自发性狼疮小鼠高IgG血症遗传易感基因定位及多态性分析

目的 :定位自发性狼疮小鼠高 Ig G血症遗传易感基因 ,并比较自身与非自身免疫病小鼠间该易感基因是否存在多态性。方法 :建立 (NZB× NZW) F1 × NZW回交小鼠模型 ,采用覆盖小鼠 19条染色体的微卫星多态标记及数量性状位点 (QTL)分析进行基因定位 ,并应用扩增片段长度多态性分析 (Am p FL P)比较该易感基因的多态性。结果 :高 Ig G血症易感基因与小鼠 1号染色体末端微卫星多态标记 Dl Mit36肯定连锁 (L ods值 >3) ,该位点附近存在Fcgr2 b基因 ,且回交小鼠 Fcgr2 b基因 B/ W型组血清总 Ig G水平明显高于 W/ W型组 (P <0 .0 0 0 1) ;自身免疫病NZB小鼠 Fcgr2 b基因启动子区核酸片段长度短于非自身免疫病 NZW、C5 7BL/ 6及 BAL B/ C小鼠。结论 :(NZB×NZW) F1 小鼠高 Ig G血症易感基因为 NZB来源的 Fcgr2 b基因。 NZB小鼠该基因启动子区可能存在碱基缺失     

新西兰小鼠血清抗DNA抗体水平的研究

目的::研究新西兰小鼠NZB、NZW、及其杂交子代(NZB×NZW)F1小鼠血清抗DNA抗体的水平差异.方法:酶联免疫吸附分析检测新西兰小鼠血清IgG及IgM型抗dsDNA及抗ssDNA抗体滴度.结果:与亲代NZB及NZW相比,其F1子代小鼠IgG型抗dsDNA及抗ssDNA抗体滴度明显增高(P＜0.01),IgM型抗dsDNA及抗ssDNA抗体滴度则比NZW增高(P＜0.01),比NZB反而降低.结论:致病性IgG型抗DNA抗体是促使新西兰小鼠狼疮发病的主要原因.     

新西兰狼疮鼠抗染色质抗体易感基因染色体定位研究

目的确定新西兰小鼠自身抗染色质抗体的遗传易感基因染色体定位.方法建立新西兰黑色品系(NZB)与新西兰白色品系(NZW)F1×NZB回交小鼠模型.采用覆盖小鼠19条染色体的微卫星遗传标记及数量性状位点(QTL)分析进行基因定位.结果确定了自身抗染色质抗体产生的两个遗传易感基因,一个位于NZW小鼠第9染色体中段30厘摩临近;另一个易感基因位于NZW小鼠第17染色体近中心端19厘摩处(Lods值＞3).结论(NZB×NZW)F1小鼠自身抗染色质抗体的产生受多基因调控,候选易感基因不仅来自于NZB,也来自于NZW.     

狼疮鼠淋巴细胞IgG2aV_H区反义RNA重组体的构建及鉴定

目的 :构建系统性红斑狼疮 (SLE)鼠模型 (NZW×NZB)F1淋巴细胞IgG2aVH 区反义RNA表达重组体 ,为SLE基因治疗提供基础。方法 :采用逆转录—PCR技术克隆狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH 区cDNA ,经T/A克隆再定向插入表达载体pcDNA3.1,并经酶切电泳 ,PCR ,DNA测序鉴定分析。结果 :经鉴定 ,证明成功构建了表达狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH 区的重组体。结论 :BWF1和鼠淋巴细胞中存在IgG2aVH 区 ,其表达型重组体可用于IgG2aVH 的大量复制.     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠

目的应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

Uncv无毛小鼠无毛基因的分子克隆及序列分析

目的 探讨Unev无毛小鼠的无毛性状与无毛基因(hairless gene,hr)的相关性.方法 参照Gen-Bank上公布的小鼠的hr序列,设计5对引物,用RT-PCR方法对本单位培育的Unev无毛小鼠hr的编码区序列进行了克隆与分析.结果 获得了Unev无毛小鼠及野生型hr的全部编码区序列(3546 bp).Unev无毛小鼠hr基因与野生型小鼠hr基因的长度及序列完全一致,同源性为100%.与GenBank上发表的国外小鼠hr基因序列(Z32675)相比,同源性为99.7%,共10个碱基发生了突变,其中2个碱基突变导致了相应的氨基酸突变;和昆明小鼠的hr(AY547391)相比,同源性为99.6%,共12个碱基发生了突变,其中3个碱基突变导致了相应的氨基酸突变;但这些突变是由种属差异造成的.结论 Uncv无毛小鼠的无毛性状产生与hr基因无关.     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠的研究

