血清剥夺与β-巯基乙醇联合诱导孕足月羊水干细胞向神经元样细胞分化

背景:羊水干细胞是一种新的干细胞来源,具有不同于成体间充质干细胞的生物特性.目前有关羊水干细胞的研究多数以孕中期羊水为基础,对孕足月羊水所知甚少.目的:探讨孕足月羊水干细胞向神经元分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-10/2008-08在解放军总医院妇产科及解放军军事医学科学院干细胞及再生医学研究室完成.材料:孕足月羊水来自在解放军总医院行剖宫产、排除胎儿畸形的孕38～40周健康孕妇.方法:贴壁法从羊水中体外分离培养羊水干细胞,胰酶-EDTA消化传代.取第四五代细胞,用含1 mmol/L β-巯基乙醇、体积分数为20%胎牛血清、10 μg/L碱性成纤维生长因子的低糖培养基预诱导24 h,去除培养液,洗涤后加入含5 mmol/Lβ-巯基乙醇的无血清低糖培养基向神经元方向诱导4.0～5.0 h:对照组不加任何诱导剂.主要观察指标:孕足月羊水干细胞的形态及免疫表型,诱导后向神经元样细胞的分化.结果:培养的羊水干细胞呈梭形,漩涡状排列,间质干细胞来源标志CD105,CD29及1类组织相容性抗原HLA-ABC均呈阳性表达,胚胎干细胞标志性基因SSEA-4亦呈阳性表达,不表达造血干细胞标志.诱导后,细胞形态发生明显改变,胞浆回缩,出现类似轴突的细长的两极或多极突起,免疫荧光染色神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达.结论:在血清剥夺与β-巯基乙醇联合诱导条件下,孕足月羊水干细胞具有向神经元样细胞分化的潜力.     

人脂肪间充质干细胞的分离培养及其遗传稳定性

背景:研究发现脂肪间充质干细胞核型具有不稳定性,且干细胞移植后长期安全评价等问题尚未从根本上得到解决.目的:观察体外分离培养的人脂肪间充质干细胞传代培养的遗传稳定性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/11在解放军兰州军区兰州总医院骨科研究中心完成.材料:成人腹部大网膜脂肪组织来源于单纯性阑尾炎患者,由解放军兰州军区兰州总医院普通外科提供.方法:胶原酶消化法体外分离培养人脂肪间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养基吹打细胞沉淀,过滤后于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度条件下培养,待细胞生长至70%～80%融合时消化传代.分别取第3,25,30代脂肪间充质干细胞进行相关指标检测.主要观察指标:脂肪间充质干细胞表面标志表达、细胞增殖、核型分析、超微结构电镜观察、恶性肿瘤特异性生长因子的表达.结果:第3代脂肪间充质干细胞CD13,CD44,CD59均呈阳性表达,而造血干细胞表面标志CD34及成纤维细胞表面标志HLA-DR均呈阴性表达:染色体的形态、结构和数目均未见异常,呈二倍体结构;镜下可见完整的高尔基复合体,数量较多的粗面内质网,部分糖元颗粒分布在胞浆中.第25代脂肪间充质干细胞分裂增殖作用强于第3代脂肪间充质干细胞;多条染色体出现断裂畸变,并且染色体数目出现异常,呈亚二倍体或超二倍体核型;核仁增大,异染色质及线粒体数量增多,内质网数量少,细胞较为幼稚.第3,25,30代脂肪间充质干细胞恶性肿瘤特异性生长因子的表达吸光度值无明显差异(P>0.05).结论:分离获得的人脂肪间充质干细胞长期体外培养具有遗传不稳定性,有向肿瘤细胞突变的倾向.     

Turner综合征羊水干细胞的分离及特征

背景：羊水干细胞的分离培养及生物学特性相关研究取得了明显进展,但未见45,X／46,XX（Turner综合征）羊水细胞建系的报道。目的：建立体外培养人羊水来源干细胞的方法,初步探讨羊水干细胞的生物学特性。方法：孕中期羊膜腔穿刺获得1例染色体核型异常（45,X／46,XX）羊水标本,采用梯度稀释后低密度种植的方法获得羊水干细胞,体外传代培养,倒置显微镜观察细胞的贴壁生长情况,细胞染色体检查确认核型,流式细胞仪检测羊水干细胞特异性表面标志和细胞周期,进行成骨诱导分化及碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定。结果与结论：羊水干细胞在体外培养体系中增殖迅速,核型为45,X／46,XX,流式细胞仪检测羊水干细胞表达CD29、CD44、CD90和CD105间充质干细胞表面标志,不表达造血干细胞标志CD45和CD34：大部分细胞处于G1期,增殖能力强。羊水干细胞经成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性。结果可见该实验成功分离获得45,X／46,XX（Turner综合征）羊水干细胞,其增殖能力强,表现间充质干细胞的特性。     

