北京五城区零售鲜切果蔬中重要食源性致病菌污染与耐药性研究

目的 为探究鲜切果蔬中食源性致病菌污染及耐药现状,采集北京五城区零售鲜切果蔬样品进行重要食源性致病菌检测及耐药性研究。方法 本研究采用食品微生物检验国家标准方法,分别检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌,对目标菌分离株进行耐药性测定,并通过荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法筛查致泻大肠埃希氏菌。结果 北京市五城区零售326份鲜切果蔬样品中,金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌和肠道集聚性大肠埃希氏菌的污染率分别为15.34%、1.84%、0%、 9.51%和1.23%。本研究分离所得50株金黄色葡萄球菌主要对青霉素和苯唑西林耐药,耐药率分别是90.00%和48.00%,31株大肠埃希氏菌主要对复方新诺明和氨苄西林耐药,耐药率为67.74％和64.50％,4株肠道集聚性大肠埃希氏菌均呈现多重耐药现象,而6株单核细胞增生李斯特氏菌对10种受试抗生素全部敏感。结论 本研究初步掌握了北京五城区零 售鲜切果蔬中重要食源性致病菌污染和耐药现状,可为制定食源性疾病防控策略提供科学的实验依据。     

云南部分地区熟肉制品中食源性致病菌的污染情况及耐药性分析

目的了解云南省部分地区熟肉制品中食源性致病菌的污染情况及致病菌的耐药情况。方法 在云南省部分地区采集熟肉制品共115件,按照国标法对熟肉中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7和致泻大肠埃希氏菌进行分离鉴定,利用微量肉汤稀释法对金黄色葡萄球菌进行12种抗生素的药敏试验。结果 云南省此六地州的熟肉制品中存在不同程度的污染,金黄色葡萄球菌污染最严重（19/115,16.5%）,沙门氏菌（1/115,0.8%）,大肠埃希氏菌O157:H7和致泻大肠埃希氏菌未检出。19株金黄色葡萄球菌药敏实验分析得出多重耐药率为21.1%。所有菌株对达托霉素敏感,对其余的抗生素都有不同程度的耐药,主要以耐青霉素（100%）和红霉素（68.4%）为主,沙门氏菌SM-054对6种抗生素耐药,耐药情况较严重。结论根据熟肉样品来源的不同,检出率也存在差异,夏季的农贸市场和饭馆中金黄色葡萄球菌的污染情况较严重,应采取有效的监管措施,同时加强管理抗生素的使用,确保熟肉制品的质量和安全性。     

智舌检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7和金黄色葡萄球菌

目的:探究一种快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌的新方法。方法:基于多频大幅脉冲伏安法的智舌检测微生物生长过程中营养肉汤成分的综合信息,并结合主成分分析方法和簇类的独立软模式识别技术,对检测得到的数据进行分析。结果:在智舌的钯电极1 Hz频率段检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和1%葡萄糖营养肉汤区分效果较好,通过独立软模式识别技术能很好地判别、区分有菌生长的培养基和纯培养。结论:智舌能够有效检测、区分两种菌及培养基,有望成为检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌的一种新技术。     

三重荧光PCR检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种检验沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7的Taqman探针三重荧光PCR方法。方法 针对沙门氏菌属特异性invA基因、金黄色葡萄球菌rpoB基因、大肠埃希氏菌O157：H7 的rfbE基因设计引物与探针,建立三重荧光PCR体系,对引物与探针浓度及退火温度优化,并进行特异性和敏感性研究。结果 引物与探针的最优浓度组合为：invA 0.2μL、ropB 0.4μL、rfbE 0.5μL;最优退火温度为60℃。16株非目标菌株扩增结果为阴性;目标菌株均出现显著扩增。敏感性试验显示,三种微生物对应的能检出的最低菌体数量依次为：460CFU、76CFU、660CFU。结论 该方法特异性好、灵敏度高,能够快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7     

