在高于米氏常数的底物浓度下用积分法测定尿酸酶活性

目的:以尿酸酶为模型,考察在底物浓度高于酶米氏常数(Km)时用积分法测定酶活性(Vm)的可靠性. 方法:用293 nm光吸收记录尿酸酶反应曲线. 用以反应时间为自变量的积分速度方程,以尿酸酶Km为常数而本底为非线性参数拟合尿酸酶反应曲线,搜寻对应最好拟合的Vm. 结果:此积分法测定Vm主要受剩余底物浓度影响,本底基本没有干扰. 剩余底物低于2.5 μmol/L时用10～70 μmol/L起始底物所得Vm无差异. 用25和70 μmol/L起始底物浓度时初速度和Vm都与酶量呈正比. 在此两种底物浓度下积分法的下限相同,且与初速度法下限无明显差异. 但用积分法测定酶活性的上限明显高于初速度法,而且起始底物浓度越低则差异越显著. 结论:在积分法中使用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线,在高于Km的底物浓度下能可靠测定酶活性.     

低于米氏常数底物浓度下酶动力学参数的测定

目的：联用设定底物浓度下初速度（initial velocity,Vi）和过程分析法所得酶最大反应速度（maximal reaction rate,Vm）与米氏常数（Michaelis-Menten constant,Km）比值（Vm/Km）,据米氏方程推算酶的Km和Vm。方法：以苛求芽孢杆菌尿酸酶（Bacillus fastidious uricase,BFU）及其突变体（A1R,A1R/V144A ）、牛小肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase,CIAP）及大肠杆菌碱性磷酸酶突变体R168K为模型。用A293 nm记录尿酸酶反应曲线、A450 nm记录碱性磷酸酶水解4-硝基-1-萘基磷酸酯（4-ni－tro-1-naphthyl phosphate,4NNPP）反应曲线;以反应时间为自变量、用积分速度方程拟合不超过10% Km初始底物浓度下酶反应曲线测定Vm/Km,分析设定底物浓度下初速度反应数据确定初速度Vi;据相同酶量Vi和Vm/Km按米氏方程计算Km;据所得Vm/Km和Km推算Vm。结果：以E-H（Eadie-Hofstee）法分析50%~200% Km底物浓度下Vi所得Km均值为其参考值;联用策略测定Vi所设定的底物浓度越高,则所得Km相对偏差越小;测定Vi所设定的底物浓度从35% Km逐渐升高到120% Km,所得Km趋于稳定且相对偏差不超过20%。据此联用策略发现,苛求芽孢杆菌尿酸酶在生理pH下活性降低的原因不是其Km明显升高,而是其Vm下降。结论：当底物溶解度低于Km时,这种联用策略更适合测定酶的Km和Vm。     

郑州地区汉族健康人群和糖尿病合并冠心病患者血清芳香酯酶活性频数分布态性与192位基因的多态性

目的:研究郑州地区汉族健康人群和糖尿病合并冠心病 (DM CAD)患者血清芳香酯酶 (ArE/PON1 )活性频数分布态性与 192位基因多态性的分布。方法:郑州地区汉族健康人群 321例,DM CAD90例。用终点法测定血清ArE/PON1活性。PCR检测年龄相近的 182例健康人和 90例DM CAD患者ArE/PON1 192位基因多态性。结果:郑州市汉族健康人群与DM CAD患者血清ArE/PON1活性频数均呈单峰正态分布;ArE/PON1 192存在基因多态性,等位基因为Q和R。DM CAD患者ArE/PON1酶活性 (0. 198±0. 015)u/ml,低于正常对照组的 (0. 258±0. 020)u/ml(t=37. 92,P<0. 01);DM CAD患者R基因频率和RR基因型分布频率分别为 62%和 31%,高于正常对照组的 46%和 12% (P< 0. 01)。2个观察组各基因型间血清ArE/PON1酶活性差异无统计学意义。结论:郑州地区汉族人群血清ArE/PON1活性频数分布为单峰正态分布,并存在有ArE/PON1 192位基因多态性,R基因可能是该地区DM CAD的独立危险因素。     

