多株创伤弧菌的基因分型和药敏试验

目的 了解海产品中分离的创伤弧菌的基因分子流行病学特征和药敏试验结果,为进一步研究创伤弧菌和临床用药提供依据。 方法 以聚合酶链反应(PCR)方法对海产品中分离的创伤弧菌进行核酸检测与基因型分型,用ATB细菌鉴定仪配套的药敏卡对创伤弧菌进行药敏试验。 结果 海产品中分离的创伤弧菌均为溶血素A基因(vvhA)核酸阳性,vcgC/E和16S rRNA A/B分型结果显示,共有5种基因型别,分别为CB型、CAB型、EA型、CA型和EAB型。共检测出1株BT2核酸阳性,1株SerE核酸阳性。药敏试验显示,该菌对氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素有耐药株。 结论 海产品中的创伤弧菌基因型呈多样性,以CB型为主,EAB型和CAB型同为国内首次报道的基因型。应加强对海产品中创伤弧菌的监测和耐药分析,预防创伤弧菌感染的暴发。     

青浦区水产品中副溶血性弧菌污染状况与分子分型特征

目的了解副溶血性弧菌在青浦区部分市售水产品中的污染情况及分子分型。方法于不同季度,分别从酒店、农贸市场和大型超市采取鱼类、虾和贝类等标本,参照GB 4789.7,采用稀释培养计数(MPN)法进行副溶血性弧菌定量检测,并完成分离菌株毒力基因和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型的检测。结果 144份水产品中共检出副溶血性弧菌68份,阳性率为47.00%,虾类、贝类和鱼类中副溶血性弧菌几何平均数分别为465.2、291.0、146.1MPN/g;所检出菌株均不携带TDH和TRH 2种毒力基因,68株副溶血性弧菌PFGE共分为63种带型,呈现明显多态性。结论青浦区市售水产品中副溶血性弧菌污染较严重,应采取有效措施防止由水产品引起的副溶血性弧菌食源性疾病,该地区菌株间遗传同源关系较远。     

一株死亡患者分离的致死创伤弧菌菌株的耐药表型与分子特征

目的 对培养分离的创伤弧菌菌株(2014-DJH)进行耐药表型与分子特征分析。方法 采用全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行生化鉴定和耐药分析;采用PCR方法检测vvhA基因和pilF基因,及vcg和16S rRNA基因分型;应用多位点序列分析进行分子分型。结果 分离菌株2014-DJH经生化鉴定为革兰阴性的生物1型创伤弧菌;对大多数常用抗生素都敏感,对妥布霉素中度敏感;PCR检测vvhA和pilF阳性,为vcgC-16S rRNA B(CB)基因型;菌株的多位点序列型为glp 5、gyrB 3、mdh 32、metG 68、purM 21、dtdS 39、lysA 115、pntA 4、pyrC 42、tnaA 75。结论 菌株2014-DJH为新ST型菌株,命名为ST 289,注册号为id-389。基因分型结果表明该菌具有较强的致病能力,加强创伤弧菌感染的监测与预警具有重要的意义。     

化脓性链球菌毒力基因检测及模式分类分析

目的调查60株化脓性链球菌毒力基因存在状况及毒力基因携带模式。方法 60株化脓性链球菌分离自2014年1月至2017年10月南京医科大学附属淮安第一医院与南京中医药大学附属医院急性扁桃体炎患者的病灶部位拭子标本。采用PCR及序列分析的方法分析侵袭性酶毒力基因(hyl A、spe B、endo S)、超抗原毒力基因(sme Z)、免疫逃逸毒力基因(sic)及黏附素毒力基因(prt F1)等6种毒力基因,并基于阳性检出模式进行毒力基因分类。结果侵袭性酶spe B、endo S基因和超抗原sme Z基因检出率均达100%,hyl A检出率为50%,sic检出率为23.3%,prt F1未检出。根据毒力基因检测结果,60株化脓性链球菌可分为4种类型,检出hyl A、spe B、endo S、sme Z等4种毒力基因有29株(48.3%),检出spe B、endo S、sme Z等3种毒力基因17株(28.3%),检出spe B、endo S、sme Z、sic等4种毒力基因13株(21.7%),检出hyl A、spe B、endo S、sme Z、sic等5种毒力基因1株(1.7%)。结论临床分离化脓性链球菌侵袭性酶spe B、endo S基因和超抗原sme Z基因检出率均达100%,推测其可能是化脓性链球菌感染导致感染灶局部炎症和坏死的原因之一。     