多重重组酶介导等温扩增技术检测食品中3种食源性致病菌

建立快速、灵敏的多重重组酶介导等温扩增方法（recombinase aided amplification,RAA）同时检测食品中的大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。方法 根据大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因、沙门氏菌的invA基因以及金黄色葡萄球菌的nuc基因的序列保守区域设计RAA特异性引物,筛选出最优的引物组合并优化各项实验条件;通过标准菌株验证方法特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,验证方法在实际食品样本中的检测能力。结果 多重RAA方法最佳扩增温度为37℃,反应时间为50 min;方法特异性良好,仅对目标菌株存在特异性扩增条带,与其他常见食源性致病菌无交叉反应;方法对基因组DNA的检测灵敏度为0.10 ng/μL;方法对经过简单增菌的人工污染牛奶样本和牛肉干样本中目标菌株的检出限为100 CFU/mL。结论 本研究建立的多重RAA扩增方法具有特异性好、灵敏度高、检测通量高等优势,适用于多种场景下食品样本中3种食源性致病菌的快速检测。     

基于免疫磁分离的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的评价

目的 研究基于免疫磁分离的七种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的灵敏度与特异性。方法 将大肠埃希氏菌O157：H7和大肠埃希氏菌O103不同稀释度的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及O157:H7和O103的抗原基因。同时,对菌悬液进行活菌计数,进行灵敏度研究。对8株携带stx1、stx2、eae基因的目标菌菌悬液,以及25株非目标菌的标准菌株及分离菌株的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及抗原基因,进行特异性研究。结果 本方法检测大肠埃希氏菌O157：H7的stx1、stx2、eae以及抗原基因的灵敏度为10_²CFU/mL,检测大肠埃希氏菌O103抗原基因的灵敏度为10_³CFU/mL. 8株目标菌检测结果与其携带的基因一致,没有假阴性,包容性达到100%。25株目标菌检测结果与其携带的基因一致,未发现有假阳性,排他性达到100%。结论 方法具有良好的灵敏性及特异性,适用于食品中七种产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测。     

熔解曲线结合RT-PCR在餐饮食品中对5种致病菌的检测

建立快速检测餐饮食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7及副溶血性弧菌5种致病菌的实时聚合酶链式反应体系(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。通过增菌时间的比较,调整RT-PCR反映体系中的退火温度,建立5种致病菌相同的检测体系。试验结果表明,5个目标菌达到检测灵敏度的最短增菌时间范围为2 h～8 h,5种致病菌的试验灵敏度范围为7.4×10 CFU/mL～2.4×103CFU/mL。5种目标菌的熔解温度Tm值分别为沙门氏菌87.32℃,金黄色葡萄球菌79.57℃,单核增生李斯特氏菌82.02℃,大肠埃希氏菌O157:H7 82.24℃,副溶血性弧菌87.15℃。试验建立的RT-PCR快速检测反应体系,与常规微生物检测方法相比,有效地缩短了检测时间,且灵敏度与特异性均能满足检测要求。     

农产品中食源性致病菌的污染状况分析

目的了解农产品中食源性致病菌的污染状况,为政府监管提供依据。方法共抽取430份农产品样品,监测项目为沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7、霍乱弧菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和诺如病毒。采用全自动基因指纹分析仪对分离到的部分沙门氏菌和金黄色葡萄球菌株进行核糖体基因指纹鉴定。结果农产品中存在食源性致病菌的污染,畜禽产品中检出单核细胞增生李斯特氏菌22株、沙门氏菌17株、金黄色葡萄球菌7株;水产品中检出霍乱弧菌7株;鲜食蔬菜中检出金黄色葡萄球菌11株,72%的金黄色葡萄球菌产肠毒素。全自动基因指纹分析仪的鉴定结果和国标方法完全一致。结论应重视农产品的源头污染,加强监控。全自动基因指纹分析仪可用于食源性致病菌的快速鉴定和溯源。     

