熊果酸联合顺铂对卵巢癌干细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

目的:观察熊果酸（ursolic acid,UA）联合顺铂(DDP)对卵巢癌干细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响及其作用机制。方法:通过体外无血清悬浮培养人卵巢癌SKOV3干细胞并进行细胞鉴定。实验分为SKOV3干细胞组、熊果酸组、熊果酸联合顺铂组。MTT法检测干细胞的增殖,Transwell实验检测干细胞侵袭与迁移能力,采用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测干细胞凋亡。Real-time PCR检测上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关标记分子Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、Fibronectin、Twist的mRNA表达情况,Western-blot检测E-cadherin、Vimentin、Twist蛋白表达情况。结果:熊果酸对SKOV3干细胞增殖有显著抑制作用,呈剂量依赖性（P＜0.05）;流式细胞术显示熊果酸组、熊果酸联合顺铂组均可提高SKOV3干细胞的凋亡率,与SKOV3干细胞组相比有统计学差异（P＜0.05）;熊果酸组、熊果酸联合顺铂组可有效抑制SKOV3干细胞的侵袭和迁移能力（P＜0.05）;Real-time PCR测定熊果酸组、熊果酸联合顺铂组作用SKOV3干细胞后EMT基因表达水平,结果显示Fibronectin、Twist、Vimentin、N-cadherin表达降低,E-cadherin表达升高（P＜0.05）;Western-blot结果显示熊果酸组、熊果酸联合顺铂组可上调E-cadherin蛋白的表达,下调Vimentin、Twist蛋白的表达;与熊果酸组相比,熊果酸联合顺铂组对干细胞凋亡率更高,迁移和侵袭能力更低,E-cadherin表达更高,Vimentin和Twist表达更低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论:熊果酸对卵巢癌干细胞有抑制增殖、侵袭和迁移,诱导凋亡的作用,联合顺铂作用效果更优,其机制可能与逆转EMT有关。     

GOLPH3沉默对顺铂诱导的人上皮性卵巢癌 A2780／DDP 细胞凋亡的影响

目的：探究 GOLPH3对顺铂诱导的人上皮性卵巢癌 A2780／DDP 细胞凋亡的影响。方法：不同浓度顺铂处理 A2780和 A2780／DDP 细胞72h,MTT 检测半数抑制浓度 IC50,Western blot 检测 GOLPH3的表达。将培养细胞分为4组：A2780组及 A2780／DDP 组（对照组、Scrambled siRNA 组、GOLPH3 siRNA 组）。40μmol／L顺铂处理48h 后,MTT 检测对细胞活性的影响,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,Western blot 检测对Caspase －3、p －Akt 和 p －mTOR 蛋白表达的影响。Western blot 检测 mTOR 抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）和PI3K／Akt 抑制剂（LY294002）对 Caspase －3蛋白表达的影响。结果：顺铂处理72h 时,A2780和 A2780／DDP细胞的 IC50分别为9．8μmol／L 和60．14μmol／L。与 A2780组相比,A2780／DDP 组 GOLPH3蛋白表达明显增加（P ＜0．05）。GOLPH3 siRNA 转染可显著下调 A2780／DDP 细胞中 GOLPH3蛋白的表达（P ＜0．05）。顺铂处理后,与 A2780／DDP 对照组相比,A2780组和 A2780／DDP 细胞 GOLPH3 siRNA 转染组细胞活性显著降低,顺铂敏感性增加,细胞凋亡率和 Caspase －3蛋白表达上调,p －Akt 和 p －mTOR 蛋白表达下调;LY294002和 Ra-pamycin 处理均显著增加 Caspase －3蛋白表达（P ＜0．05）。结论：GOLPH3沉默可通过抑制 Akt／mTOR 激活促进顺铂诱导的 A2780／DDP 细胞凋亡。     

