草鱼潜在过敏原α-烯醇化酶原核表达条件的优化

目的 通过对草鱼α-烯醇化酶(α-Enolase)原核表达的条件进行优化,分别从表达的上清液与包涵体中纯化获得重组α-Enolase。方法 本研究基于前期克隆的草鱼α-Enolase基因序列设计表达引物,将草鱼α-Enolase基因克隆至pET-30a质粒中,得到pET-30a-α-Enolase重组质粒。然后,将重组质粒转入大肠杆菌Origami 2(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside, IPTG)进行体外诱导表达。采用SDS-PAGE电泳方法分析重组蛋白的可溶性,并对表达条件进行优化.。利用亲合层析法纯化目的蛋白。结果 在20℃诱导15 h得到的重组蛋白以二种形式存在：一部分为可溶性蛋白存在于上清液中,一部分以包涵体形式存在于沉淀中;在37℃诱导4 h得到的重组蛋白则只有包涵体形式。包涵体蛋白表达量最大的优化条件为：诱导温度为37℃,IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导时间4 h时。采用亲合层析法分别纯化上清液(20℃诱导15 h)和包涵体中(37℃诱导4 h)的重组蛋白,得率分别为3.5 mg /100 mL和4.9 mg/100 mL菌液。结论 利用原核表达从上清液与包涵体中均可纯化得到重组α-Enolase。但这二种α-Enolase在生物活性与免疫原性是否存在差异性,以及通过重组α-Enolase是否可以代替天然蛋白用于鱼类过敏原的研究,有待进一步研究。     

乳源性免疫活性肽在E.coli BL21中分泌表达的诱导条件优化

设计4个乳源性免疫活性肽的目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pTYB11,并将重组质粒转化到E.coli BL21中,通过改变异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)的浓度、培养时间和培养温度,设计正交试验来优化乳源活性小肽的IPTG诱导表达条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。依据15% SDS-PAGE电泳分析得到融合蛋白的表达量,选出最适诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.2mmol/L,在12～15℃条件下培养20h,得到大小为59.2kD左右的融合目的蛋白,其表达量可占总蛋白表达量的40%,经Western Blotting鉴定正确。     

花生过敏原Ara h 1蛋白的原核表达及致敏性分析

从花生中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到花生过敏原Ara h 1基因,构建pET-28a-Ara h 1表达载体,转入Rosetta（DE3）宿主表达菌中诱导产物表达,用镍离子亲和层析法纯化得到目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的蛋白分子质量约为75 kDa,与预计相符;经质谱鉴定为Ara h 1蛋白。用BALB/c小鼠模型评价重组Ara h 1蛋白的致敏性结果显示,重组Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特异性抗体、Th2型细胞因子、组胺含量升高,空肠和肺组织发生病变,表明重组Ara h 1蛋白可以导致小鼠发生Th2型过敏反应,且有与天然Ara h 1蛋白相似的致敏性。同时RBL细胞模型结果显示重组Ara h 1蛋白还可导致RBL细胞脱颗粒,释放β-己糖苷酶,进一步表明重组Ara h 1蛋白具有致敏性。     

金黄色葡萄球菌噬菌体qdsa001内溶素的特性预测及克隆表达

为获得噬菌体qdsa001的内溶素,本实验首先利用多种在线软件对内溶素lys56（GenBank：ARQ95812.1）的理化性质、信号肽、跨膜域和结构域等特性进行分析,然后选择克隆表达法制备目的蛋白。将合成的目的基因插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET-30a-lys56,转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中,获得表达稳定的基因工程菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,利用镍琼脂糖亲和层析纯化表达产物。经在线软件预测结果显示,该蛋白分子质量为35.1 kDa,无信号肽和跨膜域,仅含有一个Ami_2结构域。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示重组蛋白表达成功,且以可溶性蛋白的形式存在于细胞破碎上清液,分子质量约35?kDa,与预期蛋白大小一致。重组蛋白最佳表达条件为：IPTG浓度0.5?mmol/L,20?℃过夜诱导。     

牛奶主要过敏原β-乳球蛋白的一基因片段的克隆、表达、纯化及抗原性鉴定

目的 克隆并表达牛奶中主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的一基因片段,并检测其杭原性.方法 利用RT-PCR技术克隆β-LG蛋白基因片段,测序后将目的片段克隆入原核表达质粗pET载体,转化至大肠杆菌origami,经IPTG诱导表达,获得重组β-LG片段蛋白.用Nit~2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELLSA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性.结果 克隆获得β-LG片段蛋白,其开放阅读框基因为264 by(含终止密码子),编码87个氨基酸.获得的重组β-LG片段蛋白既以包涵体形式存在又以可溶性形式存在,用可溶性的蛋白进行纯化,经Western blot和ELISA检测具有较好的抗原性.结论 成功地克隆和表达了β-LG的--基因片段,为后续牛奶的免疫原性研究提供参考,也为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体和制备其主要过敏原的检测试剂奠定了基础.     