5种食源性致病菌PCR检测方法的建立

目的建立食品中的沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的PCR快速检测方法。方法以缓冲蛋白胨水为增菌培养基,采用直接提取法提取DNA并测定其核酸浓度。对PCR的退火温度、模板浓度进行优化,把5种目标菌分为两组进行检测分析,并进行特异性和灵敏度实验。结果 5种目标菌培养后均表现出良好的生长趋势。PCR扩增最佳退火温度为59℃, 5种目标菌的引物特异性好,方法的检测灵敏度高。沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌最低检出核酸浓度分别为0.0202、0.158、0.187、2.30和1.05μg/mL。结论该方法简便、快速、灵敏度高,能满足食品安全检测要求。     

荧光型重组酶聚合酶扩增技术检测食品中大肠埃希氏菌O157

研究基于荧光型重组酶聚合酶扩增(exo-RPA)技术原理,建立了一种大肠埃希氏菌O157的快速检测方法。应用该方法对多种大肠埃希氏菌O157菌株和非大肠埃希氏菌O157菌株的检测结果表明,该方法的荧光探针和引物具有良好的特异性。对于梯度稀释的插入靶基因序列的质粒pUC57-rfbE和大肠埃希氏菌0157的检测,大肠埃希氏菌O157 exo-RPA检测灵敏度分别可以达到10~2 copies/μL和2.1×10~4 cfu/mL。对食品样品中大肠埃希氏菌0157的检测,exo-RPA方法显示出了良好的稳定性。并且食品样品中目标菌经4 h增菌后,该方法的灵敏性可以满足对食品样品中初始浓度为2.1×10~1 cfu/mL的目标菌的检测。因为大肠埃希氏菌exo-RPA方法配套设备简便、廉价,所以该方法可以在各级检测机构中推广,并适用于食品生产到消费各环节中大肠埃希氏菌0157的即时检测。     

基于适配体识别的金黄色葡萄球菌定性检测试纸条的研制及应用

本研究以金黄色葡萄球菌为检测靶标,以核酸适配体为识别分子,基于双适配体夹心和侧流层析原理,构建了定性检测金黄色葡萄球菌的适配体试纸条,并对NaCl浓度、适配体浓度、纳米金-适配体包被量及捕获探针包被量等实验条件进行优化,获得适配体试纸条最佳制备条件。在优化条件下对试纸条的灵敏度、特异性进行分析测试,最后将试纸条对116份食品进行金黄色葡萄球菌检测,并与国标法（GB 4789.10-2016）对比验证。结果显示,适配体试纸条最佳制备条件为NaCl浓度为80 mmol/L、适配体偶联浓度为1 μmol/L、结合垫上纳米金-适配体的稀释体积比为1:2、捕获探针浓度为25 μmol/L。在最佳条件下,适配体试纸条对金黄色葡萄球菌的可视化检测限为2×103 CFU/mL,检测时间为5 min,且与其他食源性致病菌如鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、痢疾志贺氏菌等无交叉反应,具有较高的特异性。将本方法应用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检测,检测结果与国标法完全一致。该方法简便快速、准确可靠、成本低,适用于食品样品中金黄色葡萄球菌的定性检测。     

碳纳米生物传感检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种基于碳纳米材料的适配体传感器快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法利用核酸适配体与其靶标之间的特异性结合能力以及碳纳米管的荧光猝灭特性,构建一种新型快速的金黄色葡萄球菌检测方法。结果该方法特异性良好,与非目标菌株无交叉反应。同时,该方法对金黄色葡萄球菌的检出限为10~5 CFU/mL,线性范围为10~5～10~9 CFU/mL,而且在此浓度范围之间呈现良好的线性关系,线性方程为Y=53.22X-39.99,线性相关系数r~2=0.992。结论该方法具有检测速度快、操作简便、检测成本低等特点,为金黄色葡萄球菌的快速检测提供了一种有效手段。     

