肿瘤坏死因子-α在椎间盘细胞凋亡中的作用

<正>椎间盘退变是引起慢性下腰痛的重要原因[1],引起椎间盘退变的具体原因目前还不清楚,但椎间盘细胞,特别是髓核细胞,对维持正常的椎间盘结构与功能具有重要作用[2]。髓核细胞增殖与凋亡平衡的破坏对椎间盘的退变起到了重要作用[3]。近年来,炎性细胞因子在椎间盘退变中作用备受关注[4]。Peng[5]研究发现,由炎症反应所产生的细胞因子对加速椎间盘退变起到了重要作用。但目前导致椎间盘细胞凋亡的原因和机制并不十分明确,肿     

NF-κB信号通路的激活与椎间盘退变的关系

[目的]探讨NF-κB信号通路在椎间盘退变中的激活机制及其作用。[方法]按照Pfirrmann椎间盘退变分级系统对患者进行分级,分别收集2012~2013年上海市第一人民医院手术患者的正常和退变椎间盘组织(退变102例,正常9例),生化检测试剂盒测定椎间盘组织中丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)含量;凝胶迁移试验(EMSA)检测细胞核内NF-κB蛋白结合活性;RT-PCR和Western blotting检测凋亡相关分子CHOP和Caspase-3表达。[结果]椎间盘退变组织中MDA、MPO水平较正常对照组明显增加;EMSA显示髓核细胞核中NF-κB活性增高;RT-PCR和Western blotting结果显示椎间盘退变组织中凋亡相关分子CHOP和Caspase-3水平明显增高。[结论]髓核细胞受氧化应激作用后可通过激活NF-κB通路导致细胞凋亡从而在椎间盘退变中发挥作用。     

椎间盘再生研究进展

近年来对椎间盘退变 (intervertebraldiskdegeneration ,IVDD)的分子生物学发病机制进行了方兴未艾的研究。虽其确切的发病机制尚不清楚 ,但大多数学者认为 :细胞因子减少和炎症因子增多 ,导致基质金属蛋白酶活性增加 ,细胞外基质降解加速 ,髓核进行性脱水 ,椎间盘细胞生存的内环境被破坏 ,出现IVDD[1～ 3 ] 。提出应用基因治疗和组织工程相结合的椎间盘再生 (intervertebraldiskregeneration ,IVDR )治疗新思路[4 ] 。1　细胞生长因子与IVDR1991年 ,ThompsonJP等检测了椎间盘中的细胞对各种生长因子的反应。从犬椎间盘髓核、纤维环…     

髓核移植的临床应用与基础研究进展

椎间盘退变导致性腿痛是骨科常见病之．尽管椎间盘切除术或椎体融合术可以取得一定治疗效果，但并非是针对椎间盘退变本身的治疗。术中不可避免会破坏椎间盘和椎体附件的正常结构，引起继发性脊柱不稳，加速卡日邻椎间盘的退变，所以远期效果并不理想。髓核移植是近年来用于治疗早期椎间盘退变的一种新技术，从临床和基础研究可分为人工髓核移植、自体髓核或髓核细胞移植、同种异体髓核或髓中核细胞移植二个方面。     

共培养技术促干细胞向类髓核细胞分化的研究进展

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是一系列脊柱退行性疾病的病理生理基础,并可由此导致椎间盘突出、椎管狭窄、脊椎滑脱及退行性侧凸等[1],是引起腰痛的主要原因之一,对于椎间盘退变性疾病的治疗,目前主要有保守治疗及手术治疗两种方法,但均不能从组织学上根本逆转椎间盘退变.通过细胞治疗等生物学方法修复退变椎间盘是脊柱外科基础研究的热点.近年来,国内外学者在共培养技术促干细胞向类髓核细胞分化方面取得了较大进展,笔者就干细胞与髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)体外共培养的研究进展综述如下.     

