共表达O型FMDV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。     

O型口蹄疫病毒P1-2A基因重组杆状病毒的构建及其表达

设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBac^TM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。     

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。     

表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建及筛选

为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

口蹄疫病毒P1 2A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建

以A型口蹄疫病毒（FMDV）AV88（L）和XJ99株的P12X基因和AV88（L）3C基因的阳性克隆质粒为模板，用PCR扩增各基因片段，酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明，获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88（L）P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C，为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术，扩增出口蹄疫病毒（FMDV）VP2基因，并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞，获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后，感染sf9细胞，表达VP2融合蛋白，分子质量为33ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体，通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定，说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达，且可以与牛抗。型FMDV血清发生特异性反应。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达

传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。     

共表达AsiaⅠ型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因重组山羊痘病毒的构建及鉴定

将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因与启动绿色荧光蛋白双向串连痘苗病毒启动子相连,以KpnⅠ为插入位点,将整体基因片段插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中,构建共表达重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-GFP-P12A3C。与疫苗弱毒株山羊痘病毒共转染BHK21细胞,经绿色荧光筛选,RT-PCR检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株vTK-3CP1-GFP。     

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

人体醛缩酶C cDNA的克隆及其在家蚕体内的表达(英文)

利用人体醛缩酶C cNDA的一对特异性引物A ld-5′(5′-ggatcccctcactcgtaccca-3′)和A ld-3′(5′g-gatcctcag-taggcatggtt-3′),从人脑cDNA文库中PCR扩增出人体醛缩酶C cDNA,并依次被克隆进克隆载体pCR2.1、转移载体pAcGP67B以及来源于AcNPV和BmNPV的杂交重组病毒HyNPV。通过对家蚕血液的SDS-PAGE电泳和酶活力测定,证明人体醛缩酶C cDNA在家蚕体内成功得到表达。     

口蹄疫多基因杆状病毒转移载体的构建

采用分步 PCR扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因 P1 ,非结构蛋白基因 2 A、2 B、3 C蛋白酶和 3 D聚合酶按正确的读码框依次连接克隆入 p GEM-T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入杆状病毒转移载体 p Mel Bac B。构建成功的重组 p Mel Bac B/P1 2 X3 C3 D转移载体经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,转移载体可与杆状病毒骨架载体进行昆虫 sf9细胞内同源重组 ,以产生重组杆状病毒     

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。     

共表达Asia1口蹄疫病毒P1-2A-3C基因和猪IL-18基因重组鸡痘病毒构建及表达

为构建Asia1型口蹄疫重组鸡痘病毒疫苗,采集口蹄疫发病牛的水泡液及水泡皮,用RT-PCR法扩增出Asia 1型口蹄疫病毒的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切连接获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。再将P1-2A-3C片段与pUTAL-IL18片段连接起来,构建鸡痘病毒中间转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-IL18。通过脂质体转染法,将pUTAL-P1-2A-3C-IL18与鸡痘病毒282E4株共感染染鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts,CEF）,通过BrdU三次加压筛选,筛选出重组鸡病毒株vUTAL-P1-2A-3C-IL18。经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C基因。本研究为研制安全、高效的亚洲Ⅰ型FMD重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

日本血吸虫中国大陆株Sj23抗原基因在家蚕细胞中的表达及鉴定

将日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白 (Sj2 3抗原 )基因从原核表达载体 p ET2 8(c)中亚克隆入转移载体 p Bac PAK- His1,构建了 p Bac PAK- his1- Sj2 3转移载体 ,并与线性化家蚕杆状病毒共转染家蚕细胞 ;经 PCR鉴定得到重组病毒 ,经过蓝、白斑筛选得到纯化的重组病毒 ;SDS- PAGE显示日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白基因在家蚕细胞中实现表达 ,蛋白的相对分子质量为 2 6 0 0 0 ;重组 Sj2 3经 Western- Blot鉴定能够识别血吸虫感染多克隆兔血清     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素

人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。     

人乙肝病毒前表面抗原PreS1在家蚕培养细胞中的表达

人乙肝病毒前表面抗原PreS1诱导的免疫反应可以克服机体对乙肝病毒S蛋白的无反应状态。将人乙肝病毒adr前表面抗原preS1基因克隆到杆状病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAKpreS1。用此转移载体与线性化病毒BmBacPAK6线性化基因组DNA共转染单层家蚕细胞(BmN),经细胞内同源重组和空白筛选,获得重组病毒。ELISA结果表明重组蛋白PreS1在家蚕培养细胞中的表达水平为02pg/个细胞,Western印迹证实此蛋白大小约为14kD。     

猪带绦虫45W-4B基因在家蚕细胞中的表达

猪带绦虫45W基因已被认为是预防猪囊虫病的基因工程疫苗候选基因之一。其中4B基因是45W基因家族中高度保守的一个成员（以下称45W-4B）。本试验将重组于pGEM-3Z载体上的4B基因转载到pVL1393转移载体中，通过鉴定获得重组质粒pVL1393-4B，然后将重组质粒与BmNPV病毒共转染，筛选出重组BmNPV-4B重组病毒，用该重组病毒感染Bm细胞，收集细胞上清，SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白，并经Western blot检测表明该蛋白能识别囊虫病人（猪）阳性血清，45W-4B蛋白的成功表达对进一步研究45W蛋白的结构和功能以及开发高效猪囊虫基因工程疫苗打下了基础。