紫红笛鲷过敏原的提取、分离及其免疫学特性鉴定

目的对紫红笛鲷过敏原进行提取、分离及免疫学特性鉴定。方法新鲜紫红笛鲷经预处理后用PBS缓冲液制备总蛋白粗浸液,SDS-PAGE分析紫红笛鲷总蛋白的组成,免疫印迹(Western-blotting)分析紫红笛鲷过敏原,通过离子交换层析对总蛋白粗浸液进行分离并鉴定不同组份的免疫学特性。结果紫红笛鲷可溶性蛋白粗提液SDS-PAGE显示有20条蛋白条带,对鱼过敏病人的阳性混合血清能与其中7个条带反应,分子量分别是42000,36000,30000,27000,25000,17000和12000Mr。离子交换层析后分子量为42000、36000、12000Mr的阳性过敏原蛋白具有免疫学活性。结论本实验对紫红笛鲷过敏原进行了提取、分离和免疫学特性鉴定,离子交换层析技术可以用于紫红笛鲷过敏原蛋白的分离纯化,为紫红笛鲷过敏原的进一步研究和鱼类食品过敏的防治奠定了理论基础。     

河虾中主要过敏原组分鉴定及分离纯化

目的鉴定并分离纯化河虾中引起过敏反应的主要蛋白组分。方法河虾蛋白浸液皮下注射建立小鼠过敏模型，获得高效价特异性IgE血清用于免疫印迹分析。用饱和硫酸铵分段盐析和DEAE离子交换层析纯化目的蛋白。dot-ELISA及竞争ELISA检测纯化目的蛋白的过敏原活性。结果河虾蛋白浸液皮下注射成功建立了虾过敏小鼠模型。免疫印迹分析显示虾中有一分子量36kD的蛋白组分为主要过敏原。用硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析的方法成功分离到目的蛋白。dot-ELISA证明目的蛋白能与特异性IgE反应。竞争ELISA检测纯化目的蛋白与河虾蛋白浸液竞争结合特异性IgE的活性，最大竞争抑制率可达60％。结论本实验成功鉴定并分离到河虾中一分子量为36kD的主要过敏原组分，为过敏原的分析研究提供了一套比较完整的方法。     

带鱼过敏原的分离、鉴定与纯化

目的分离、鉴定和纯化带鱼特异性过敏原。方法采用Coca’s提取液提取带鱼蛋白；十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western—blotting分析其中的过敏原；阴离子交换层析对过敏原进行分离纯化。结果带鱼粗浸液蛋白分子量在8～130kDa之间；Western—blotting检测到分子量为12、18、25、27、29、34、38、54和60kDa的过敏原蛋白；通过离子交换层析分离得到较纯的分子量为18、38kDa的过敏原蛋白，且具有免疫活性。结论发现了带鱼中多种过敏原，并对2种过敏原分离纯化，为带鱼过敏的诊断和治疗奠定了理论基础。     

小鼠肝脏免疫抑制蛋白质的分离和纯化

我们应用硫酸铵分段盐析,结合多种离子交换柱层析和羟磷灰石柱层析,从正常小鼠肝浸液中分离纯化出一种免疫抑制蛋白质,在体外它能很强地抑制小鼠T和B淋巴细胞对促有丝分裂原和同种异型抗原的增生反应。纯化的免疫抑制蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电聚焦电泳鉴定均为一条带,其pI值在7.5～7.8之间。Sephadex G-100凝胶层析测得纯化蛋白质的分子量为78,000,SDS-PAGE测得此蛋白质亚基的分子量为38,500。同时经初步鉴定,此纯化的蛋白质既非糖蛋白又非脂蛋白。     

妊娠特异性β1糖蛋白的分离纯化及特异抗血清的制备

本文采用硫酸铵盐析、DE-52离子交换层析、Sephadex G-200凝胶过滤及抗SP_1免疫亲和柱层析等方法从胎盘后血分离妊娠特异性β_1民糖蛋白(SP_1)所得SP_1纯化约207倍.纯化的SP_1与德国Behringwerke AG的SP_1抗血清在双向免疫扩散时有沉淀反应;免疫电泳时纯化SP_1移动的位置与β蛋白相当.聚丙烯酰胺凝胶电泳时纯化的SP_1呈现一条主带其分子量为90,000左右.免疫家免所得的抗血清经血浆蛋白吸收后得特异SP_1抗血清在双向免疫扩散时与正常男子或非孕妇女血清均无沉淀反应;与孕血反应形成的沉淀线与德国Behring werke AG的SP_1抗血清所形成的沉淀线相连;交义免疫电泳时呈现一个峰.此抗血清已成功地用于建立酶联免疫法测定SP_1含量     