D-乳糖醇代替异丙基-β-D-巯基半乳糖苷对重组蛋白诱导表达的影响

目的:用D-乳糖醇代替异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)作为诱导剂,诱导重组葡萄糖苷酶的表达。方法:首先通过单因素试验探讨D-乳糖醇浓度、诱导时间及诱导温度对重组葡萄糖苷酶表达的影响,从而确定最佳影响因素的水平值,然后在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面法对重组葡萄糖苷酶表达进行优化分析,依据回归分析方法确定最佳诱导工艺条件。结果:最佳诱导工艺条件为D-乳糖醇的诱导终浓度1.0 mmol/L、诱导时间7.0 h、诱导温度34℃。结论:D-乳糖醇可以代替IPTG作为一种高效的lac及其衍生物的启动子基因工程重组蛋白的理想诱导剂。     

牛β-防御素BNBD11基因在大肠杆菌中的表达

探索牛β-防御素BNBD11原核表达及纯化的技术路线。根据已报道的BNBD11的氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计合成BNBD11基因。构建重组表达载体pET32a-BNBD11,转入E.coli BL21,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。经SDS-PAGE检测融合蛋白结果显示,大部分表达产物以可溶形式存在,用Ni Sepharose柱层析纯化融合蛋白。融合蛋白经甲酸切割后,再次用Ni Sepharose柱层析去除带有His-Tag的杂蛋白,最终得到纯化的重组BNBD11。实验实现了BNBD11在大肠杆菌中的融合表达,并纯化了获得的重组BNBD11。     

酶解作用对牛乳β-lg抗原性影响的研究

牛乳β-乳球蛋白(β-lg)是胎儿出生后遇到的第一个外来过敏原,并且它是导致牛乳蛋白过敏的主要过敏原。胰蛋白酶对β-lg的水解作用可以导致其空间三维结构的变化,但是该酶诱导β-lg蛋白结构变化对其致敏性影响的意义还不清楚。为了探明水解作用对β-lg致敏性或者抗原性的影响,利用小鼠动物模型从体外(脾淋巴细胞增殖)和体内(IgE水平和组胺水平)两个方面研究了水解作用对β-lg致敏性的影响。体外细胞增殖实验结果表明,和β-lg水解物相比,β-lg能够显著刺激脾淋巴细胞增殖(P=0.01);ELISA方法检测小鼠血清和小肠液IgE(免疫球蛋白E)抗体水平结果表明β-lg组小鼠血清IgE水平要高于β-lg水解物刺激组小鼠(P=0.03),而小肠液中IgE水平和血清IgE水平变化趋势一致,但是整体水平要显著高于血清(P=0.002)。血浆组胺实验表明β-lg免疫组小鼠血浆中组胺水平明显高于β-lg水解物免疫组(P=0.001)。     

单核细胞增多性李斯特菌p60蛋白表达条件的优化

在成功构建重组表达载体pET-28a-p60 和获得重组宿主菌E.coli BL21(DE3)的基础上,对重组宿主菌E.coliBL21(DE3)进行表达p60 蛋白条件的优化研究。结果表明：将重组大肠杆菌培养至OD600nm 达0.7～0.8 左右时,加入浓度为1mmol/L 的异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),在摇床温度为25℃,转速为150r/min 条件下诱导表达6h,可得到重组表达的p60 蛋白占总蛋白的比例为42.32%,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白的比例为85.36% 左右,为p60 蛋白诱导表达的最优条件。     