口腔肿瘤恶变与唾液蔗糖酶活性的相关性研究

目的 :探讨唾液蔗糖酶活性与口腔肿瘤恶变之间的相互关系。方法 :采用邻甲苯胺测糖法 ,测定单位时间内唾液蔗糖酶水解蔗糖生成的葡萄糖量 ;在PH6 ,37℃条件下进行酶反应用双倒数作图法测出表观Km和表观Vm值 ;检测蔗糖酶活性。结果 :正常人唾液蔗糖酶活性为 1 32 2± 0 434mU/mgpro ,口腔鳞癌患者唾液蔗糖酶活性为 1 5 48± 0 6 5 7mU/mgpro ,二者之间比较无显著差异 (P >0 0 5 ) ;正常人唾液蔗糖酶的表观Km =(1 1 2± 2 4)× 1 0 -2 mol/L ,表观Vm =1 1 38± 0 35 2 (每分钟光密度值 ) ,口腔鳞癌患者唾液蔗糖酶的表观Km =(9 5±2 2 )× 1 0 -2 mol/L ,表观Vm =(1 0 89± 0 6 32 ) (每分钟光密度值 )。结论 :口腔良性肿瘤、涎腺腺瘤、口腔鳞癌患者与正常人比 ,唾液蔗糖酶活性无显著差异。     

用积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用

目的: 以Candida species尿酸酶为模型,考察用积分法筛选抑制剂的条件. 方法: 用293 nm吸收记录尿酸酶反应. 用反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定表观米氏常数(apparent Michaelis-Menten constant, Kmapp)和表观最大反应速度(apparent maximal reaction rate, Vmapp). 据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibition constant, Ki). 结果: 被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性. 通常终点底物<1/6 Kmapp而起始底物足够高,此积分法测定Kmapp的偏差和变异低于20%而Vmapp精度更高. 用积分法所得Kmapp与双倒数法一致,且和黄嘌呤浓度成正比,对应Ki为(5.4±0.8) μmol/L (n=3),也与双倒数法一致. 结论: 被分析数据精度足够高,用无抑制剂时米氏常数(Michaelis-Menten constant, Km)4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度<1/6 Km,此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂.     

2型糖尿病合并冠心病患者血清芳香酯酶、黄嘌呤氧化酶及脂蛋白检测

目的:检测2型糖尿病并发冠心病(DM-CHD)患者血清芳香酯酶(ArE/PON1)和黄嘌呤氧化酶(XO)活性及脂蛋白含量.方法:测定78例2型糖尿病(DM)、80例DM-CHD患者与81例健康人血清ArE/PON1、XO、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)等有关指标,分析上述指标在DM-CHD发病中的意义.结果:与健康组相比,DM与DM-CHD组患者血清ArE/PON1活性降低、XO活性升高;MDA、CAT等水平升高,SOD活性降低;oxLDL水平升高,HDL-C降低,且DM-CHD组的改变较DM组明显.结论:血清ArE/PON1、OX、SOD及脂蛋白的测定可反映DM与DM-CHD患者机体氧化应激与脂代谢紊乱状况,是监测DM并发CHD的有用指标.     

不同方法测定黄嘌呤对Bacillus fastidiosus胞外尿酸酶抑制效力的比较

筛选酶抑制剂常需测定米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）来确定抑制常数（Ki）.双倒数分析法测定Ki效率低,且靶酶Km越高则成本越高.积分法和线性动力学法[5,6]测定Ki所需底物浓度都高于Km,至今对高Km靶酶都测定极低底物浓度下的半抑制浓度,或再换算成抑制常数表示抑制效力.但测定低浓度底物下的初速度要求高灵敏度的定量方法.实际上在低浓度底物下用简化积分法也可测定Ki.Bacillus fastidiosus胞外尿酸酶Km接近0.2 mmol/L,黄嘌呤是其竞争性抑制剂.本文用低浓度尿酸,比较测定初速度确定黄嘌呤半抑制浓度和简化积分法测定黄嘌呤抑制常数的差异.     

