组间差异均有统计学意义[(34.019±1.036)ng·mL-1,(44.645±2.473)ng·mL-1,(32.941±1.792)ng·mL-1,F=36.060,P=0.000;(1.348±0.038)ng·mL-1,(1.562±0.112)ng·mL-1,(1.331±0.015)ng·mL-1,F=11.319,P=0.000];模型组软骨细胞MMP3、MMP9含量均高于空白血清组(LSD-t=-7.016,P=0.000;LSD-t=-3.768,P=0.003);跳骨片含药血清组软骨细胞MMP3、MMP9含量均低于模型组(LSD-t=7.652,P=0.000;LSD-t=4.066,P=0.002);空白血清组软骨细胞MMP3、MMP9含量与跳骨片含药血清组比较,差异均无统计意义(LSD-t=0.635,P=0.549;LSD-t=0.299,P=0.770)。(3)软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达。脂多糖干预8 h后,空白血清组、模型组和跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、Frizzled-2、Wnt-4、CKI-ε基因表达量比较,组间差异均有统计学意义(1.000±0.275,2.258±0.206,1.431±0.304,F=36.709,P=0.000;1.000±0.133,0.417±0.104,0.842±0.094,F=29.259,P=0.000;1.000±0.191,1.737±0.238,1.445±0.337,F=7.027,P=0.015;1.000±0.341,3.801±0.579,1.876±0.388,F=71.903,P=0.000;1.000±0.309,2.208±0.708,1.441±0.421,F=64.178,P=0.000);模型组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2、Wnt-4、CKI-ε基因表达量均高于空白血清组(LSD-t=-8.431,P=0.000;LSD-t=-3.723,P=0.005;LSD-t=8.062,P=0.000;LSD-t=-11.235,P=0.000),GSK-3β基因表达量低于空白血清组(LSD-t=7.397,P=0.000);跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2、Wnt-4、CKI-ε基因表达量均低于模型组(LSD-t=5.541,P=0.000;LSD-t=1.477,P=0.017;LSD-t=8.062,P=0.000;LSD-t=6.882,P=0.000),GSK-3β基因表达量高于模型组(LSD-t=-5.387,P=0.000);空白血清组软骨细胞中β-catenin、Wnt-4、CKI-ε基因表达量均低于跳骨片含药血清组(LSD-t=-2.289,P=0.018;LSD-t=-3.658,P=0.005;LSD-t=-4.352,P=0.002);空白血清组软骨细胞中GSK-3β、Frizzled-2基因表达量与跳骨片含药血清组比较,差异均无统计学意义(LSD-t=2.009,P=0.075;LSD-t=-3.658,P=0.051)。(4)软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2的蛋白表达。脂多糖干预8 h后,空白血清组、模型组和跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义(0.449±0.063,0.746±0.156,0.549±0.056,F=5.323,P=0.026;1.348±0.038,1.562±0.112,1.331±0.015,F=6.291,P=0.034);模型组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2蛋白表达量高于空白血清组(LSD-t=-11.235,P=0.005;LSD-t=-3.104,P=0.021);跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2蛋白表达量低于模型组(LSD-t=6.883,P=0.037;LSD-t=3.039,P=0.023);空白血清组软骨细胞中β-catenin蛋白表达量低于跳骨片含药血清组(LSD-t=-4.352,P=0.002);空白血清组软骨细胞中Frizzled-2蛋白表达量与跳骨片含药血清组比较,差异无统计学意义(LSD-t=-0.065,P=0.950)。(5)软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、PGS1的蛋白表达。脂多糖干预8 h后,软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、PGS1蛋白染色明显,呈绿色;空白血清组、模型组和跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、PGS1蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义(0.014±0.002,0.029±0.006,0.018±0.002,F=9.910,P=0.013;0.380±0.011,0.237±0.015,0.287±0.002,F=56.639,P=0.000;0.034±0.003,0.022±0.002,0.029±0.003,F=27.232,P=0.001);模型组软骨细胞β-catenin蛋白表达量高于空白血清组(LSD-t=-4.103,P=0.006),GSK-3β、PGS1蛋白表达量低于空白血清组(LSD-t=1.048,P=0.000;t=7.365,P=0.000);跳骨片含药血清组软骨细胞β-catenin蛋白表达量低于模型组(LSD-t=-3.548,P=0.012),GSK-3β、PGS1蛋白表达量高于模型组(LSD-t=-3.657,P=0.011;LSD-t=-3.273,P=0.017);空白血清组软骨细胞中β-catenin蛋白表达量与跳骨片含药血清组比较,差异无统计学意义(LSD-t=-0.554,P=0.599);空白血清组软骨细胞中GSK-3β、PGS1蛋白表达量高于跳骨片含药血清组(LSD-t=6.827,P=0.000;LSD-t=4.092,P=0.010)。结论:跳骨片含药血清可以抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应,延缓关节软骨退变。其作用机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关,其中β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、Wnt-4、CKI-ε基因可能是该信号通路的重要靶点。但是由于引起OA的因素众多且跳骨片含药血清成分多且复杂,有待于进一步研究证实。     

