慢性HBV感染患者抗原特异性CTL的肝损伤作用

目的探讨抗原表位特异性CTL在慢性乙型肝炎发病中的作用。方法用4个HBV抗原表位肽四聚体对外周血中抗原特异性CTL进行检测[HBV抗原表位肽分别为HBcAg18-27,序列为FLPSDFFPSV（C18）,HBsAg183～191,序列为WLSLLVPFV（E183）,HBeAg335-343,序列FLLTRILTI（E335）,多聚酶P的575～583序列为FLLSLGIHL（P1575）],检测慢性乙型肝炎患者肝炎发作时病毒抗原表位特异性CTL出现频率,分析抗原表位特异性CTL频率与血清ALT水平的相关关系,分析各组间抗原表位特异性CTL频率的差异。结果36例慢性HBV感染患者抗原表位特异性CTL检测阳性33例（92％）,HBeAg183～191表位特异性CTL频率高于其他3个（P〈0．05）。统计分析抗原表位特异性CTL频率血清ALT水平相关性不显著;分组对比发现血清ALT升高5-10倍组多个抗原表位特异性CTL水平高于其他组（P〈0．05）。结论慢性HBV感染患者外周血中存在抗原表位特异性CTL,但特异性CTL的存在并不能代表保护性免疫。认为抗原表位特异性CTL在肝炎发作过程中具有肝组织损害作用,肝损伤作用可能比较轻微。     

乙型肝炎外周血T淋巴细胞上CD28分子表达与病毒载量的关系

目的：分析HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者、HBeAg阳性乙肝病毒携带者外周血T淋巴细胞上CD28表达情况及其与HBV病毒载量的关系。方法采集健康人、HBeAg阳性乙肝病毒携带者、HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的外周血,抗体标记,采用流式细胞技术检测CD4^＋、CD8^＋、CD4^＋CD28^＋、CD8^＋CD28^＋T淋巴细胞,同时检测肝功能HBV DNA。结果慢性乙型肝炎组、乙肝病毒携带组CD4^＋CD28^＋T细胞、CD8^＋CD28^＋T细胞百分率明显低于健康对照组（P〈0.05）;HBV DNA≥107组CD8^＋CD28^＋T细胞百分率低于HBV DNA＜107组（P〈0.05）。结论乙型肝炎病毒感染者CD8^＋T细胞上CD28的低表达与高病毒载量有关。     

HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞抑制乙型肝炎病毒的体外实验研究

摘要目的观察HBV感染者的HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞体外抑制乙型肝炎病毒（HBV）的作用和探讨非溶细胞机制清除病毒的效应分子。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞。用HLA—A匹配的HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞克隆（效应细胞）与靶细胞（效靶比例1：50）共同培养,于24h、48h和72h收集培养上清,通过检测其中HBV产物的变化,观察CD8^＋T克隆对HBV的抑制作用。用抗体中和法观察CD8^＋T细胞分泌的IFN-γ被封闭后HBV抑制的变化。结果HBV特异性CD8^＋T克隆与靶细胞共育后,培养上清可检出高水平IFN-γ。共育后对HBsAg、HBeAg和HBV—DNA的最高抑制率分别为54．55％、50．36％和74．55％,均在72h。IFN-γ被抗体封闭后,对HBVDNA的抑制率显著下降,24h和48h分别为6．22％和17．48％。细胞毒活性最高见于24h,15．66％。结论①病毒特异性CD8^＋T细胞对靶细胞中HBV的清除既有溶细胞机制,也有非溶细胞机制参与;②IFN-γ是非溶细胞机制清除病毒的主要效应分子。     

HBcAg肽特异性CD8+T细胞抑制乙型肝炎病毒的体外实验研究

摘要目的观察HBV感染者的HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞体外抑制乙型肝炎病毒（HBV）的作用和探讨非溶细胞机制清除病毒的效应分子。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞。用HLA—A匹配的HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞克隆（效应细胞）与靶细胞（效靶比例1：50）共同培养,于24h、48h和72h收集培养上清,通过检测其中HBV产物的变化,观察CD8^＋T克隆对HBV的抑制作用。用抗体中和法观察CD8^＋T细胞分泌的IFN-γ被封闭后HBV抑制的变化。结果HBV特异性CD8^＋T克隆与靶细胞共育后,培养上清可检出高水平IFN-γ。共育后对HBsAg、HBeAg和HBV—DNA的最高抑制率分别为54．55％、50．36％和74．55％,均在72h。IFN-γ被抗体封闭后,对HBVDNA的抑制率显著下降,24h和48h分别为6．22％和17．48％。细胞毒活性最高见于24h,15．66％。结论①病毒特异性CD8^＋T细胞对靶细胞中HBV的清除既有溶细胞机制,也有非溶细胞机制参与;②IFN-γ是非溶细胞机制清除病毒的主要效应分子。     