肝脓肿相关肺炎克雷伯菌毒力基因检测及同源性分析

目的探讨肝脓肿相关肺炎克雷伯菌高毒力荚膜血清型及主要毒力基因分布情况,并分析菌株的同源性。方法收集无锡市第二人民医院2016年1月至2017年8月肝脓肿相关肺炎克雷伯菌分离株12株;所有菌株进行黏液丝试验,PCR方法检测高毒力相关荚膜血清型及主要毒力基因;采用多位点序列分型(MLST)技术和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性。结果 12株肝脓肿相关肺炎克雷伯菌黏液丝试验阳性率为75%;检出K1(6株)、K54(1株)和K57(5株)3种高毒力荚膜血清型。毒力基因wca G、rmp A、ure A、fim H、mrk D、uge、Aer和iro NB检出率均为100%;iuc B检出率为83.3%;未检出cf29a基因;mag A、all S和kfu BC基因仅在K1血清型菌株中检出。MLST发现ST23(4株)和ST25(3株)为主要检出型,其次为ST412(2株)以及ST1660、ST1049和ST11各1株;PFGE结果显示12株肺炎克雷伯菌分为8个型,其中3株K1型菌株属于同一克隆型。结论分离的肝脓肿相关肺炎克雷伯菌均为高毒力菌株,ST23和ST25为主要检出ST型别,ST1049型为首次报道。PFGE结果呈现出遗传多样性,K1型肺炎克雷伯菌存在一定的流行。     

焦磷酸测序快速检测3种海洋性弧菌的方法学建立及创伤弧菌16S rRNA基因分型的研究

目的建立一种海洋致病性弧菌的快速诊断方法,为海洋性弧菌感染的临床检测构建新的技术平台。方法分别针对创伤弧菌vvh A,副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因设计扩增引物和测序引物,并PCR扩增特异性DNA片段,制备单链模板,进行焦磷酸测序,得到的碱基序列经NCBI比对验证;对创伤弧菌16S rRNA基因进行分型。结果创伤弧菌的扩增引物和测序引物均表现出较好的特异性,4株创伤弧菌均扩增出167 bp大小的DNA片段,并且测序结果与NCBI比对达到100%匹配度,而其他菌株未见扩增条带,测序结果为阴性;11株副溶血弧菌和溶藻弧菌均分别扩增出105 bp和134 bp大小的DNA片段,并且经测序得到与预期相符的DNA碱基序列。4株创伤弧菌中1株属于16S rRNA-A型,其余3株均属于16S rRNA-B型。结论本研究建立的PCR-焦磷酸测序方法是一种短核苷酸序列实时测定的新方法,具有高通量、精确、简单易行的优点,适用于海洋性致病菌及陆地感染细菌的快速精准鉴定。     

利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌耐药机制分析

目的调查临床分离金黄色葡萄球菌对利奈唑胺的耐药情况及耐药机制。方法用Vitek 2系统GP67卡对2019年1月至12月南京鼓楼医院临床分离905株金黄色葡萄球菌进行药敏试验,对检出的利奈唑胺耐药菌株用E-test法复测利奈唑胺最低抑菌浓度(MIC);用PCR扩增及测序技术分析利奈唑胺耐药决定基因cfr、optr A及23S rRNA基因V区;对菌株基因组DNA进行全基因组测序分析,对耐药基因、毒力基因进行生物信息学分析;用多位点序列分型(MLST)技术获得菌株ST分型。结果 905株金黄色葡萄球菌检出1株(0.1%)利奈唑胺耐药株(MIC为16 mg/L),该菌株除对万古霉素和复方磺胺甲噁唑敏感外,对其余常用抗菌药物均耐药。PCR及测序技术显示该菌株携带cfr基因,23S rRNA V区存在T2337G和C2370G核苷酸突变位点;全基因组序列分析显示基因组包含碱基数为2 949 411 bp,总基因数为3 023个,包含59个tRNA编码基因以及7个完整的rRNA基因编码操纵子,获得Gen Bank登录号JAANYO000000000,且该菌株携带包括cfr在内的多种耐药决定基因和毒力基因; MLST分型为新型ST5985。结论利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌临床分离率较低。检出由cfr基因和23S rRNA V区突变介导的新ST型利奈唑胺耐药株。     