ATF5蛋白对食管鳞癌细胞耐药性影响

目的 食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)多药耐药严重影响化疗效果,其分子机制仍未阐明.本研究通过构建不同ATF5蛋白表达量的食管癌Eca-109细胞模型,探究过表达ATF5及低表达ATF5对食管癌Eca-109细胞耐药性及凋亡的影响.方法 利用脂质体载体转染技术对食管癌细胞株进行转染,建立高、中(转染空质粒的对照组)、低3组不同ATF5蛋白表达量Eca-109细胞模型.蛋白质印迹法检测3组细胞ATF5蛋白表达水平.MTT实验和平板克隆实验观察3组细胞对紫杉醇、顺铂耐受性的变化;DAPI染料核染色后观察3组细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡反应的差异;分析ATF5蛋白对食管鳞癌Eca-109细胞耐药的影响.结果 利用转染技术成功构建的3组不同ATF5蛋白表达量的Eca-109细胞模型,表达模型组细胞中ATF5蛋白相对表达量为85.9±2.66,对照组为64.35±2.54,低表达模型组为45.3±3.11,3组差异有统计学意义,F=532.323,P＜0.001.MTT实验显示,紫杉醇、顺铂作用72 h后,3组细胞存活率差异有统计学意义,F紫=163.382,P＜0.001;F顺 =579.36,P＜0.001;同一组细胞不同浓度对存活率的影响差异有统计学意义,F紫=616.32,P＜0.001;F顺 =2 558.05,P＜0.001;不同浓度的紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的半数抑制率浓度(IC50)分别为4.16±2.21和1.54±0.67;对照组分别为1.54±0.92和1.27±0.65;低表达组细胞的半数抑制率浓度分别为0.33±0.21和0.53±0.62,3组差异有统计学意义,F紫=198 330.768,P＜0.001;F顺=64 298.048,P＜0.001;表明过表达ATF5的细胞对紫杉醇、顺铂的药物耐受性均明显升高而低表达模型组细胞对紫杉醇、顺铂的药物耐受性均明显降低.DAPI染色实验显示,紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的凋亡率分别为(14.04±1.66)％和(11.75±2.09)％;对照组分别为(26.44±2.99)％和(34.07±3.42)％;低表达组细胞的凋亡率分别为(54.85±5.88)％和(66.66±2.81)％,3组差异有统计学意义,F紫=283.976,P＜0.001;F顺=954.464,P＜0.001.提示过表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡细胞均减少,低表达ATF5细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡细胞均增加.平板克隆形成实验显示,紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的克隆形成率分别为(56.09±1.37)％和(62.67±1.41)％;对照组分别为(38.7±1.37)％和(34.83±3.09)％;低表达组细胞的克隆形成率分别为(25.22土1.58)％和(18.17±3.64)％,3组差异有统计学意义,F紫 =1157.447,P＜0.001;F顺=612.595,P＜0.001.表明过表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下克隆形成数均更多,低表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下克隆形成数减少.结论 上调ATF5蛋白的表达能增加食管鳞癌Eca-109细胞对紫杉醇、顺铂的耐药性,而下调ATE5蛋白的表达则能降低Eca-109细胞对紫杉醇、顺铂的耐药性,提示食管鳞癌细胞的耐药性可能与ATF5蛋白的表达量相关,食管鳞癌细胞中ATF5蛋白的表达情况可能能间接干扰临床药物化疗的效果.     

膀胱癌细胞Cx43对顺铂抗肿瘤作用影响研究

目的 连接蛋白43(connexin43,Cx43)在人体正常组织及肿瘤组织中广泛表达,并且参与细胞的生长控制和组织分化.本研究探讨采用RNA干扰技术沉默膀胱癌5637细胞株Cx43蛋白表达对顺铂化疗敏感性的影响.方法 体外培养膀胱癌5637细胞和正常尿路上皮SV-HUC-1细胞,采用蛋白质印迹法检测膀胱癌5637细胞系和正常尿路上皮SV-HUC-1细胞中Cx43蛋白表达,应用免疫荧光技术检测膀胱癌5637细胞系中Cx43蛋白的定位.采用RNA干扰技术沉默膀胱肿瘤5637细胞株Cx43蛋白的表达并用顺铂(3μg/mL)处理SiRNA-Cx43组(实验组)和SiRNA-Control(对照组)后,通过CCK-8检测实验组、对照组及野生型5637细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测两组癌细胞的凋亡;采用蛋白质印迹法检测顺铂处理后野生型5637细胞后细胞中Cx43、Cleaved Caspase-3的表达及实验组和对照组中Cx43、Cleaved Caspase-3和Bcl-2的表达.结果 膀胱癌5637细胞中Cx43表达较正常尿路上皮细胞高,相对蛋白表达量分别为1.013±0.102和0.556±0.054,两细胞系比较差异有统计学意义,t=3.789,P=0.019;免疫荧光检测Cx43主要定位于细胞质中.CCK-8结果显示,膀胱癌5637细胞随着顺铂药物的浓度(0.75、1.5、3和6μg/mL)和时间(0、1、2、3 d)的增加,细胞的增殖减少,采用重复测量方差分析,各组间比较,差异有统计学意义,F=153.634,P＜0.001;实验组增殖较对照组明显减少,差异有统计学意义,F=9.949,P=0.02.流式细胞仪检测结果显示,实验组和对照组凋亡率分别为(63.00±4.58)％和(34.33±6.03)％,差异有统计学意义,t=7.457,P＜0.01.蛋白质印迹法结果显示,5637细胞随着药物(顺铂3 μg/mL)作用时间增加,Cx43蛋白表达逐渐降低,差异有统计学意义,F=178.868,P＜0.001;而CleavedCaspase-3逐渐升高,差异有统计学意义,F=21.643,P＜0.001.顺铂(3μg/mL,4h)处理实验组和对照组后,CleavedCaspase-3蛋白相对表达量分别为0.740±0.092和0.373±0.091,差异统计学意义,t=6.394,P=0.001;BclL-2蛋白相对表达量分别为0.260±0.066和0.817±0.068,差异统计学意义,t=4.814,P=0.005 结论 沉默膀胱癌5637细胞中Cx43蛋白表达能提高顺铂的敏感性,可能与反常定位于细胞质中的Cx43参与线粒体介导的凋亡途径有关.     