人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性

背景:高效、稳定地获得大量较高纯度的人脂肪干细胞,是其在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。目的:探索体外培养脂肪干细胞的适宜条件,从而提高其增殖能力。方法:采用胶原酶消化的方法,从人腹部皮下块状脂肪中分离出脂肪干细胞,经贴壁筛选法纯化细胞、低糖培养基体外培养扩增。Giesam染色后观察细胞形态;绘制细胞生长曲线并进行细胞周期分析,观察分析传代后染色体核型改变;选取第3代脂肪干细胞做流式细胞鉴定、EdU细胞增殖能力检测以及克隆形成实验。结果与结论:分离培养的原代脂肪干细胞形态不一,经传代后的细胞形态趋于长梭形,排列紧密呈漩涡状生长。细胞生长曲线呈S形,细胞周期分析及EdU掺入法结果显示体外培养的脂肪干细胞具有较强的增殖能力。经染色体核型分析结果提示,体外培养不会引起脂肪干细胞的核型改变。第3代脂肪干细胞经流式细胞仪检测CD29,CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34和CD45呈阴性;克隆形成率为8.8%;在一定的诱导条件下,脂肪干细胞能够向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果说明采用胶原酶消化法可成功分离培养人脂肪干细胞,且具有较强的增殖能力。     

孕中期羊水干细胞的生物学特性的研究

目的对孕中期羊水标本进行体外分离、培养、扩增,研究孕中期羊水来源干细胞(AFC)的生长特性、细胞表面标记。方法采用贴壁法体外分离孕中期羊水来源干细胞,绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标记。结果原代培养细胞生长潜伏期4-6d,对数增殖期7-13d,生长平台期14-18d;传代培养细胞生长潜伏期1-2d,对数增长期3-6d,生长平台期7-10d。AFCs均一表达CD44,不表达CD45。结论从人孕中期羊水中成功分离具有干细胞性质的细胞群,在体外可迅速扩增。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的特征

目的:分离培养兔脂肪间充质干细胞,探讨兔脂肪间充质干细胞在体外向神经细胞分化的能力。方法:实验于2002-09/2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。选取清洁级新西兰大白兔5只,采用Ⅰ型胶原酶消化兔腹股沟皮下脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞。取生长状况良好的第2,5,10代细胞,绘制生长曲线,计算细胞群体倍增时间。采用免疫组化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志[CD14,CD29,CD34,CD44,CD45,CD105及人白细胞抗原DR亚类(群)]进行鉴定,并采用1,2.5,5,10mmol/L不同浓度的β-巯基乙醇检测脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的能力。结果:①脂肪间充质干细胞生长曲线分析:第2,5,10代细胞体外传代培养的潜伏期约为24～48h,传代培养细胞的对数增殖期为6d,接种后第9天进入平台期。在细胞生长的对数期,脂肪间充质干细胞的倍增时间为64.12h。②脂肪间充质干细胞分子特征的鉴定结果:第2～5代细胞90%以上CD29,CD44,CD105呈阳性表达,而不表达CD14,CD34,CD45及人白细胞抗原DR亚类(群)等表面分子标记。③脂肪间充质干细胞向神经细胞分化情况:体外能够分化为神经细胞。结论:兔脂肪组织可分离培养出脂肪间充质干细胞,并能够向神经细胞分化,有望成为组织工程的种子细胞来源。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足.目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性.方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达.取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定.冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率.结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态.传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期.间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达.具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性.     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞的生物学特性比较

背景:除骨髓外,人们已从胎盘组织、脐带血肌肉组织、脂肪组织中分离到了间充质干细胞.目的:比较大鼠脂肪和骨髓间充质干细胞生物学特性和免疫调节功能的差异.方法:脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞分别来自BN大鼠的脂肪和骨髓.体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,进行细胞形态、表面标志、生长动力学、分化潜能鉴定;混合淋巴细胞反应比较两种细胞的免疫调节特性.结果与结论:脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞光镜和透射电镜下形态相似,第3代的脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均高表达CD29,CD90,低表达CD34,CD45,CD11b;第3,4,5代脂肪间充质干细胞增殖速度明显快于骨髓间充质干细胞;两者都具有低免疫原性,可以抑制异基因抗原引起的T淋巴细胞增殖,且这种抑制作用与细胞数目成正相关,等量脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞抑制作用差异无显著性意义.结果证实脂肪间充质干细胞具有和骨髓间充质干细胞同样的低免疫原性和免疫调节功能.     