类芽孢杆菌属β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中可溶性重组表达的优化

目的:β-葡萄糖苷酶在食品工业领域具有广泛的应用价值,但重组表达时容易形成无活性的包涵体。通过传统诱导条件优化无法完全解决包涵体积累问题,需探索新的策略。方法:从类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp)基因组中克隆获得了β-葡萄糖苷酶基因bgl,构建到大肠杆菌表达载体p ET28a获得重组质粒p ET-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)获得重组菌BL-ETbgl,并进行诱导条件优化。进一步通过复制起始位点替换,构建了新型大肠杆菌表达载体p ACYT-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)后得到改进型重组菌BL-ATbgl。结果:BL-ETbgl经诱导表达后,所表达重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。经诱导条件优化后,仍有40%蛋白以包涵体存在。而BL-ATbgl经诱导表达后,可溶性的重组β-葡萄糖苷酶约占80%。自诱导培养基中β-葡萄糖苷酶产量可达2.31×106U/L。结论:通过降低质粒拷贝数、优化培养条件等手段,可以大幅度提高类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的可溶性表达水平。     

重组原核表达载体pQE-30-luxS的构建与表达

构建原核表达载体pQE-30-luxS,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白.以植物乳杆菌KLDSI.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增luxS基因,同时克隆到pMD18-T simple中,经鉴定正确后与表达载体pQE-30连接,将重组质粒pQE-30-luxS转化到E.coli M15中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE鉴定.结果表明原核表达载体pQE-30-luxS构建成功,测序证实插入的目的片段与已知luxS基因序列一致,且LuxS蛋白在大肠杆菌中成功表达.该结果为体外合成信号分子AI-2奠定了基础.     

重组人α-乳清白蛋白潜在致敏性的生物信息学预测

目的 通过生物信息学分析预测牛乳腺生物反应器表达的重组人α-乳清白蛋白(rhLA)的致敏性.方法 使用在线致敏原数据库(The Allergen Online Database)、致敏蛋白结构数据库(Structural Database of Allergenic Proteins)和食品安全致敏原数据库(Allergen Database for Food Safety),分析目标蛋白与已知致敏原的序列或结构相似性.结果 rhLA致敏性的生物信息学分析结果显示,rhLA与已知致敏原牛α-乳清白蛋白、牛乳糖合酶B蛋白(致敏原Bos d 4)、鸡溶菌酶C(1,4-β-N乙酰胞壁质酶C、致敏原Gal d Ⅳ、致敏原Gal d 4)存在较高的序列或结构同源性.结论 rhLA具有潜在的致敏可能性.     

超高压处理对乳清分离蛋白结构及致敏蛋白含量的影响

以乳清分离蛋白为研究对象,通过测定圆二色性光谱、巯基含量以及内源性荧光光谱等研究了不同超高压水平(100、200、400和600 MPa)对其二级、三级结构的影响,并采用水解度测定、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及2个标志性致敏蛋白(β-乳球蛋白和α-乳白蛋白)含量的检测来解析超高压对乳清分离蛋白致敏性的影响。结果表明,超高压处理能够使乳清分离蛋白的α-螺旋和β-转角部分转化为β-折叠和无规则卷曲,可以增强乳清分离蛋白的巯基含量,在400 MPa时,表面巯基含量提高了104.82%,也造成了乳清分离蛋白内源性荧光强度的显著变化以及最大吸收波长的红移,电泳图谱以及水解度未显示出明显差异。通过酶联免疫吸附实验原理检测致敏蛋白含量发现,超高压可以使α-乳白蛋白含量显著减少,但是,400 MPa的超高压处理却使β-乳球蛋白含量增加。综上表明,超高压处理能够显著改变乳清分离蛋白的二级、三级结构,暴露出结构内部的疏水基团,并对致敏蛋白产生影响。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

紫红链霉菌2917磷脂酶A_2在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达与复性

通过化学合成紫红链霉菌2917分泌型磷脂酶A2全基因序列后插入融合表达载体pGEX-6P-1中,经酶切和测序鉴定无误后转化E.coli Rosetta(DE3)菌株,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得目的蛋白后对包涵体形式的重组蛋白进行稀释复性,同时对复性后的蛋白进行酶学研究.结果表明磷脂酶A2基因在大肠杆菌中获得了高效表达(占总细胞蛋白30%),复性后酶液酶活性为0.15U/mL。这将为包涵体的复性研究以及磷脂酶A2结构和功能的研究打下良好的基础。     