MFG-E8对卵巢癌SKOV3细胞顺铂敏感度的影响及分子机制

目的 探讨沉默MFG-E8基因对SKOV3细胞抗癌药物敏感度的影响及其相关机制。方法 小干扰技术沉默卵巢癌SKOV3细胞中MFG-E8基因并对干扰效率进行测定。CCK-8检测转染MFG-E8 siRNA后SKOV3细胞对顺铂的敏感度。qRT-PCR检测MFG-E8基因沉默后多重耐药蛋白ABCB1及ABCC1 mRNA的表达,qRT-PCR及Western blot检测沉默MFG-E8对ETM相关蛋白的影响。结果 MFG-E8 siRNA可有效沉默MFG-E8蛋白水平的表达;不同浓度顺铂作用于MFG-E8 siRNA转染组与阴性对照组NC siRNA两组细胞48 h后,随药物浓度增高,两组细胞增殖抑制率均上升,MFG-E8 siRNA转染组细胞增殖抑制率上升较明显（P<0.01）。3 μg/ml顺铂浓度作用于两组细胞48、72 h后,与阴性对照组相比,MFG-E8 siRNA转染组细胞增殖活性明显受到抑制（P<0.05）。qRT-PCR结果显示,MFG-E8 siRNA转染组中ABCB1及ABCC1 mRNA表达均明显降低。qRT-PCR及Western blot结果显示,沉默MFG-E8基因可下调SKOV3细胞中N-Cadherin、Vimentin、Snail mRNA及蛋白的表达,上调E-Cadherin mRNA及蛋白表达。结论 沉默MFG-E8基因可增加SKOV3细胞对顺铂的敏感度,下调多重耐药蛋白ABCB1及ABCC1m R N A 表达,其机制可能与沉默MFG-E8抑制EMT进程有关。     

ALDH1A1基因表达沉默对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用

目的：探讨干扰乙醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）基因表达后对鼻咽癌5-8F和CNE2细胞生长、增殖的影响。方法：构建ALDH1A1 siRNA 表达质粒稳定转染鼻咽癌5-8F和CNE2细胞,Western blot 检测干扰ALDH1A1基因蛋白表达水平。MTT、平板克隆、裸鼠成瘤实验检测干扰ALDH1A1基因前后鼻咽癌5-8F和CNE2细胞的增殖、克隆及成瘤能力。结果：与空白组和阴性对照组相比,干扰ALDH1A1表达后5-8F和CNE2细胞增殖、克隆及肿瘤形成能力明显受到抑制。结论：干扰ALDH1A1基因表达,可抑制鼻咽癌细胞的生长、增殖、克隆及成瘤能力。     