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法 针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果 设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

大肠癌相关基因ST13转录启动区的增强子研究

目的:探讨大肠癌相关基因ST13上游5'近端调控区(-595～ 74)中增强子碱基序列.方法:设计系列缺失PCR引物,扩增ST13基因5'近端碱基序列片段,pGEMT-EASY克隆、测序,再亚克隆到pGL2系列瞬间报告载体上,等量转染SW620细胞,检测荧光酶活性.结果:系列扩增碱基序列片段669 bp、263 bp、163 bp对pGL2-Basic中的荧光素酶基因均具有较强的启动表达作用,片段101 bp、47 bp则几乎没有启动下游基因表达的作用.而101 bp片段与系列报告载体pGL2重组的分子,在其中含有启动子的报告基因表达载体中具有明显的增强作用(P＜0.01),但作用强度小于阳性对照pGL2-Control(P＜0.05).结论:位于ST13基因上游5'近端调控区的碱基序列101 bp片段(-595～-494),是一个基因转录调控增强子.     

小鼠TLR4基因的克隆和序列分析

目的:克隆小鼠TLR4基因的全长编码区cDNA并进行序列分析. 方法:利用RT-PCR方法,从Balb/c小鼠脾组织细胞mRNA中扩增TLR4基因全长cDNA,并将其连接到pcDNA3.1( )载体上,进行测序和核酸分析.结果:扩增得到的小鼠TLR4基因cDNA全长2 508 bp,编码536个氨基酸, Blast结果分析表明,该cDNA与基因库中发表的序列(NM021297)具有100%的同源性.结论:获得小鼠TLR4基因的克隆,为进一步研究转基因免疫干预奠定了基础.     

利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠

目的利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠。方法针对miR-223基因设计双重sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9 mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miR-223在肝脏中的表达。结果设计了miR-223基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细胞获得miR-223基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6 bp的缺失突变,但未对miR-223序列产生影响;另外两种为162 bp和168 bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列。与野生型相比,这两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达。结论设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-223全基因敲除小鼠。     

20例ABO血型抗原表达异常样本的血型基因分析

目的 探讨20例样本ABO血型抗原表达减弱的分子生物学机制。方法 采用微柱凝集法及盐水试管法进行ABO血型血清学鉴定;对ABO基因第1-7外显子及其上游启动子区域PCR产物直接测序进行基因分型。结果 11例样本通过家系分析可以确定其基因型（1例ABO*A2.01/ABO*B.01,1例ABO*A2.01/ABO*O01.01,1例A1.02/B3.04,2例B3.04/O.01.01、2例B3.02/O.01.02,4例Bw.12/O.01.01）;3例样本在ABO基因启动子区域发生-35_-18位的碱基缺失,通过家系分析,提示该变异发生在B等位基因;1例样本在ABO基因启动子区域发生-119位C>T变异;1例样本发生第7外显子1054位点缺失碱基C;4例样本在ABO血型基因1-7外显子及其调控区域未发现变异。结论 启动子区域-119位C>T变异及Exon7 1054del变异可能是导致ABO血型抗原异常表达的新变异;部分ABO亚型可能与内含子异常或mRNA合成异常有关;本地区B亚型明显多于A亚型。     

乙型肝炎病毒核心抗原基因疫苗对小鼠的体液和细胞免疫原性观察

目的 观察不同品系小鼠（Ｈ－２＾ｂ,Ｈ－２＾ｄ）经乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）基因疫苗免疫后特异性辅助性Ｔ细胞反应类型和特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。方法 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法鉴定该基因疫苗的体外表达产物;基因枪法和肌内注射法接种该基因疫苗;间接ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）水平;＾５１铬释放法测定小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。结果     