系统性红斑狼疮特异性抗原60KD Ro/SSA的提取和纯化

目的建立从猪脾纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法.方法从猪脾提取ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀结合离子交换层析分离ENA蛋白组分,并用对流免疫电泳检测60KD SSA抗原的活性,以得到纯化60KD SSA抗原的具体条件.结果 60KD SSA抗原在Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中的硫酸铵沉淀范围是硫酸铵饱和度50%～60%.60KD SSA抗原在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3) NaCl中的DE52离子交换层析洗脱范围为电导值35～40ms/cm.结论结合硫酸铵沉淀和DE52离子交换层析两种纯化方法所得的60KD SSA抗原相对于其它ENA有较高的纯度,并能有效分离中SSA中60KD、52KD两个组分.     

兔血清白蛋白和IgG的分离纯化与鉴定

目的：以兔血清白蛋白和IgG的分离纯化与鉴定实验为例，阐述了血清蛋白制备与分析的过程。方法：使用了硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析、DEAE离子交换层析、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS—PAGE、HPLC等分离纯化鉴定蛋白质的方法。结果：制备了兔血清白蛋白和γ-球蛋白（IgG），测定被分离物质的相对分子量，鉴定纯化产品的均一性。结论：该实验作为一门生物综合性大型实验，非常有利于培养学生掌握蛋白质制备与分析的综合技能。     

蝎毒促增殖肽在大鼠骨髓间充质干细胞上靶蛋白的初步研究

目的研究蝎毒促增殖肽Bmkpp在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的靶点。方法采用Sepha-dex G-50凝胶层析和CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换层析从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化出蝎毒促增殖肽Bmkpp,RP-HPLC检测,酶解-质谱鉴定;提取大鼠BMSCs全蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白后上样到Bmkpp亲和层析柱,洗脱收集靶蛋白峰,超滤离心法脱盐浓缩;SDS-PAGE电泳分析洗脱蛋白。结果分离纯化出Bmkpp和其相邻的峰4,RP-HPLC检测分离纯化的Bmkpp纯度达95%。酶解质谱法鉴定其与Bmkpp标准品的主要成分一致。一步亲和层析洗脱峰均为2个,电泳结果显示胞浆洗脱蛋白条带较多,但细胞膜无结合蛋白条带。改变盐浓度分步梯度洗脱全蛋白共得4个峰,1 mol/L NaCl盐浓度分步洗脱全蛋白于13、14、40、260 kD处有4条较明显的电泳条带。结论 Bmkpp在BMSCs上作用于多个靶点并有其特异性的靶标。     

结缔组织生长因子特异性结合肽的表达及分离纯化

目的:利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的小肽。方法:设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段,插入pET-32(a) 质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游,构建重组质粒,转入E.coliBL21表达菌中,用终浓度1mmol.L-1的IPTG诱导表达融合蛋白;用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化,然后用亲和层析进一步纯化,经肠激酶切割,最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽;用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果:所构建的重组质粒测序结果与预期一致;诱导表达后用SDS-PAGE鉴定,发现在相对分子质量20 000处有浓密的表达条带出现,与预期一致;融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化,得率分别为78.6%和52.3%;用亲和层析纯化得率为50.5%;经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽,用反相色谱鉴定其纯度大于95%;最终每升发酵液获得3.4 mg目的肽。结论:成功制备CT-GF特异性结合肽,为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。     

广西眼镜蛇毒中Natrin蛋白的分离及纯化

目的:从广西眼镜蛇毒中分离出Natrin蛋白.方法:广西眼镜蛇毒经SephadexG75凝胶、CM Sepharose CL-6B离子交换层析及FPLC mono-S柱层析分离纯化出Natrin蛋白.结果:从广西眼镜蛇蛇毒中分离纯化得到的Natrin蛋白,经SDS-PAGE电泳测定其分子量为25 ku,质谱测定其分子量...     