20株中国医学细菌保藏管理中心标准肺炎克雷伯菌分子生物学特征分析

目的对中国医学细菌保藏管理中心收集保藏的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)进行分子生物学特征分析。方法对20株保藏KP菌株采用16S rRNA扩增及测序和质谱技术进行菌种鉴定验证;拉丝试验确定黏液表型;PCR筛查6种常见高毒力荚膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57);采用多位点序列分型(MLST)对菌株进行分子分型。结果 20株菌种均扩增出预期大小的16S rRNA基因片段,与KP模式菌株参考序列的相似性均99%;质谱技术检测均为KP,其中有4株鉴定到亚种;拉丝试验阳性率30%(6/20);共检出K2型3株(15%)、K5型4株(20%)、K54型1株(5%)、K57型4株(20%)和未分型8株;20株菌种分为10个ST型。结论该研究完善了KP菌株的分子生物学方面的质控指标。     

一起O3:K6型副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学检测

目的 检测食物中毒患者粪便或肛拭子、剩余食物、调味品、食物加工环节涂抹物分离的病原菌的生物学特性,确定食物中毒的病原.方法 参照GB/T4789--2003方法,对检出的副溶血性弧菌(vP)做血清分型、耐药性、种属特异基因和毒力基因[tdh(耐热溶血素)和砌(耐热相关溶血素)]检测.结果 从153份粪便或肛拭子样品中检出74株VP,并从调味品和加工环节涂抹物及垃圾桶内的剩余食物(猪头肉)中各检出1株VP,血清型均为03:K6型,神奈川溶血阳性(KP),77株VP聚合酶链反应(PCR)扩增都出现相同VP种属特异基因(320 bp)条带,77株副VP毒力基因复合PCR结果,tdh(434 bp)阳性,trh(250 bp)阴性.结论 本次食物中毒是由具较强毒力的03:K6型VP污染引起的.     

浙江省宁波地区腹泻患者中副溶血性弧菌检测与分析

目的 了解腹泻患者中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)携带、消长情况,建立分子溯源方法,发现流行优势型,分析疾病诱发因素,为控制副溶血性弧菌引起的食物中毒提供依据。 方法 腹泻患者中副溶血性弧菌分离采用筛检法;采用API生化鉴定系统进行菌株鉴定;用血清凝集试验对菌株进行血清分群;药敏试验采用K-B法;利用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)进行分子分型;聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测细菌毒力基因。 结果 从6216份腹泻患者标本中检出副溶血性弧菌901株,占检出致病菌的63.45%。副溶血性弧菌生物学性状典型,对氨苄西林等青霉素类抗生素的耐药率高,但对其他大多数抗生素敏感。480株副溶血性弧菌分成6个血清群,O∶3血清群占72.71%,为流行优势群。根据PFGE图谱带型变化可分为19个不同的型别,其中食物中毒来源的菌株PFGE带型集中。tdh毒力基因阳性的副溶血性弧菌396株,阳性率为70.71%;trh毒力基因阳性的副溶血性弧菌79株,阳性率为14.11%;tdh、trh毒力基因均阳性的副溶血性弧菌18株,阳性率为3.21%;tdh阳性的副溶血性弧菌中有365株神奈川试验阳性,占73.14%。 结论 宁波地区腹泻患者由副溶血性弧菌引起的比例较高,O3血清群为优势血清群。PFGE分型方法准确性、特异性高、重复性好、结果容易判读,分型效果更为明显,食物中毒来源的菌株带型集中,可用于确定菌株间的聚集性关系,提示传染源和传播途径,明确食物中毒是否为同一起暴发事件。患者中分离到的副溶血性弧菌大多数为带毒株,具有致病能力,与海产品和环境株不同,可用-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等抗生素作为临床治疗用药。     

腹泻样本中创伤弧菌的检测分析

目的 了解浙江省部分地区腹泻患者创伤弧菌的感染情况。 方法 对2010年6-10月采集的标本,经3%氯化钠碱性蛋白胨水于37 ℃增菌后,划线纤维二糖多粘菌素E平板于40 ℃培养18~24 h,挑取可疑菌落进行分子生物学鉴定。 结果 在144份腹泻患者粪便样本中检测分离到2株创伤弧菌,阳性率为1.39%(2/144);均为生物Ⅰ型,其基因型为vcgC/16S rRNA B型。药敏结果显示分离的创伤弧菌对氨基糖苷类抗生素耐药如阿米卡星、庆大霉素。 结论 在监测的腹泻样本中分离到具有较强致病能力的创伤弧菌,且氨基糖苷类抗生素耐药,应加强对海水产品和腹泻样本中创伤弧菌的检测及耐药分析,预防创伤弧菌的感染暴发。     