DLC1基因对人卵巢癌细胞OVCAR-3顺铂耐药性的影响

背景与目的:有研究发现,肝癌缺失基因1(DLC1)在多种肿瘤中低表达或不表达,其通过调节黏着斑激酶(FAK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等影响肿瘤细胞的凋亡.而对于DLC1在卵巢癌中的表达及作用等的研究甚少,本实验采用DLC1基因转染该基因表达缺失的人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3,观察转染前后该细胞对顺铂耐药性及FAK、p38MAPK的变化.方法:将OVCAR-3细胞分为3组,空白组为未经处理的OVCAR-3细胞,阴性对照组转染空质粒pEGFP-C3,实验组转染重组质粒pEGFP-C3-DLC1.RT-PCR和Western blot检测各组细胞中DLC1基因和蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定各组细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50),Western blot观察FAK、p38蛋白及其磷酸化水平的变化,流式细胞仪测定顺铂处理前后各组细胞凋亡率及周期分布改变.结果:DLC1基因和蛋白在实验组表达而空白对照组和阴性对照组均未见表达,实验组细胞与其他两组细胞相比,对顺铂的IC50较低(4.02 vs 4.99/4.90 μmol/L,P＜0.01),p-p38蛋白表达上升而p-FAK蛋白表达下降(3.02 vs 1.52/1.61,3.13 vs 9.03/8.99,P＜0.01),顺铂处理前后实验组与其他两组细胞相比凋亡率增加(8.97% vs 1.81%/1.95%,30.68% vs 18.03%/20.33%,P＜0.01),G1期细胞比例增加(65.80% vs60.82%/59.80%,66.48% vs 55.42%/53.94%,P＜0.05).结论:转染DLC1基因可使OVCAR-3G1期细胞比例及凋亡率升高,对顺铂敏感性增加,该作用可能依赖于细胞内外源性DLC1基因的表达、p-FAK表达降低和p-p38表达增强.     

hif-1α基因沉默对宫颈癌HeLa细胞增殖及对顺铂敏感度的影响

目的研究靶向干扰hif-1α基因表达后,对HeLa细胞增殖及其对顺铂敏感度的影响。方法构建针对hif-1α基因的干扰载体并转染HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,经RT-PCR与Western blot鉴定抑制效果,用MTT法观察抑制hif 1α基因表达后,HeLa细胞增殖的变化,RT-PCR检测在低氧培养条件下HeLa/shRNA-i细胞葡萄糖转运蛋白1 mRNA的水平,利用MTT法观察抑制hif-1α表达后HeLa细胞对顺铂敏感性的改变。结果HeLa/shRNA-i细胞与对照细胞组相比,hif-1α基因mRNA表达降低了62%,蛋白表达明显降低,MTT显示细胞吸光度值降低,低氧条件下葡萄糖转运蛋白1 mRNA表达降低,对顺铂药物的敏感度增高,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论hif-1α基因的沉默可以抑制HeLa细胞的增殖并且能够增强HeLa细胞对顺铂的敏感度。     

RNA干扰STMN1基因表达通过Notch信号通路诱导胃癌细胞凋亡及增强化疗敏感性的研究

摘 要：［目的］ 探讨RNA干扰微管不稳定性蛋白(STMN1)基因表达通过Notch信号通路对胃癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响。［方法］ RT-PCR及Western blotting分别检测人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MKN28、SGC7901、BGC823中STMN1 mRNA及蛋白表达;STMN1-siRNA转染BGC823细胞,同时设定对照组和阴性对照组,转染48h后RT-PCR及Western blotting分别检测STMN1 mRNA及蛋白表达;后续实验分为对照组、STMN1-siRNA组、顺铂组、STMN1-siRNA+顺铂组,细胞培养48h后,CCK8及流式细胞仪分别检测细胞增殖及凋亡情况;Western blotting检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、Notch1、Hes1蛋白表达。［结果］ STMN1在MKN28、BGC823、SGC7901胃癌细胞中的mRNA及蛋白表达均显著高于在GES-1细胞中的表达（P<0.05）,选择BGC823细胞作为研究对象;转染STMN1-siRNA后BGC823细胞中STMN1的mRNA及蛋白表达均显著低于对照组（P<0.05）;STMN1-siRNA组、顺铂组、STMN1-siRNA+顺铂组OD值及Notch1、Hes1蛋白表达均显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著高于对照组（P<0.05）,STMN1-siRNA+顺铂组OD值及Notch1、Hes1蛋白表达均显著低于STMN1-siRNA组和顺铂组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著高于STMN1-siRNA组和顺铂组（P<0.05）。［结论］ RNA干扰STMN1表达可通过抑制Notch信号通路增强顺铂对胃癌细胞增殖的抑制及凋亡的促进作用。     