粉尘螨Der f2变应原的分离纯化及其特征

目的 用粉尘螨（Dermatophagoides farinae）代谢培养基浸液（Dff）分离纯化粉尘螨2类变应原（Der f2）。方法 Sephadex G-100层析、DEAE离子交换层析、PAGE等方法分离纯化Der f2,并对Der f2作SDS-PAGE测定和热稳定性测定。结果 从Dff分离纯化得到较纯Der f2,经SDS-PAGE测定其相对分子质量为14000,并经100℃加热15min后,仍保留50%～83.3%生物学活性。结论 从Dff中分离纯化的变应原,其物化性质符合Der f2特征。     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的：从蝮亚科尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)并对其理化性质进行研究。方法：应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFLE，用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其相对分子质量，用皮内出血实验测定其出血活性。结果：从短亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶，它的相对分子质量为25000，没有出血活性，在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白，相对活性为粗毒的3．2倍。结论：从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为25000的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性，而无出血活性的单一的纤维蛋白溶解酶。     

免疫活性地龙肽的制备及其对小鼠NK细胞活性的影响

目的:提取低分子量免疫活性地龙肽,并就其对自然杀伤(NK)细胞活性的影响进行体外研究。方法:采用粗分离、凝胶过滤层析和阴离子交换层析等方法分离纯化地龙肽;采用乳酸脱氢酶法测定NK细胞活性。结果:用凝胶过滤层析分离得到地龙肽T(分子量8000～20000,含有7种蛋白)。用离子交换层析又将地龙肽T分为A、B两部分,地龙肽A由5种蛋白组成,其中有4种分子量在13000以下;地龙肽B仅由一种蛋白构成,分子量约11000;地龙肽A和T可明显提高NK细胞的活性;地龙肽A、B和T皆可减弱环磷酰胺和地塞米松的免疫抑制作用,提高NK细胞的杀伤率。结论:地龙肽T、A单独应用即可以增强NK细胞的活性,并与IL-2具有协同作用;地龙肽T、A和B还可以拮抗地塞米松、环磷酰胺等免疫抑制剂。     

普通念珠藻中多糖的分离纯化研究

目的 揭示少腹逐瘀汤（SZD）对布洛芬在大鼠体内药动学特征及代谢产物的影响。方法 采用HPLC-DAD法定量分析SZD与布洛芬合用后布洛芬药动学参数的变化;采用UHPLC-QTOF-MS联用方法,利用碰撞能量梯度（MS^E）和质量亏损过滤（MDF）技术,对SZD与布洛芬合用后布洛芬在血浆、尿液、粪便中的代谢产物变化进行研究。结果 单独给予布洛芬其在大鼠体内吸收较快,0.5 h达峰,与不同剂量SZD合用后,t_max均延长（P＜0.01）,C_max均为下降趋势,但与布洛芬组比较无统计学差异;布洛芬与临床等效量的SZD合用后,AUC显著增高（P＜0.05）,提示其生物利用度提高,表观清除率降低;与5倍临床剂量的SZD合用后,t_1/2z显著降低（P＜0.05）。服药2 h后,布洛芬与不同剂量SZD合用后其血药浓度下降均较布洛芬组缓慢。布洛芬单用时其代谢产物主要为2′-羟基布洛芬、2′-羟基布洛芬-葡萄糖醛酸苷、2′-羧基布洛芬和布洛芬-葡萄糖醛酸苷;与SZD合用后,在血浆、尿液、粪便中共发现17个布洛芬的代谢物,其中粪便中存在羟基化产物、降解产物、乙酰化产物、羟基硫酸化产物等;血浆中存在去甲基化产物、羟基化产物、乙酰化产物以及硫酸酯化产物等;尿液中代谢产物除半胱氨酸共价结合物外与布洛芬单用时一致。结论 布洛芬与SZD合用后,其在大鼠体内的药动学过程发生变化,且该变化与SZD的剂量存在一定关系,为二者临床联合用药及进一步揭示其药效变化与机制提供了一定参考。     