两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征

背景:目前对干细胞的体外分离纯化技术大多是建立在对细胞表面标记识别的基础之上,包括单抗贴壁铺展法、流式细胞分选法、免疫磁珠分选法等,但操作复杂,价格昂贵.目的:观察两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征.设计、时间及地点:开放性实验,于2008-03/2009-03在新疆医科大学干细胞研究室完成.材料:10例羊水标本来自怀孕16～22周行产前诊断或自愿引产的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得20～40 mL羊水.方法:采用改进的两步培养法分离和培养人羊水间充质干细胞,首先同一步法将羊水标本离心、接种、培养至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落.然后将上清培养液转移至新的25 cm~2培养瓶中继续培养,至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落且达70%汇合后消化,改用α-MEM培养基,同样添加碱性成纤维细胞生长因子,接种培养,记为第1代.主要观察指标:①原代及传代羊水间充质干细胞形态学变化.②羊水间充质干细胞细胞核型、细胞周期、生长曲线和集落形成能力测定.③流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测表面抗原和细胞因子.结果:实验成功分离、培养和传代人羊水间充质干细胞.①孕中期羊水细胞原代培养平均7 d可见散在的梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落;传代细胞在12 h内完全贴壁,经过一两天潜伏期后增殖迅速,培养六七天可达90%融合,细胞排列有一定的方向性,呈漩涡状、辐射状排列,细胞为长梭形,相互之间界限不清.②两种方法得到的羊水间充质干细胞染色体核型为正常二倍体核型;生长曲线均呈S形,但两步法在第(6.1±0.5)天就达到高峰,显著快于一步法第(7.2±0.6)天(P=0.035).流式细胞仪检测结果显示两步法羊水P3细胞S期细胞占(14±2.3)%,显著多于一步法(9.0±1.4)%(P=0.031).两种方法获得的羊水间充质干细胞低密度种植7 d后,均可形成散在的细胞集落,但两步法集落形成率为(15.0±2.3)%,显著多于一步法(10.0±1.8)%(P=0.021).③流式细胞仪检测结果显示,羊水间充质干细胞表达CD44、CD29、CD105,而CD34、CD45、HLA-DR阴性;免疫荧光检测表明羊水中含有Oct-4阳性细胞,但两步法羊水间充质干细胞中Oct-4阳性细胞比例为(1.2±0.3)%,显著高于一步法(0.9±0.2)%(P=0.041);RT-PCR分析表明两种方法获得的羊水间充质干细胞均表达Oct-4.结论:人羊水中也存在间充质干细胞,两步培养法是一种高效、简便实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法.     

体外分离培养人皮下脂肪干细胞的生物学特性及影响因素

目的:研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪源性干细胞,并表现出向多谱系细胞分化的特点.对来源于人皮下脂肪组织的脂肪干细胞进行体外培养,观察其形态特点、生物学特性及间充质来源细胞表面相关标志的表达.方法:实验于2005-11/2007-02在泸州医学院医学分子生物学实验室完成.①对象:行切疤植皮术的正常体质量患者8例,年龄16～45岁,均无传染性疾病,来源于泸州医学院烧伤整形科,实验前征得患者同意.②实验方法:人脂肪干细胞的分离、培养与传代:无菌条件下取患者新鲜的皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化 贴壁法获取原代脂肪干细胞,生长至70%融合时传代,观察细胞的形态学变化.当原代细胞的胞质中出现较多透亮液滴后,行油红O染色.将第3代脂肪干细胞冻存,1个月后复苏,观察细胞的生长情况.选择生长状态良好的第3代脂肪干细胞,苏木精-伊红染色观察细胞形态,SABC法检测间充质来源细胞特异性标志波形蛋白的表达,SP法检测间充质干细胞表面相关抗原CD44的表达.取处于对数生长期的细胞,绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间.结果:①原代和传代过程中人脂肪干细胞的形态学变化:原代和传代培养的细胞均为长梭形贴壁生长.当原代细胞达到50%融合后,部分细胞由梭形逐渐变为多角形或椭圆形,胞质内出现油红O染色阳性的脂滴.传代细胞中此现象逐渐消失,且经冻存后复苏的活细胞率达80%以上,细胞生长、增殖能力未受影响.②间充质来源细胞表面标志的鉴定:第3代人脂肪干细胞的胞质丰富,HE染色弱嗜碱性,呈淡蓝色;波形蛋白阳性率为(97.1±2.3)%,CD44阳性率为(85.4±3.22)%.③人脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间:传代培养的脂肪干细胞生长曲线呈"S"形,群体倍增时间为62.38h.结论:从人皮下脂肪组织分离培养出的脂肪干细胞,在体外扩增和冷冻保存后生物学特性稳定,且具有良好的增殖能力,表达间充质来源细胞表面标志波形蛋白和表面抗原CD44.