雌激素α、β受体在大鼠椎间盘组织中的免疫组织化学定位

[目的]探讨雌激素α、β受体(ERα、ERβ)在大鼠椎间盘组织的定位和分布.进一步探讨ER与椎间盘退变的关系,对早期预防和治疗椎间盘退变提供一定的理论依据.[方法]用免疫组织化学染色法(Elivison二步法)检测大鼠关节软骨,椎体终板及椎间盘组织中ER-α,ER-β的表达及分布情况.[结果]免疫组织化学染色见ER-α,ER-β在椎体骨组织中表达明显,在终板软骨组织表达较为明显,在髓核组织中均有表达,在纤维环中未见表达.[结论]在大鼠的髓核组织中的髓核细胞(类软骨细胞)中存在ER.     

海藻酸钠复合多能诱导干细胞修复椎间盘研究

[目的]探讨海藻酸钠盐微球凝胶复合多能诱导干细胞(induced pluripotent stem cells, IPS)定向分化的髓核细胞对退变椎间盘修复作用。[方法] 50只新西兰大白兔分为5组,10只作为正常对照组,40只建立兔椎间盘退变模型,并随机分为4组,每组10只。模型组不行治疗,材料组注射不含髓核细胞的海藻酸钠盐微球凝胶材料,细胞组注射诱导分化的髓核细胞,联合组注射IPS定向分化的髓核细胞与海藻酸钠盐微球凝胶材料复合物,治疗8周后,采用组织学Mankin评分评估各组椎间盘软骨退变情况;采用免疫组化分析各组椎间盘组织蛋白多糖、Ⅱ型胶原和MMP3的表达水平。[结果]与细胞组比较,联合组兔椎间盘软骨退变改善最显著,各组组织学评分分别为:对照组(1.27±0.19)分,模型组(19.43±3.48)分,材料组(18.59±4.01)分,细胞组(13.11±3.81)分,联合组(5.90±2.01)分,差异有统计学意义(P0.05)。与细胞组比较,联合组兔椎间盘组织蛋白多糖和Ⅱ型胶原增加更显著,MMP3蛋白下调更显著,差异有统计学意义(P0.05)。[结论]海藻酸钠盐微球凝胶复合IPS定向分化的髓核细胞可显著改善椎间盘内环境,促进退变椎间盘组织修复。     

pH值对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

[目的]观察不同pH值对体外培养人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响,为椎间盘退变的预防与治疗提供理论依据。[方法]对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞利用甲苯胺蓝和番红O染色进行鉴定,并对P3代细胞分别用普通培养基(pH值7.4)、酸性培养基(pH值6.8)和酸性培养基(pH值6.8)+Cucl_2(酸质子受体抑制剂)培养24 h,用流式细胞仪测定细胞凋亡,计算细胞凋亡率。[结果]细胞染色结果均为阳性,证明实验中所培养的细胞为髓核类软骨细胞。普通培养基组的凋亡率为(8.86±0.20)%,酸性培养基组的凋亡率为(11.23±0.77)%,酸性培养基+Cucl_2组的凋亡率为(9.60±0.49)%。与其他两组相比,酸性培养基组的凋亡率明显增加(P0.05)。[结论]在低pH值的环境下,人退变椎间盘髓核细胞的凋亡率增加。     

髓核细胞凋亡相关信号通路研究进展

正目前研究表明,椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是随年龄增长而发生的自然过程[1]。而髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)的凋亡会导致椎间盘的退变。NPC由两种细胞组成:脊索细胞和类软骨细胞,脊索细胞在人类在成年后自然消失,在一些小型脊柱动物中却终生存在[2]。类软骨细胞具有合成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用[3],     