胰岛素启动子因子1基因启动子区G3/G4多态性与鲁北地区糖尿病发病的关联研究

目的研究IPF1基因启动子区G3/G4多态性位点与鲁北地区汉族人群糖尿病的相关性。方法选择2型糖尿病96例、1型糖尿病36例及正常对照组100例作为研究对象,对IPF1基因启动子区G3/G4多态性位点进行PCR扩增,PCR产物纯化后,经ABI PRISM 3700 DNA全自动测序仪直接测序,然后进行基因分型,并通过相关分析,研究该位点与糖尿病的相关性。结果对照组与1型、2型糖尿病组的基因型频率和等位基因频率分布差异无统计学意义(χ2=8.566,P=0.073,χ2=5.944,P=0.051)。结论IPF1基因启动子区G3/G4多态性位点与中国汉族人群糖尿病无显著相关性,暂不能作为预测中国汉族人发生糖尿病危险性的遗传学标志。     

LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的:LAPTM4B基因是肝癌中高度表达的新基因.为下一步LAPTM4B启动子的活性分性,本文构建了LAPTM4B基因启动子调控的报告基因重组表达质粒.方法:以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列.PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,并经限制性内切酶消化鉴定.结果:通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了三种不同长度的pGL3-LAPTM4B-Luc荧光素酶表达质粒,形成了系列的LAPTM4B启动子重组体.结论:充分利用生物信息学资源,利用已知基因的启动子序列,可快速,准确地克隆已知基因启动子序列并构建启动子载体.LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建为LAPTM4B启动子的活性分析奠定了基础.     

2型糖尿病PAI-1基因启动子区4G／5G基因多态性与胰岛素抵抗

目的 探讨2型糖尿病血浆纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）及其基因启动子区4G／5G多态性及其胰岛素抵抗的关系。方法 对近2年来我院诊断为2型糖尿病的住院患者156例，通过检测血浆纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1），并进行PCR扩增PAI-1基因启动子区4G／5G基因多态，同时测定血糖水平、糖化血红蛋白（GhbAl）、空腹血胰岛素、血浆胆固醇、甘油三脂，并与有关因素作相关分析研究PAI-1与胰岛素抵抗的关系。结果 （1）T2DM组与正常组相比，PAI-1基因型频率分布有明显的统计学差异，等位基因频率无明显统计学意义。（2）2型糖尿病组4G／4G组PAI-1水平显著高于其他两组。（3）对照组中3组基因型的PAI-1水平、TCH、TG、LDL-C、HDL-C、空腹胰岛素、HOMA差异均无显著性。（4）T2DM组3组基因型的PAI-1水平、TCH、TG、LDL-C、HDL-C、FBG、空腹胰岛素、HOMA均明显高于对照组中相应基因型者。在4G／4G组，PAI-1水平与BMI、TG、空腹胰岛素、WC、HOMA都有关。结论 在2型糖尿病中，PAI-1水平与PAI-1基因启动子区基因型有关；PAI-1水平与胰岛素抵抗有关，且PAI-1水平和甘油三酯和空腹胰岛素的关系与PAI-1基因启动子区基因型有关。     

深圳市乙肝疫苗免疫失败者S基因分析

目的了解乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因的变异情况。方法采用流行病学、ELISA与分子生物学方法,筛选乙肝疫苗免疫失败者。采用聚合酶链反应（PCR）、基因克隆和测序的方法,对乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因进行分析,并与HBV参考序列s基因进行比较,分析其变异情况。结果从2564份受检者中．筛选出2例（0．78％e）HBsAg（-）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）乙肝疫苗免疫失败者（HBsl、HBs2）,经HBVDNA荧光定量PCR检测和HBVS基因PCR扩增,结果均为阳性,为B基因型。其S基因序列与参考序列（JX429908．1）相比,同源性为98．57％,且乙肝疫苗免疫失败者s基因在第363位和第467位分别由野生型的C变为A、G变为A,HBsAg121位和156位氨基酸C和w缺失。结论乙肝疫苗免疫失败者HBVS基因上第363位和第467位碱基存在错义突变（C→A和G→A）,改变了HBsAg的结构和抗原性。     