一起引起食物中毒副溶血性弧菌的检测

2008年7月杭州市下城区某员工食堂暴发一起由副溶血性弧菌(VP)引起的食物中毒事件,采集中毒患者粪便标本、厨师肛拭子标本和食物加工环节涂抹物标本共25份。经常规鉴定,共检出11株VP(10株来自患者粪便、1株来自食物加工环节涂抹物)。对11株VP进行血清分型和耐药性检测发现,11株VP血清型均为O3:K6型;神奈川溶血试验(KP)阳性;生物学性状和药敏试验结果均一致。采用聚合酶链反应(PCR)方法对11株菌进行种属特异基因(R72H)和毒力基因(tdh、trh)检测,同时应用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)进行分型和聚类分析,11株菌的VP种属特异基因(R72H)均为阳性,毒力基因复合PCR结果,tdh(434bp)阳性,trh(250bp)阴性;11菌株经PFGE聚类分析得到3种带型,聚类分析相似性百分比为93%。     

北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断病例的感染致病菌检测分析

  目的  分析北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断病例的感染致病菌构成及病原特征,为该类疾病的科学防控提供依据。  方法  收集细菌性痢疾临床诊断病例44例,进行志贺菌属、弯曲菌属、沙门菌属、副溶血弧菌、霍乱弧菌、致泻大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌7种常见致病菌的分离培养,对分离菌株进行血清分型、分子分型及毒力基因检测。  结果  志贺菌属和小肠结肠炎耶尔森菌检出率为0,其他致病菌检出率由高到低依次为弯曲菌属（30.00%,9/30）、沙门菌属（18.18%,8/44）、副溶血弧菌（15.91%,7/44）、致泻大肠埃希菌（4.55%,12/44）、霍乱弧菌（3.13%,1/32）。 9株空肠弯曲菌分成9种ST型;8株沙门菌分成4种血清型,7种脉冲电场凝胶电泳带型;8株副溶血弧菌分成4种血清型,毒力基因特征均为tdh+/trh-;1株霍乱弧菌为非O1/O139血清型,毒力基因特征为ctx-/t3ss+。  结论  北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断错误率较高。 细菌性痢疾临床诊断病例具有较高的致病菌检出率,以弯曲菌属、沙门菌属为优势构成。 志贺菌属与其他腹泻肠道致病菌的快速鉴别诊断应在临床尽快建立并推广应用。     

云南部分鼠疫疫源地中小肠结肠炎耶尔森菌的分离及鉴定

目的 了解云南部分鼠疫疫源地中小肠结肠炎耶尔森菌的分布及病原学特征。方法 2012年5月至2014年4月采集剑川、梁河两县鼠类盲肠,对其进行培养,通过菌落聚合酶链反应初筛小肠结肠炎耶尔森菌,通过生化鉴定确定菌株并作毒力基因检测。结果 915份标本中分离到小肠结肠炎耶尔森菌35株,总检出率为3.83%,分离株包含1株致病株、34株非致病株。35株小肠结肠炎耶尔森菌全部为生物1A型,1株致病株为1A/O:9生物血清型,毒力基因为(ail+、ystA-、ystB-、yadA-、virF-、rbfc-),非致病株血清为O:5、O:8及未分型,毒力基因为(ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-、rbfc-)。 结论 小肠结肠炎耶尔森菌在剑川野鼠鼠疫疫源地鼠间流行,分离菌株血清型别较为多样,分离到的致病株缺乏典型毒力基因;小肠结肠炎耶尔森菌在梁河家鼠鼠疫疫源地尚未发现鼠间的流行。     

贝类水产中副溶血性弧菌菌型分布研究

目的了解贝类水产中副溶血性弧菌(VP)的菌型构成及其特点。方法按照GB/T 4789.7标准处理贝类标本,每份VP阳性标本挑取10个克隆,并对其进行血清分型,以PCR法检测tdh、trh、GS-PCR和f237噬菌体的携带情况,并据此对阳性标本中的VP进行菌型区分,分析各菌型在相应标本中的构成。结果 75份贝类水产中18份(24.0%)检出VP,5.6%携带trh阳性VP(O4∶KUT),未检出tdh阳性菌株。18份VP阳性标本共获得180株VP克隆,共可分为42种菌型。检出3株O3∶K6和1株O1∶K33 GS-PCR阳性菌株,均为非流行株。不同标本中菌型数不完全相同,最多可检出9种,平均每份VP阳性标本含6.1种菌型。检出47个(26.1%)克隆株携带f237的orf8完全缺失变种。结论 f237 orf8完全缺失变种噬菌体在贝类中具有广泛的分布。贝类中VP种群构成复杂,常携带多个菌型。临床常见菌型在贝类中不具优势,食品中VP的检测应充分考虑血清分型、基因分型的作用。     