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术,建立发酵乳中金黄色葡萄球菌定量检测方法。以金黄色葡萄球菌nuc基因为目的片段设计特异性的引物和探针,优化反应体系,通过活菌提取和ddPCR方法对靶标基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对定量结果进行分析。本研究建立了发酵乳中ddPCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法,检测特异性良好,检测灵敏度为3.3×10~1 CFU/g,定量的偏差率为+10.18%,证明了ddPCR用于绝对定量检测的可行性,为其他食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。     

多重实时荧光定量PCR同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌

目的 建立一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR, multiplex qPCR)同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌的方法。方法 针对金黄色葡萄球菌nuc基因、痢疾志贺菌rfc基因、沙门氏菌invA基因、单增李斯特氏菌hly基因, 设计4对引物和探针, 优化反应体系, 建立稳定的多重qPCR反应体系。通过阳性菌株污染的方法验证体系的特异性, 并确定了冷冻蔬菜样品在细菌水平的检出限。结果 各对引物和探针对目标菌有较强的特异性, 对其他非目标菌进行检测均未检出, 人工污染冷冻蔬菜中志贺菌的检出限为102 CFU/g, 沙门氏菌和单增李斯特氏菌的检出限均为103 CFU/g, 金黄色葡萄球菌的检出限为104 CFU/g。结论 本研究可以实现冷冻蔬菜样品中4种致病菌qPCR高效检测。     

核酸适配体在金黄色葡萄球菌检测中的应用进展

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的食源性致病菌,快速检测方法的开发对于防控该菌引发的食源性疾病具有重要意义。生物识别物是快速检测的核心,核酸适配体作为新兴的生物识别物,与靶标分子有高度的亲和力及特异性,且易于人工合成和修饰,在食源性致病菌的检测方面具有较大的潜力和优势。本文综述了核酸适配体的筛选技术及其在金黄色葡萄球菌分离富集和快速检测中的应用进展,以期为食源性致病菌新型检测方法的开发和实际应用拓宽思路。     

SIMULTANEOUS DETECTION OF LISTERIA MONOCYTOGENES, STAPHYLOCOCCUS AUREUS, SALMONELLA ENTERICA AND ESCHERICHIA COLI O157:H7 IN FOOD SAMPLES USING MULTIPLEX PCR METHOD

In this study, one multiplex polymerase chain reaction (MPCR) assay was developed for simultaneous detection of four foodborne pathogens, i.e., Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7. Five specific primer pairs were designed based on the nucleotide sequences of hemolysin gene (hly) of Listeria monocytogenes, thermostable nuclease gene (nuc) of Staphylococcus aureus, invasion gene (invA) of Salmonella enterica, shiga-like toxin gene (stx) and intimin gene (eae) of Escherichia coli O157:H7 in this assay. The specificity and sensitivity of the MPCR method were validated, and the limit of detection (LOD) of this method was about 10 copies. One cfu/mL each of these foodborne pathogens spiked in practical food samples, i.e., ground meat, beef, pork, fish, shrimp, cheese, canola leaf and cabbage, could be detected simultaneously after 24 h enrichment at a rate of 87.5%, indicating that the established MPCR detection method was effective and suitable for practical use.

PRACTICAL APPLICATIONS

This study presents a quick and effective identification method to simultaneous monitor four foodborne pathogens in food samples. The specificity and sensitivity of this method can be used to unambiguously identify these four foodborne pathogens in practical food samples based on the species-specific genes. Therefore, this detection method is applicable for surveillance measures of these four foodborne pathogens in the food production chain.     

核酸适配体在食源性致病菌检测中应用的研究进展

核酸适配体(aptamer)是经体外筛选可特异性识别并结合靶分子的寡核苷酸片段(单链DNA/RNA序列),具有高特异性、高灵敏度、高亲和力及易于修饰等优点,已在食源性致病菌检测领域得到应用。本文主要对核酸适配体筛选技术分类以及纳米金适配体技术、荧光适配体技术、电化学适配体技术、流式细胞适配体技术和表面增强拉曼适配体技术在食源性致病菌检测中的应用作简要综述。     

A novel multiplex PCR assay for rapid and simultaneous detection of five pathogenic bacteria: Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, and Vibrio parahaemolyticus