肝炎基因诊断芯片对丙型肝炎病毒基因分型检测的初步研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）基因分型诊断芯片的制备和其对丙型肝炎患者血清HCVRNA基因分型诊断的准确性。方法 根据丙型肝炎病毒5′端非编码区末端（5UTR）和C区设计引物和特异性探针,将设计的20条特异性寡核苷酸探针用核苷酸合成仪合成后,配制成浓度为50μmol/ml的点样液,用点样仪点到特殊处理的玻片介质上,制成丙型肝炎病毒基因分型诊断芯片,收集HCVRNA阳性的丙型肝炎患者血清60份作为实验组,健康人血清60份作为对照组,用荧光定量PCR仪对两组血清进行HCVRNA定量检测,实验组血清HCVRNA含量均大于500拷贝/ml,对照组血清HCVRNA含量均小地500拷贝/ml,两组血清进行HCVRNA分离纯化,逆转录反应,巢式PCR扩增后,分别用基因芯片,HCVRNA核酸序列测定法（美国Li-Cor核酸序列测定仪）进行双盲丙型肝炎基因分型检测。结果 实验组血清基因诊断芯片检测均为阳性;基因分型;1b型46例,3a型3例。3b型3例,2a型2例,2b型2例,混合型1b 2a2例。1b 3b型2例;核酸序列测定分型1b型50例,3a型3例,3b型3例,2a型2例,2b型2例;基因诊断芯片检测和核酸序列测定检测的基因分型结果符合率为93.3%。对照组血清基因芯片检测匀阴性。结论 肝炎病毒基因诊断芯片可以用于检测血清HCVRNA,并进行基因诊断分型,准确率较率。     

NF-κB1基因启动子区插入/缺失(ATTG)多态性与膀胱移行细胞癌易感性的关系

目的 了解核因子-κB1(NF-κB1)基因启动子区插入/缺失(ATTG)多态性与膀胱癌易感性的关系.方法 采用聚合酶链反应(PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测207例膀胱移行细胞癌患者(膀胱癌组)和228例健康者(对照组)的NF-κB1基因型,并进行对比分析.结果 膀胱癌组的ATTG2等位基因频率(65.2%)明显高于...     

中国人群中HIV-1辅助受体CCR5基因新突变位点及CCR5-894C缺失基因多态性分析

目的：研究中国人群HIV-1辅助受体CCR5基因编码区新的单核苷酸多态性（SNP）位点;分析CCR5-894C缺失等位基因在中国普通人群和HIV-1高危人群中的分布特点和相关意义。方法：针对CCR5编码区用2对引物进行PCR扩增,设计测序引物对45例汉族人样本进行PCR产物直接测序,用DNAstar分析测序结果,寻找SNP位点。采用错配PCR-RFLP法对中国汉族、蒙族、藏族普通人群,性传播疾病和静脉吸毒高危人群及HIV-1携带者,共627份样品进行了CCR5-894C缺失等位基因分型。结果：在45例汉族人CCR5基因编码区共发现6个SNP位点,4个（184A→G、503G→T、668G→A、99G→T）引起氨基酸改变,两个无义突变;此外还发现1个单碱基缺失（894C缺失）,引起移码突变和提前终止。其中184A→G、503G→T、999G→T三个中国汉族人所特有的SNP位点为首次发现,它们的等位基因频率分别为1.11％,21.1%和10.0％;其中503G→T分布明显不符合Hardy-Weinberg平衡。汉、藏、蒙等民族的普通人群CCR5-894C缺失等位基因频率为1.11％,0.53%和0.在汉族HIV-1性传播、静脉吸毒传播的高危人群中,HIV-1阳性个体和阴性个体间CCR5-89C缺失等位基因频率差异无显著意义,与汉族普通人群比较差异也无显著意义。结论：中国人CCR5基因的SNP位点有自己的特点,共发现4个引起氨基酸改变的SNP位点（其中3个为首次发现）,1个引起移码突变的单碱基缺失。汉族人群中存在CCR5-894C缺失突变,但突变频率很低。这些SNP和缺失突变对于HIV-1感染和艾滋病病程的影响值得进一步研究。