泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白表达载体的构建及肝癌细胞中的表达

目的构建人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白真核表达载体,并转染肝癌细胞,筛选建立稳定转染细胞株。方法从构建好的pMD19-T/UbcH10载体中PCR扩增UbcH10基因,PCR产物双酶切后克隆入pEGFP-N1真核表达载体中,构建真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10,进行双酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1利用脂质体Lip2000TM分别转染进入肝癌细胞SMMC7721中,建立肝癌细胞SMMC7721的G418细胞死亡曲线,选择G418的筛选浓度,经G418结合荧光显微镜观察筛选稳定转染细胞。将筛选获得的肝癌细胞进行有限稀释法单克隆化,收集单个细胞克隆扩大培养备用。结果经双酶切和测序鉴定,带有荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10构建成功,经脂质体介导真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1成功转入肝癌细胞SMMC7721中,经800μg/mL G418筛选并进行单克隆化获得稳定转染的细胞株SMMC7721-pEGFP-N1和SMMC7721-pEGFP-N1/UbcH10,阳性转化率达到9...     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

人Survivin基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的:研究Survivin在肝癌细胞中的表达定位。方法:用RT-PCR的方法从肝癌组织中获取Survivin基因,并克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,获得重组质粒pEGFP-Survivin,再转染到肝癌细胞SMMC-7721中,利用载体上的GFP跟踪其细胞内定位。结果:成功克隆了Survivin基因,经DNA测序与人Survivin基因完全一致。重组质粒pEGFP-Survivin成功转染到人肝癌细胞SMMC-7721中,并观察到GFP表达于肝癌细胞的胞浆中。结论:重组质粒pEGFP-Survivin能成功构建。     

pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒的构建及在肝癌细胞系HepG2中稳定高表达

目的 建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1稳定表达的HepG2肝癌细胞系.方法 设计NY-ESO-1的引物,PCR法从NY-ESO-1阳性表达的睾丸癌组织中扩增出目的片段,克隆至T载体,双酶切后定向连入pCDNA3.1载体,构建pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒.经酶切、PCR、测序检测其构建的正确性,脂质体转染法将重组质粒转入HepG2细胞,G418药物筛选出稳定转染的细胞系,RT-PCR法、间接免疫荧光法分别检测稳定转染HepG2细胞中NY-ESO-1基因、蛋白的表达水平.结果 构建的pCDNA3.1/NY-ESO-1质粒经酶切、测序等检验表明质粒构建成功,筛选获得稳定高表达NY-ESO-1的HepG2细胞.结论 构建了pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒及稳定高表达NY-ESO-1的HepG2细胞株,为下一步以NY-ESO-1为靶标进行肝癌的抗原特异性免疫治疗研究奠定了实验基础.     

STAT3-shRNA-pGenesil稳定表达载体的构建与应用

目的:构建siRNA的DNA稳定表达载体,为研究RNAi在哺乳动物内持续、稳定抑制靶基因表达奠定基础.方法:合成含靶向STAT3基因的siRNA转录模板的发夹结构,将载体质粒pGenesil-1用BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到肝癌SMMC-7721细胞中进行稳定筛选、表达,检测稳定筛选前后STAT3基因的表达变化.结果:重组质粒在大肠杆菌菌株JM109内扩增.提纯、纯化后经PCR及测序鉴定证明STAT3-siRNA转录模板完整、正确地插入到pGenesil-1质粒中,建立了稳定抑制STAT3基因的SMMC-7721细胞株,并在mRNA水平抑制了肝癌SMMC-7721细胞STAT3基因表达.结论:成功构建了STAT3-shRNA-pGenesil稳定表达载体,能在哺乳动物细胞中表达,并初步应用于靶基因的抑制.     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

目的：构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法：利用RT-PCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段,将其克隆到pCR-Blunt Ⅱ-TOPO载体和pcDNA3.1（＋）表达载体,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1-hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC-7721对其表达状况进行检测. 结果：所获得的hANG片段（1.1 kb）序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1-hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1-hANG的人肝癌细胞SMMC-7721表达了血管抑素. 另外,从生长曲线结果来看,转染pcDNA3.1-hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC-7721和未转染的SSMC-7721细胞的生长速度无明显差别. 结论：成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC-7721肝癌细胞,为开展下一步的实验奠定了基础.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

真核表达载体pEGFP-N1-hSyntenin的构建及其在人脑胶质瘤细胞CHG-5中的表达

目的 构建pEGFP-N1-hSyntenin基因真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞CHG-5中的表达.方法 采用RT-PCR技术从人脑肿瘤组织中扩增hSyntenin,并将PCR产物双酶切后定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1-hSyntenin重组质粒.经过菌落PCR、双酶切及测序验证后,采用脂质体转染技术将pEGFP-N1-hSyntenin融合基因转染CHG-5细胞表达,G418筛选建立稳定表达hSyntenin的CHG-hS细胞系.采用荧光检测和免疫印迹技术分析hSyntenin在稳定转染的CHG-5细胞系中的表达.结果 菌落PCR鉴定出1个阳性克隆,阳性克隆经双酶切鉴定得到分别与载体和目的 片段大小一致的4.7 kb和897 bp的两条片段,测序证实目的 基因hSyntenin正确连接到pEGFP-N1的多克隆位点;pEGFP-N1-hSyntenin重组体稳定转染CHG-5细胞后,细胞荧光检测结果显示hSyntenin在CHG-5细胞质发出绿色荧光,免疫印迹检测可见32×103处的阳性条带.结论 成功构建pEGFP-N1-hSyntenin重组质粒,并在人脑胶质瘤细胞CHG-5中获得稳定表达.     