用线性动力学方法表征L-苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用

目的:考察用线性动力学方法表征L-苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶抑制作用的可靠性.方法:测定碱性磷酸酶水解对硝基苯酚磷酸酯(PNPP)的产物生成初速度.用两个底物浓度下标定比活性计算米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm),再据二者对抑制剂浓度的响应确定抑制剂类型和抑制常数.结果:双倒数分析法重复测定发现70%的Km和Vm随抑制剂浓度升高而同步下降,两动力学参数变化对应抑制常数的比值为(2.4±0.6,n=9).线性动力学方法所得参数精度稍高,Km和Vm随抑制剂浓度升高同时下降的出现率约80%,两抑制常数之比为(2.0±0.8,n=10),两参数变化对应的抑制常数及两抑制常数之比都与双倒数分析法一致.如允许两抑制常数之比在2.5倍内波动,则两种方法都表明L-苯丙氨酸为此碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂.结论:此线性动力学方法可用于表征反竞争性抑制剂.     

慢性肾功能衰竭血清芳香酯酶活性改变的研究

目的研究慢性肾功能衰竭 (CRF)患者血清芳香脂酶 (ArE)活性改变的临床意义。方法 :通过测定CRF早期、晚期与终末期患者血清ArE活性、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇 (HDLc)、氧修饰低密度脂蛋白 (ox -LDL)与脂蛋白 (a) [Lp(a) ]及内生肌酐清除率 (Ccr)等的水平 ,进行分析。结果 :CRF患者血清ArE活性与HDLc水平低于对照组 ,血清ox -LDL、Tc与LP(a)水平高于对照组。三期肾功能衰竭患者血清ArE活性与HDLc水平降低程度自小至大依次为早期、中期与晚期 ,血清ox -LDL、Tc与LP(a)升高程度在三组间有显著性差别 ,其中以终末期最高。血清ArE活性与HDLc、白蛋白、Ccr呈正相关 ,与血清肌酐呈负相关 ,和Lp(a)无相关性。结论 :测定CRF患者血清ArE活性不仅了解其血脂与脂蛋白的代谢异常 ,还可为了解肾功能损害程度提供参考依据。     

郑州地区汉族正常人群、糖尿病和糖尿病并发冠心病患者芳香酯酶Q192R基因多态性

目的：研究郑州地区汉族正常人群、2型糖尿病（DM）及DM并发冠心病（DM－CAD）患者芳香酯酶（Arylesterase/Paraoxonase,ArE/PON1)192位基因多态性。方法：用比色法测定郑州地区汉族正常人群（61例）、DM（60例）和DM－CAD（67例）患者血清Ar/PON1活性，用聚合酶链式反应分析技术检测ArE/PON1基因192位多态性，用酶法和酶联免疫法分别测定血清胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（HDLc)、氧化型低密度脂蛋白（oxLDL)等指标。结果：郑州地区汉族人群中存在有ArE/PON1192位基因多态性，Q、R基因频率健康人群中分别为0.56与0.44；DM组为0.53与0．47；DM－CAD组为0．38和0．62。DM－CAD组R基因频率高于DM组和对照组。基因型百分比DM－CAD组RR（31％）高于DM组（13％）和对照组（11％）（P＜0．05）。DM与DM－CAD组血清ArE/PON1活性水平低于对照组，以DM－CAD组为最低（P＜0．05）。酶活性的降低与HDLc、HDL2C呈正相关，与oxLDL呈负相关。结论：郑州地区汉族人群存在ArE/PON1 192位基因多态性，并提示R基因是郑州地区汉族人群DM－CAD的危险因素。