移植骨髓间充质干细胞对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响.方法 以各兔L2/3、L3/4、L4/5、L5/6节段分为正常组、退变组、成纤维细胞(SFs)移植对照组、MSCs移植治疗组.MSCs和SFs分别经绿色荧光蛋白(GFP)转染后,注射植入退变椎间盘的髓核.通过透射电镜观察退变椎间盘凋亡髓核细胞形态;用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测退变组织中髓核细胞凋亡相关基因bcl-2和box mRNA的表达;免疫荧光法标记髓核细胞凋亡相关蛋白Caspase-3,并通过TUNEL法标记凋亡髓核细胞,激光共聚焦显微镜检测髓核细胞凋亡蛋白表达率和细胞凋亡比率.结果 透射电镜下,退变椎间盘中凋亡髓核细胞呈现出核染色质边集,空泡形成,核膜断裂,凋亡小体形成等变化.MSCs移植治疗组bcl-2 mRNA的表达量高于退变组和SFs移植对照组(P<0.05),bax mRNA的表达量与退变组差异无统计学意义(P>0.05).MSCs移植治疗组细胞凋亡率和Caspase-3表达率均高于正常组[细胞凋亡率分别为(16.75±2.14)%和(6.86±1.08)%;Caspase-3表达率分别为[(20.34±1.03)%和(6.09±0.77)%](P<0.05),低于退变组和SFs移植对照组[细胞凋亡率分别为(31.87±4.16)%和(29.02±2.16)%;Caspase-3表达率分别为(31.50±3.78)%和(30.20±4.93)%](P<0.05).结论 髓核细胞凋亡在椎间盘退变过程中起重要作用.MSCs移植能有效抑制椎间盘髓核细胞凋亡,延缓椎间盘退变过程.     

退变腰椎间盘髓核组织中NDRG2表达的变化及其意义

[目的]研究退变的腰椎间盘髓核组织中NDRG2表达的变化及其在椎间盘退变中的作用。[方法]收集腰椎间盘标本47例,根据Pfirrmann分级分为Ⅰ~Ⅴ级。采用免疫组织化学染色、实时-定量PCR(RT-PCR)和Western-Blotting技术从细胞、蛋白和基因水平分别检测腰椎间盘髓核组织中NDRG2的表达,并与Pfirrmann分级进行相关性分析;通过RT-PCR分析P53 mRNA的表达;采用衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)实验检测腰椎间盘髓核组织中衰老髓核细胞比例,并与NDRG2表达量进行相关性分析。[结果]免疫组织化学染色、RT-PCR及Western-Blotting检测示NDRG2表达随椎间盘退变程度加重而增加,且与Pfirrmann分级呈正相关;P53 mRNA在腰椎间盘髓核组织中的相对表达随着椎间盘退变程度加重而增加,且与NDRG2的表达量呈正相关。SA-β-gal阳性细胞比例在椎间盘髓核组织中随退变程度加重而增加,并且与NDRG2阳性细胞比例呈正相关。[结论]NDRG2参与了腰椎间盘退变的病理过程,并且可能通过介导腰椎间盘髓核细胞衰老对椎间盘退变起促进作用。     

重组腺病毒介导的hTGF-β1基因增加兔髓核组织蛋白多糖合成的研究

椎间盘退变是导致下腰痛及一系列功能障碍的主要致病原因^[1]。髓核组织内的蛋白多糖使椎同盘保持一定的含水量^[2]．因此，蛋白多糖的减少可直接影响椎间盘的生物功能。研究表明，转化生长因子β1(TGF-β1)能促进髓核细胞产生蛋白多糖^[3]。我们用腺病毒作为载体，将人TBF-β1基因转染至兔髓核组织内，使TGF-β1在髓核组织内大量表     