家蚕蚕蛹变应原的鉴定、分离与纯化

目的鉴定、分离和纯化大造(Dazao)品系家蚕(Bombyxmori)的蚕蛹粗提液中的变应原蛋白质组分,为家蚕变应原的蛋白质组学和功能基因组学深入研究奠定基础。方法采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blotting,鉴定了家蚕蚕蛹粗浸液中变应原蛋白质分子,并通过阴离子交换和凝胶过滤层析分别对家蚕蚕蛹变应原蛋白质进行初步纯化。结果在家蚕蚕蛹粗浸液中含有表观分子量分别为80000及30000的蚕蛹变应原;从家蚕蛹全虫粗提液中初步分离到分子量为30000的蛹变应原蛋白组分。结论分离得到的家蚕蚕蛹变应原蛋白组分可用于系统研究家蚕过敏原蛋白分子的蛋白质组学和功能基因组学。     

悬铃木属花粉的纯化及免疫活性分析

目的对悬铃木属花粉变应原进行初步纯化并对其主要成分进行免疫学活性分析。方法悬铃木属花粉变应原粗制浸液经过凝胶过滤层析，收集主要蛋白质，SDS-PAGE检测各段蛋白质分子量，并用免疫印记法分析7例悬铃木属花粉过敏的支气管哮喘患者血清。结果悬铃木属花粉变应原粗制液经层析柱洗脱得两个洗脱峰，第一峰及第二峰升段富含蛋白，而第二峰降段蛋白含量甚微，收集各段进行SDS—PAGE。出现6条蛋白区带，分子量分别为7、50、35、39、22和16kd。第一峰主要含22-71kd蛋白质，峰2升段以14-16kd之蛋白质为主。对7例花粉过敏的支气管哮喘患者血清免疫印记分析可见4条sIgG反应带，蛋白分子量为50、39、22和16kd，病人血清结合百分比分别为100％、28．57％、57．14％和14．29％。结论悬铃木属花粉变应原含有6种主要蛋白成分，第一峰的50、39和22kd的蛋白质为主要致敏组分，第二峰升段的16kd蛋白质为次要致原。     

藜草花粉变应原免疫活性分析

目的:分析藜草花粉变应原成分及其变应原性、免疫原性.方法:用Sephacryl S-200HR葡聚糖凝胶层析法分离、纯化藜草花粉变应原,通过十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉法(SDS-PAGE)测定变应原各组分的分子质量;应用免疫印迹法检测各组分蛋白质与藜草花粉过敏性哮喘患者血清中sIgG和sIgE的反应率.结果:藜草花粉经电泳后得到12条蛋白质区带,分子质量依次为92,63.1,61,52,45,43,39.7,38.9,34,31.6,28.4和18.5～12 ku;免疫印迹可见4条sIgE反应带,蛋白分子质量依次为92,34,31.6和18.5～12 ku;与患者血清反应率分别是70%,50%,80%和90%;与血清sIgG结合的反应带有8条,蛋白分子质量为92,61,52,45,43,39.7,31.6和18.5～12 ku;与患者血清反应率分别是80%,40%,10%,20%,80%,10%,10%和100%.结论:藜草花粉变应原主要含12种蛋白质成分,其中分子质量为18.5～12 ku和92 ku的蛋白质变应原活性及免疫原活性均很强,是主要变应原成分;分子质量在34和31.6 ku的蛋白质有较强的变应原性而无或仅有较弱的免疫原性;而分子质量为43,61,45,52和39.7 ku的蛋白质具有一定的免疫原性而无变应原性.     

血链球菌血链素的分离纯化及其化学组成的测定

目的:分离纯化血链球菌血链素,并对其组成成分进行检测。方法:通过羟基磷灰石(HA)柱层析、SephadexG-150凝胶柱层析、中空纤维柱超滤脱盐、浓缩,分离并纯化血链素,SDS-PAGE检测其纯度及亚基分子量并检测其分子量,同时以紫外线吸收法及苯酚-硫酸法检测血链素蛋白及糖含量。结果:血链素分子量为180kDa,亚基分子量为110kDa和70kDa,其中蛋白含量为87.51%,糖含量为12.49%。结论:纯化的血链素是一种由两个亚基组成的糖蛋白。     

放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白的提取及纯化

目的:对大肠杆菌表达的放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白LTB-FAP进行提取和纯化,为其用于牙周病的治疗提供理论依据.方法:将重组质粒pET28a/LTB和pET28a/LTB-FAP分别转化到大肠杆菌中进行表达,通过超声裂解法获得以包涵体形式表达的重组外源蛋白LTB-FAP;用2,4,6和8 mol·L-1尿素缓冲液对重...