松果菊苷对帕金森病模型大鼠海马区神经元GSK-3β蛋白的影响

目的研究松果菊苷对PD模型大鼠海马区神经元GSK-3β蛋白表达的影响。方法取雄性SD大鼠48只,随机分为正常组、假手术组、PD模型组、松果菊苷治疗组,用6-OHDA立体定向微量注射于大鼠右侧内侧前脑束制备帕金森病(PD)大鼠模型,用Western Blot检测4组大鼠海马区神经元GSK-3β蛋白的表达。结果在相同条件下,PD模型组的大鼠海马区GSK-3β蛋白的表达量高于正常组,用松果菊苷治疗后,GSK-3β蛋白的表达量降低(P0.01)。结论松果菊苷可影响大鼠海马区患侧Wnt/β-catenin通路GSK-3β蛋白的表达,对帕金森病有一定的治疗作用。     

当归多糖通过Wnt/β-catenin信号通路抑制骨关节炎软骨细胞氧化应激损伤与炎症反应

目的:研究当归多糖通过Wnt/β-catenin信号通路对骨关节炎软骨细胞的氧化应激损伤及炎症反应的影响。方法:在大鼠膝关节中注射碘乙酸建立关节炎模型,3 mg/只,对照组注射等量的0.9%氯化钠溶液; 将关节炎模型大鼠分为模型组和当归多糖组。给药3周后,采用酶联免疫吸附法测定SD大鼠血清中炎症因子水平、氧化应激参数水平[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)]、膝关节软骨中基质金属蛋白酶-13(MMP-13)mRNA表达水平和c-Fos蛋白表达水平。采用酶标仪测定当归多糖处理48 h后的IL-1β,损伤SW1353细胞8 h后的细胞活性。通过PCR法检测MMP-13 mRNA、β-catenin mRNA、ADAMTS4 mRNA的表达水平。通过Western blot法测定β-catenin、MMP-13蛋白表达水平。结果:当归多糖治疗后,IL-1β、TNF-α、MDA、SOD、CAT水平及MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白均低于模型组,差异有统计学意义(均P<0.05)。在IL-1β刺激的SW1353损伤模型中,经过10、50、100 μg/ml当归多糖处理后,SW1353细胞活性较模型组增加,组间比较差异有统计学意义(均P<0.05); Wnt 4a、GSK-3β、β-catenin、ADAMTS4 mRNA和MMP-13 mRNA蛋白表达均低于模型组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:当归多糖通过Wnt/β-catenin信号通路抑制骨关节炎软骨细胞的氧化应激损伤与炎症反应。     

芍药舒筋片通过miRNA-140对骨关节炎大鼠软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用

目的:研究芍药舒筋片通过miRNA-140对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用,探讨芍药舒筋片对骨关节炎(OA)大鼠软骨细胞的保护作用。方法:取SD大鼠45只,随机分为假手术组、OA对照组、OA治疗组,每组各15只。OA对照组和OA治疗组采用改良Hulth造模法建模,假手术组和OA对照组在建模2周后开始生理盐水灌胃,OA治疗组等量芍药舒筋片灌胃。采用CCK-8溶液检测药物对细胞增殖的影响; 软骨组织学采用Mankin评分; 检测各组软骨细胞miRNA-140、Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA和蛋白表达。结果:OA对照组中软骨细胞的增殖速率、miRNA-140相对表达量均明显低于假手术组,而OA治疗组均明显高于OA对照组(P<0.05)。OA对照组中Mankin评分、细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA和蛋白表达水平均明显高于假手术组,而OA治疗组均明显低于OA对照组(P<0.05)。结论:芍药舒筋片能够增加OA大鼠软骨细胞中miRNA-140的相对表达量和软骨细胞的增殖速率,降低Mankin评分,且能够通过调节Wnt/β-catenin信号通路活性来发挥其对关节软骨细胞的保护作用。     

肾气丸对衰老大鼠小肠干细胞及其微环境Wnt/β-catenin信号通路的调节作用

目的:探讨肾气丸对衰老大鼠小肠干细胞及其微环境Wnt/β-catenin信号通路的调节作用。方法:使用SD大鼠,根据不同发育阶段分为6月龄成年对照组、22月龄衰老模型组及肾气丸低、高剂量组。采用HE染色观察小肠基本形态及测量相应指标,采用免疫组织化学法检测各组大鼠小肠PCNA、Bmi 1、β-catenin、GSK-3β的表达情况。结果:与成年组比较,衰老模型组绒毛长度、绒毛宽度、隐窝深度、绒毛/隐窝值(V/C值)均显著降低,PCNA、Bmi 1、β-catenin表达显著降低,而GSK-3β表达显著升高。与衰老模型组比较,肾气丸各组绒毛长度、绒毛宽度、隐窝深度、绒毛/隐窝值(V/C值)均显著升高,PCNA、Bmi 1、β-catenin表达显著均升高,GSK-3β表达显著降低。结论:肾气丸可改善衰老大鼠小肠干细胞增殖功能并上调Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。