小鼠椎间盘退变模型的CBX8改变

[目的]探讨CBX8在小鼠椎间盘退变的表达以及其对椎间盘退变的影响。[方法]自小鼠椎间盘中分离出髓核细胞并行免疫组化鉴定,传代培养后用RT-PCR分别检测CBX8、Ⅱ型胶原、蛋白多糖m RNA的表达变化。分别建立正常对照、假手术和椎间盘退变动物模型,并分别于建模手术后8、12、16周进行检测,观察小鼠脊柱大体形态,Westblot检测Ⅱ型胶原和CBX8蛋白含量。[结果]体外实验表明,小鼠髓核细胞经过传代培养,在第5代时Ⅱ型胶原mRNA基本不表达(0.002±0.001),蛋白多糖的mRNA表达也明显下降(0.23±0.02),但是CBX8的mRNA表达却显著增加(1.68±0.26)。体内实验显示,椎间盘退变模型组发生一定程度的退变性侧弯,椎体的高度也明显下降。模型组Ⅱ型胶原蛋白的含量明显低于正常组及假手术组(P0.05);相反,模型组的CBX8的含量显著高于正常对照组和假手术组(P0.05)。[结论] CBX8在小鼠退变模型以及传代多次的髓核细胞中表达比在正常的椎间盘以及髓核细胞明显升高,CBX8与髓核细胞的衰老退变存在一定的关联。     

BMP-2对人退变椎间盘髓核细胞影响的实验研究

[目的]探讨BMP -2对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响.[方法]分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变推间盘髓核细胞分为2组.A组:加入100 ng/ml BMP -2,B组:加入200 ng/mlBMP -2,C组:对照组,不加干扰因素.通过对试验组和对照组髓核细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达.ELISA检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原含量,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖含量.[结果]髓核细胞中Ⅱ型胶原、糖胺多糖表达水平实验组均高于对照组.[结论] BMP-2蛋白可促进退变腰椎间盘细胞分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原,增加细胞活性,恢复椎间盘的功能和活性,因此运用BMP-2椎间盘内注射有望成为椎间盘退变疾病生物治疗的方法之一.     

干细胞治疗椎间盘退变性疾病的研究进展

椎间盘退变性疾病(disc degeneration disease,DDD)是引起腰腿疼痛的主要病因之一.目前其治疗主要分非手术治疗和手术治疗两大类,这些治疗虽取得了一定疗效,但并不能从根本上延缓甚至逆转椎间盘的退变.随着对椎间盘退变研究的不断深入,发现椎间盘退变与髓核内代谢失衡、髓核细胞凋亡增加、细胞外基质(如蛋白多糖和Ⅱ型胶原)分泌减少有关.因此,如何增加椎间盘内的髓核细胞,促进细胞外基质的分泌,增加液体含量,改善髓核内微环境是治疗DDD的关键所在.近年来,研究人员利用干细胞治疗DDD发现干细胞有望从根本上延缓甚至逆转椎间盘的退变,目前已成为治疗DDD的研究热点之一.现就干细胞治疗DDD的相关研究进展综述如下.     

过表达NDRG2基因促进人髓核细胞衰老的体外实验研究

[目的]研究NDRG2(N-Myc downstream-regulated gene 2)对人髓核细胞衰老的影响,进而探讨NDRG2在椎间盘退变中的作用。[方法]通过慢病毒过表达NDRG2基因稳定感染髓核细胞。设立正常髓核细胞组(空白组)、红色荧光蛋白标记的慢病毒感染髓核细胞组(对照组)及过表达NDRG2慢病毒感染髓核细胞组(实验组)。Western blot检测NDRG2蛋白表达水平,细胞衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-ga1)染色检测髓核细胞衰老变化,流式细胞仪检测髓核细胞周期变化,MTT法绘制生长曲线,并分析髓核细胞的增殖情况。[结果]正常髓核细胞感染过表达NDRG2慢病毒48 h后荧光显微镜下观察基因感染效率在95%以上;感染72 h后Western blot检测示NDRG2表达明显升高(P0.01);实验组SA-β-gal染色阳性率明显高于对照组和空白组(P0.01);MTT生长曲线显示慢病毒感染后髓核细胞增殖速度较对照组和空白组均减慢,潜伏期延长,缓慢进入对数期;细胞周期结果示实验组G0/G1期百分比明显高于对照组和空白组,S期明显低于对照组和空白组,差异有统计学意义(P0.05)。[结论]NDRG2基因过表达的髓核细胞衰老速度明显加快,提示NDRG2可能通过调控髓核细胞的衰老参与椎间盘退变过程,为椎间盘的退变生物学治疗提供依据。     