HLA-A＊02／24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

HLA-A·02/24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临床疾病状态的关系

目的通过定量分析HLA-A*2402限制性的乙型肝炎病毒(HBV)特异性的细胞毒性T细胞(CTL)来研究急性自限性和慢性持续性乙型肝炎患者体内免疫反应的差异。方法从急性和慢性乙型肝炎感染患者外周血中提取外周血单个核淋巴细胞(PBMC),用HLA-A*2402-HBV肽链四聚体复合体染色后,用流式细胞仪检测HBV特异性CTL细胞。同时使用酶联免疫斑点法来检测部分患者的CTL细胞分泌干扰素(IFN)-1的水平。结果在7例急性乙型肝炎的急性期,可以检测到高水平的HBV特异性的CTL细胞,而在急性乙型肝炎的恢复期,HBcAg特异性CTL细胞的水平可以明显下降。在13例慢性乙型肝炎患者中,除了1例慢性肝炎急性暴发患者之外,均不能检测到HBcAg特异性CTL细胞。IFN-γ的分泌与这些结果相一致。结论HBcAg特异性CTL细胞在急性肝炎患者清除乙型肝炎病毒的过程中可能起到至关重要的作用。     

Frequencies and characterization of HBV-specific cytotoxic T lymphocytes in self-limited and chronic hepatitis B viral infection in China

Hepatitis B virus （HBV）-specific cytotoxic T lymphocytes （CTLs） are believed to play a major role in viral clearance and disease pathogenesis during HBV infection. To clarify the differences in host immune responses between self-limited and chronic HBV infections, we constructed three HLA-A＊0201/HBV tetramers with immunodominant epitopes of core18-27, polymerase 575-583 and envelope 335-343, and analyzed the HBV-specific CTLs in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） from patients infected with HBV. The frequencies and expansion ability of HBV-specific CD8＋T cells in most self-limited HBV infected individuals were higher than those in chronic HBV-infected patients. HBV-specific CD8＋T cells could be induced by in vitro peptide stimulation from chronic patients with a low level of serum HBV-DNA but not from those with a high level of serum HBV-DNA. In chronic infection, no significant correlation was found either between the frequencies of HBV-specific CD8^＋ T cells and the viral load, or between the frequencies and the levels of alanine transaminase. Our results suggested that the frequencies of HBV-specific CTLs are not the main determinant of immune-mediated protection in chronic HBV infection and immunotherapeutic approaches should be aimed at not only boosting a HBV-specific CD8^＋T response but also improving its function.     

全血染色法和分离外周血单个核细胞染色的五聚体技术检测抗原特异性CTL的比较

目的分别采用分离外周血单个核细胞(PBMC)法和全血直接染色法的组织相容性抗原-肽五聚体(MHCpentamers)流式细胞技术定量分析慢性乙型肝炎(下称慢性乙肝)患者体内乙型肝炎病毒(HBV)特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL),并对两种方法进行比较。方法从慢性乙肝患者外周血中分离PBMC,用HLA-A2HBcAg抗原表位肽-MHCPentamers及CD8单克隆抗体染色后,用流式细胞仪检测HBV特异性的CTL细胞,部分患者同时采用全血直接染色方法进行HBV特异性的CTL细胞的检测。结果32例HLA-A2阳性的慢性乙肝患者外周血均可检测到HBV特异性的CTL细胞,五聚体阳性细胞占CD8阳性细胞的比例平均为(1.34±1.06)%,两种染色方法检测的特异性的CTL细胞无统计学差异。结论全血直接染色结合五聚体流式细胞技术检测抗原特异性CTL是一种简便、敏感和可行的抗原表位特异性CTL检测方法。     

乙肝患者外周血HBV抗原抗体表达及病毒载量与T细胞亚群检测分析

目的探讨临床中乙肝患者外周血的HBV抗原抗体的表达及病毒载量情况,并分析其与T细胞亚群之间的关系。方法选取我院2010年1～12月间的80例乙肝患者为研究组,另选取同期在我院体检的80例健康对象为对照组,然后采取荧光定量法检测HBV—DNA含量,微粒子酶免疫法检测HBV原抗体的表达,流式细胞术检测外周血T细胞亚群。结果HBV抗原抗体含量分为HBeAg阳性和HBeAg阴性,例数分别为50例、30例,对照组的CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋含量均明显高于HBeAg阳性组及HBeAg阴性组的CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋的含量（P〈0．05）。HBeAg阳性组及HBeAg阴性组的CD3^＋、CD4~．CD8^＋的含量比较无明显的差异（P〉0．05）。HBV—DNA含量分为三个亚组,〈104IU／mL组、（104--106）IU／mL组和（107--10。）IU／mL组,例数分别为20例、25例、35例。对照组、〈104IU／mL组和（104—10‘）U／mL组以及（10’～10。）U／mL组的CD3^＋比较具有明显差异（P〈0．05）;对照组和（107～10s）U／mL组的CD4^＋含量比较具有明显的差异（P〈0．05）,有统计学意义;对照组和（10^4—10^6）IU／mL组以及（10^7-10^8）IU／mL组的CD8^＋比较差异有统计学有意义（P〈0．05）。（10L106）IU／mL组和（10^7-10^8）IU／mL组的CD8啥量均明显高于〈104IU／mL组,差异有统计学有意义（P〈0．05）。结论临床中乙肝患者的HBV抗原抗体和病毒载量均与T细胞亚群之间存在联系,并且其不同含量的T细胞亚群也存在差异,均异于常人。因此,临床中可以通过测定病毒载量与T细胞亚群,并有效了解患者的机体免疫状况,从而更好地指导临床治疗。