噬菌体基因Ⅴ蛋白基因的合成、重组表达及功能分析

目的:研究丝状噬菌体基因V蛋白(gene V protein,GVP)基因的合成、重组表达及其功能。方法:根据GVP的基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计合成了8个寡核苷酸片段,利用重叠延伸PCR合成GVP基因序列,将其与原核表达载体pET-28a-c(+)质粒重组,转化大肠杆菌,获得GVP蛋白阳性表达菌株,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,产物经Ni+-NTA琼脂糖凝胶层析纯化,获得目的蛋白GVP,DNA结合实验检测其功能。结果:成功合成出GVP基因,重组体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导获得高效表达,DNA结合实验表明GVP与单链DNA间解离平衡常数Kd=7.27×10-5mol/L。结论:重组构建并高效表达的GVP蛋白具有较高单链DNA结合能力,可用于食品病原微生物特定单链DNA分子的浓缩和分离。     

人源β-N-乙酰葡糖胺转移酶I（h-GnT-I）的原核表达与活性鉴定

-β--N-乙酰葡糖胺转移酶I（-h-GnT-I）功能为在高尔基体中向糖蛋白上的N-寡糖M5GN2结构添加一个-β--1,2 连接的N-乙酰葡糖胺。为大量获得具有活性的-h-GnT-I蛋白,构建了重组表达质粒pET28a-MGAT1?驻TM并将其在大肠杆菌Rosetta菌株中表达。对诱导条件进行优化后,将获得的可溶性重组蛋白His-hGnT-IΔTM进行镍柱亲和纯化并通过高效液相色谱（HPLC）检测其体外活性和底物特异性。结果表明,大肠杆菌ROSETTA体系可以成功表达可溶性重组hGnT-I蛋白;该蛋白质相对分子质量约为42 800,在体外反应中具有相应的糖基转移酶活性;除天然糖链底物M5GN2外,该蛋白质可以识别非天然糖链底物M3GN2;产物经酶切反应验证,证明该蛋白质催化添加一个β糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺的反应。本研究所开发的原核表达体系可以大量制备纯化的功能性重组hGnT-I蛋白,以应用于该蛋白质的性质研究以及N-糖链的体外合成。     

大豆球蛋白A1a酸性多肽的原核表达及纯化

为建立大豆球蛋白免疫检测方法及致敏机理的深入研究提供基础材料,人工合成了大豆球蛋白A1a酸性多肽基因的cDNA序列,通过聚合酶链式反应(PCR)和Bam HI、Kpn I双酶切构建了原核表达载体pET30a-A1a,将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE分析表明,A1a酸性多肽融合蛋白能以可溶蛋白形式进行分泌表达,并且诱导5h后,A1a酸性多肽融合蛋白表达量达到最高。经His亲和层析纯化,获得纯度达90%的融合A1a蛋白,分子质量大小约为38kD。Western blotting显示,所获得的A1a融合蛋白能与对豆粕过敏的仔猪血清发生免疫反应,表明所获得融合蛋白具有免疫活性。     

pfs基因原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

以植物乳杆菌KLDS1.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到pfs基因,与Gen Bank中的序列对比发现同源性为99%。将目的基因与表达载体p QE-30连接,并将重组质粒p QE-30-pfs转化到E.coli M15中。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在全菌体蛋白中含有一条明显的特异性蛋白条带,大小约为27.4ku。经Ni-NTA纯化系统纯化后,在SDS-PAGE凝胶电泳图上获得纯化产物的条带。结果表明,原核表达载体p QE-30-pfs构建成功,且Pfs蛋白在大肠杆菌中成功表达,采用Ni-NTA纯化系统成功纯化了重组蛋白Pfs,为体外合成AI-2(Autoinducer-2)奠定了基础。     

酶解作用对牛乳乳清蛋白抗原性影响的研究

为了探明胰蛋白酶水解作用对乳清蛋白致敏性或者抗原性的影响,利用小鼠动物模型从体外和体内两个方面研究了水解作用对乳清蛋白致敏性的影响.结果表明,酶解物中β-乳球蛋白抗原性降低率为53.92％,α-乳白蛋白抗原性降低率为82.31％.酶解组小鼠过敏症状较未水解的乳清分离蛋白(WPI)组相比明显减轻.与WPI组相比,酶解物显著抑制特异性IgE的产生,IgE质量浓度下降了40.55％.血浆组胺实验表明,酶解物降低血浆中组胺的释放,组胺质量浓度比WPI组下降了28.72％.