上皮膜蛋白-1在人椎间盘髓核细胞中的表达

目的观察上皮膜蛋白-1(epithelia membrane protein-1,EMP-1)在人椎间盘髓核细胞中存在的表达。方法利用我们已建成的人胚椎间盘髓核细胞和退变椎间盘细胞培养体系,采用半定量反转录PCR和免疫组化方法检测EMP-1在这两种细胞中的表达情况。结果人胚及退变椎间盘髓核细胞中EMP-1均有表达,分布在不同部位,且具有一定的丰度。结论 EMP-1在正常和退变椎间盘细胞中的存在和生物学特性改变,提示EMP-1可能在椎间盘退变中担当重要角色。     

聚集蛋白聚糖酶-1在退变椎间盘中的表达及意义

[目的]探讨聚集蛋白聚糖酶-1(aggrecannase-1,Agase-1)在退变椎间盘组织中的表达、规律及其意义。[方法]实验组为手术切除的腰椎间盘突出患者的退变椎间盘组织,分为纤维环破裂组和未破裂组;对照组为取自腰椎骨折患者的正常腰椎间盘组织。应用HE染色检测各组椎间盘组织的病理形态学变化,RT-PCR检测Agase-1mRNA的表达;Western印迹法检测蛋白多糖(aggrecan)的含量。[结果]Agase-1mRNA在实验组中表达均明显高于对照组,纤维环破裂组明显高于纤维环未破裂组(P<0.01),Aggrecan在实验组中的含量低于对照组,纤维环破裂组中Aggrecan明显低于纤维环未破裂组(P<0.01),HE染色显示髓核细胞数量随着椎间盘退变程度的增加显著减少,纤维环破裂组髓核组织中有血管生成,伴有炎细胞浸润。[结论]Agase-1可能参与了人类椎间盘组织的退变过程,且在突出的椎间盘组织中有增高趋势。     

细胞因子在椎间盘退变中作用的研究进展

腰痛是困扰人类的常见疾病之一,在所有到医院就诊的病人中占第二位,仅次于上呼吸道感染[1].椎间盘退变是导致慢性腰背部疼痛最主要的原因[2].目前引起椎间盘退变的机制尚无定论,研究发现椎间盘中的细胞因子在椎间盘退行性变的病理过程中发挥重要的作用,本文就细胞因子在椎间盘退变中的作用及针对细胞因子的治疗方法作一综述. 椎间盘退变(intervertebral disk degeneration,IVDD)是一非常复杂的生物学过程,受年龄、环境、生物力学、遗传学等多种因素的影响,Raj等[3]人研究得出,随着髓核中蛋白多糖成分的减少、纤维组织的增多以及软骨终板的老化退变等因素都可以导致椎间盘形态和结构的改变.Peng研究指出[4],纤维环损伤导致的炎症反应是椎间盘退变的主要发病基础,而炎症反应产生大量的细胞因子在椎间盘退变的过程中发挥了重要的作用.     

髓核细胞鉴定方法的相关研究进展

腰椎间盘突出症是引起腰痛的主要原因,目前治疗方法包括药物、手术等,这些方法不能阻止或延缓腰椎间盘突出症的病理进程,如腰椎融合术反而可能促进相邻椎间盘的退变病理进程.干细胞移植可以分化为髓核样细胞或/和可以促进退变椎间盘内髓核细胞的增殖,是目前研究的热点,但是,髓核细胞和关节软骨细胞表型非常相似,这些细胞均表达Ⅱ型胶原、SOX-9和聚集糖胺聚糖(目前最常用这三个指标来鉴定这些细胞),如何准确地区分干细胞是向髓核细胞方向分化还是向关节软骨细胞方向分化,这是研究椎间盘及关节疾病的基础,特别是我们如何准确高效地鉴定出髓核细胞是研究椎间盘退变的关键.现就如何准确高效地鉴定出髓核细胞综述如下.