鼠源性血管抑素cDNA在人肝癌细胞SMMC-7721中的稳定表达及意义

目的 将血管抑素基因转染入人肝癌细胞SMMC－7721中,观察其表达效果衣其对细胞本身的影响,并探讨血管抑素治疗动物种植性肿瘤的效果。方法 将鼠源性血管抑素基因插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建重组质粒,用HindⅢ和XbaⅠ双酶切及基因测序进行鉴定。然后用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-mAST转染入人肝癌细胞SMMC－7721中,并行RT－PCR鉴定和Western-blot检测其表达效果。结果 鼠血管抑素基因成功克隆人真核表达载体pcDNA3.1( )中;经脂质体法转染入SMMC－7721细胞并获稳定表达;转染血管抑素和未转染血管抑素的SMMC－7721细胞生长速度无明显差异。结论 鼠血管抑素基因在人肝癌细胞SMMC－7721中可获稳定表达,但对细胞本身生长无明显抑制作用。     

凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达.方法:RT-PCR扩增Survivin编码序列,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,利用GFP绿色荧光和WesternBlot检测Survivin蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出421bp的Survivin编码序列,构建融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin,利用GFP荧光和Western Blot证实Sur-vivin蛋白的表达.结论:成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达.     

腺病毒介导的THANK基因在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建THANK腺病毒载体,观察腺病毒感染后THANK在SMMC-7721细胞中的表达情况.方法:把THANK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒,再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取THANK重组腺病毒,以不同感染复数(MOI)腺病毒感染SMMC-7721细胞,观察腺病毒对SMMC-7721细胞的感染情况.结果:成功地构建了THANK腺病毒,该腺病毒可高效介导THANK在SMMC-7721细胞中表达,基因转染后第5天,THANK表达高于35 ng/ml,且随时间延长增加.结论:腺病毒可诱导THANK基因在SMMC-7721细胞中高表达.     

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

目的：构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法：采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测 GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果：重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312 bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3　的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论：成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。     

稳定表达外源性p16基因肝癌SMMC-7721细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达外源性p16基因的肝癌SMMC-7721细胞株。方法利用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3．1( ),将外源性p16基因转染入此基因表达下调的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中,经G418筛选,建立稳定表达的细胞株,用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫组织化学法鉴定p16基因的表达,同时对细胞株分泌蛋白进行活性检测。结果转染p16基因的SMMC-7721细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达。结论建立稳定表达P16抑癌蛋白的SMMC-7721细胞株有助于研究p16抑癌基因在肝癌发生中的作用。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

Replication-incompetent Adenovirus Vector-mediated MDA-7/IL-24 Selectively Induces Growth Suppression and Apoptosis of Hepatoma Cell Line SMMC-7721

In order to investigate the effect of replication-incompetent adenovirus vector expressing MDA-7/IL-24 on tumor growth and apoptosis of human hepatocellular carcinoma （HCC） cell line SMMC-7721 and normal liver cell line L02, the recombinant replication-incompetent Ad.mda-7 virus vector was constructed and infected into the HCC cell line SMMC-7721 and normal liver cell line L02. RT-PCR was performed to examine the expression of MDA-7 mRNA. The concentrations of MDA-7/IL-4 in culture superuatants were determined by using ELISA. MTT and Hoechst staining assay were applied to observe the inhibitory and killing effects of MDA-7 on the HCC cells. By using flow cytometry, the apoptosis, cell cycle and proliferation of SMMC-7721 and L02 cells were measured. The results showed recombinant replication-incompetent virus expressing MDA-7/IL-24 was constructed successfully, and RT-PCR revealed that it could mediate the high expression of the exogenous gene MDA-7/IL-24 in SMMC-7721 and L02 cells. The expression of MDA-7/IL-24 proteins in the culture superuatant was detectable by ELISA. Ad.mda-7 infection induced apoptosis and growth suppression in SMMC-7721 cells and an increased percentage of HCC cells in the GyM phase of the cell cycle, but not in L02 cells. It was concluded that mda-7/IL-24 gene, mediated with replication-incompetent adenovirus vector, could selectively induce growth suppression and apoptosis in HCC cell line SMMC-7721 but without any toxic side-effect on normal liver line L02.     

pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达

目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。