Rapid and sensitive detection techniques for foodborne pathogens are important to the food industry. However, traditional detection methods rely on bacterial culture in combination with biochemical tests, a process that typically takes 4 to 7 days to complete. Thus, this study was conducted to address the issue of time lag inherent in traditional methods by developing a novel PCR assay for each of five foodborne pathogenic bacteria. This new system consists of a simultaneous screening method using multiplex PCR in a single reaction tube for the rapid and sensitive detection of each of the five bacteria. Specific primers for multiplex PCR amplification of the Shiga-like toxin (verotoxin type II), femA (cytoplasmic protein), toxR (transmembrane DNA binding protein), iap (invasive associative protein), and invA (invasion protein A) genes were designed to allow simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, and Salmonella, respectively. To confirm the specificity of each primer pair for the respective target gene, three types of experiments were carried out using boiled cell lysates and their DNAs. In the multiplex PCR with mixed DNA samples, specific bands for corresponding genes were simultaneously detected from a single reaction. The detection of all five foodborne pathogenic bacteria could be completed in less than 24 h with this novel PCR method.     

高分辨率溶解曲线检测9种食源性致病菌方法的建立

当今食源性疾病已成为一个全球关注的食品卫生问题,常见的细菌性食物中毒的病原菌有:致病性大肠杆菌(特别是出血性大肠杆菌O157:H7)、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性弧菌(包括霍乱弧菌和副溶血弧菌)、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌以及阪崎克罗诺杆菌等。单独检测一种致病菌已无法满足现今社会对同时高效检测多种致病菌的要求,为建立一种同时对上述9种食品中常见致病菌的检测方法,本研究分别以上述9种菌的特异性基因为靶基因,创新性地结合一对通用引物,建立能同时检测多种食源性致病菌的多重HRM-real time PCR检测体系。结果表明该多重HRM-real time PCR检测体系通过两管PCR反应可对上述9种食品中常见致病菌进行有效的检测与区分,且具有良好的特异性和灵敏度。     

Rapid, sensitive, and simultaneous detection of three foodborne pathogens using magnetic nanobead-based immunoseparation and quantum dot-based multiplex immunoassay

Losses caused by foodborne diseases are enormous in terms of human life, illness, medical costs, and food product recalls. Rapid detection of multiple bacterial pathogens in foods is extremely important to ensure food safety. The objective of this research was to develop a multiplex immunoassay by integrating magnetic nanobeads (MNBs) for immunoseparation with quantum dots (QDs) as fluorescent labels for rapid, sensitive, and simultaneous detection of three major pathogenic bacteria, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli O157:H7, and Listeria monocytogenes, in food products. In this research, both streptavidin-conjugated MNBs (30- and 150-nm diameter) and QDs (530-, 580-, and 620-nm emission wavelength) were separately coated with biotinylated anti-Salmonella, anti-E. coli, and anti-Listeria antibodies. The immuno-MNBs were mixed with a food sample to capture the three target bacteria. After being magnetically separated from the sample, the MNB-cell conjugates were mixed with the immuno-QDs to form the MNB-cell-QD complexes, and unattached QDs were removed. The fluorescence intensity of the MNB-cell-QD complexes was measured at wavelengths of 530, 580, and 620 nm to determine the populations of Salmonella Typhimurium, E. coli O157:H7, and L. monocytogenes, respectively. This multiplex immunoassay simultaneously detected Salmonella Typhimurium, E. coli O157:H7, and L. monocytogenes at levels as low as 20 to 50 CFU/ml in food samples in less than 2 h without enrichment. The change in fluorescence intensity was linearly correlated (R(2) > 0.96) with the logarithmic value of bacterial level in the range of 10 to 10(3) CFU/ml. More than 85% of the three target pathogens could be simultaneously separated from food samples. The multiplex immunoassay could be expanded to detect more target pathogens, depending on the availability of specific antibodies and QDs with different emission wavelengths.