大肠埃希菌毒力因子检测及其与耐药相关性研究

目的探讨不同来源大肠埃希菌毒力因子的分布及其与耐药性的关系。方法对2003-2008年温州医学院附属第一医院的住院患者不同标本中分离的188株大肠埃希菌用PCR方法扩增毒力因子papC、sfa/foc、afa/dra、hly、cnf1、iutA、aer、fimH、kpsMTⅡ、fyuA。采用VITEK-60自动化微生物分析仪检测大肠埃希菌对常用抗菌药物的敏感性。结果毒力因子iutA、fyuA在不同标本来源的大肠埃希菌中的检出率较高,均50%,毒力因子aer、fimH在不同标本来源的大肠埃希菌中的检出率差异无统计学意义(P0.05)。氨苄西林的耐药性与毒力因子aer有关(P0.05),喹诺酮类抗菌药物环丙沙星,左旋氧氟沙星的耐药性与毒力因子iutA有关,头孢唑啉的耐药性与afa/dra有关,庆大霉素的耐药性与aer有关,复方新诺明的耐药性与sfa/foc、iutA、aer有关,头孢他啶的耐药性与sfa/foc、iutA有关,氨苄西林/舒巴坦的耐药性与aer有关(P0.05)。结论毒力因子在不同来源大肠埃希菌中的分布有差异,某些毒力因子与大肠埃希菌耐药性相关,应引起临床重视。     

2006年河南省南阳市流行性乙型脑炎病毒的分离与分子特征分析

目的在河南省南阳市采集蚊虫标本,进行西尼罗病毒基因检测,分离流行性乙型脑炎(乙脑)病毒并分析分离株的分子生物学特征。方法 2006年从南阳市采集蚊虫标本,将标本研磨处理后进行巢式PCR检测西尼罗病毒核酸,用细胞培养法对标本进行病毒分离,通过血清学与分子生物学方法鉴定新分离到的乙脑病毒,扩增分离株PrM和E基因区,使用生物学软件进行序列和系统发生分析。结果共采集蚊虫标本6231只,巢式PCR检测西尼罗病毒结果均为阴性。从标本中分离到7株病毒,经鉴定均为乙脑病毒。基因分型显示7株病毒均为基因Ⅰ型,新分离株在E基因之间的核苷酸同源性为98.5%～100%,氨基酸同源性为98.4%～100%。新分离株与P3株和SA14-14-2的E基因核苷酸同源性分别为87.7%～88.2%和87.3%～87.9%。新分离株与P3株相比存在10个共同氨基酸差异位点,但在决定毒力的关键位点不同于SA14-14-2。结论河南省南阳市2006年乙脑病毒流行株为基因Ⅰ型,毒株的毒力基因没有明显改变,所有标本均未检测到西尼罗病毒阳性。     

大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶基因型及毒力因子相关性研究

目的分析温州医科大学附属第一医院临床分离产超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum BetaLactamase,ESBLs)大肠埃希菌耐药情况,研究大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶的不同基因型与所含的毒力因子的关系。方法普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测不同标本来源大肠埃希菌的毒力因子papC、sfa/foc、afa/dra、iutA、aer、fimH、hly、cnf1、kpsMTII、fyuA;纸片扩散确证法检测超广谱β-内酰胺酶,PCR方法检测ESBLs不同基因型的分布情况。结果产ESBLs大肠埃希菌株中,毒力因子iutA、fyuA的检出率较高,均50%;毒力因子fimH、aer的检出率为20%~40%,而毒力因子papC、sfa/foc、afa/dra和kpsMTII的检出率均较低20%;经χ2检验产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株的毒力因子分布率差异均无统计学意义(P0.5)。92株产ESBLs大肠埃希菌中,毒力因子papC在CTX-M-9群中的阳性率高于TEM群和CTX-M-1群,差异有统计学意义(P0.05);毒力因子aer在CTX-M-1群中的阳性率高于TEM群和CTX-M-9群,差异有统计学意义(P0.05)。结论各种毒力因子检出率与细菌是否产ESBLs无相关性。但ESBLs阳性菌株中不同的基因型与某些毒力因子的存在与否存在一定关系,毒力因子与产CTX-M酶大肠埃希菌耐药情况可能有关。