IFIT3对鼻咽癌CNE⁃2R细胞侵袭转移及EMT的影响

目的 探讨干扰素诱导的具有四肽重复序列3（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3,IFIT3）在鼻咽癌CNE⁃2R细胞中的表达及其对细胞侵袭、转移和上皮⁃间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition,EMT）能力的影响。方法 采用RT⁃qPCR和 Western blot检测IFIT3在鼻咽癌细胞CNE⁃2R和正常鼻咽上皮细胞NP69中的表达水平。鼻咽癌CNE⁃2R细胞分别感染IFIT3 shRNA的3个序列LV1、LV2、LV3,并设立阴性对照组（NC组）;利用RT⁃qPCR和 Western blot检测上皮表型E⁃cadherin及间质表型N⁃cadherin和Vimentin的表达,采用划痕实验及Transwell 实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果 IFIT3在鼻咽癌CNE⁃2R细胞中的mRNA和蛋白表达水平均较NP69细胞显著上调（均P<0.001）。IFIT3在LV1组、LV2组和LV3组中的mRNA和蛋白表达水平均低于NC组（均P<0.001）,且以LV2组和LV3组的表达水平最低。与NC组相比,LV2组和LV3组的细胞迁移率显著下降,迁移和侵袭细胞数显著减少,E⁃cadherin蛋白表达水平显著升高,N⁃cadherin和Vimentin蛋白表达水平显著降低（均P<0.001）。结论 IFIT3在鼻咽癌CNE⁃2R细胞中表达上调,沉默IFIT3后CNE⁃2R细胞的侵袭、转移能力以及EMT显著被抑制。      

siRNA沉默LOX基因对鼻咽癌细胞侵袭及迁移能力的影响

目的:探讨RNAi干扰赖氨酰氧化酶基因(LOX)后对鼻咽癌细胞5-8F侵袭及迁移能力的影响。方法:设计并构建针对LOX基因的RNAi片段,脂质体介导siRNA-LOX-01（siRNA-LOX-01 组）和siRNA-LOX-02（siRNA-LOX-02组）转染5-8F细胞,同时设非特异性干扰片段为对照组。应用实时荧光定量PCR、免疫印迹试验检测转染后各组LOX的mRNA和蛋白表达及上皮间质转化（EMT）相关指标E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、MMP9 等的表达变化;细胞黏附实验、基底膜侵袭实验和细胞划痕实验分别研究LOX基因沉默后对5-8F细胞侵袭及迁移能力的影响。结果:与对照组相比,siRNA-LOX-01组和siRNA-LOX-02组LOX表达在mRNA 及蛋白水平下降,细胞的迁移速率变慢,穿膜细胞数减少,细胞黏附率增加(均P<0.05),E-cadherin的表达增加,N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug及MMP9的表达减少。结论:干扰LOX能明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭及迁移能力,作用机制可能与N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug及MMP9蛋白表达下调有关,LOX有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。     

miR-429在鼻咽癌细胞中的表达及其对细胞增殖、迁移的影响

目的:探讨微小RNA-429（miR-429）在鼻咽癌细胞中的表达及其对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法:选取本院收治的78例鼻咽癌患者为鼻咽癌组,另选取同期因其他疾病需进行鼻内镜手术患者33例为对照组。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测两组组织中miR-429的表达。体外培养人鼻咽上皮细胞NP69与鼻咽癌细胞株CNE-2,将miR-429阴性对照质粒、miR-429 mimics质粒分别转染至CNE-2细胞,分别命名为阴性转染组、miR-429过表达组,未经处理的细胞命名为空白组,采用qRT-PCR技术检测各转染组细胞中miR-429表达。MTT法检测各转染组细胞增殖情况;平板克隆细胞形成实验检测细胞菌落形成情况;Transwell检测细胞迁移及侵袭能力;蛋白免疫印迹（Western blot）检测E盒结合锌指蛋白（ZEB1）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、钙黏附蛋白E（E-cadherin）蛋白表达量。结果:鼻咽癌组织中miR-429表达水平显著低于对照组（P＜0.05）,且CNE-2细胞中miR-429表达水平显著低于NP69细胞（P＜0.05）;miR-429过表达组miR-429表达水平显著高于空白组、阴性转染组（P＜0.05）;miR-429过表达组细胞增殖能力显著低于空白组、阴性转染组（P＜0.05）;miR-429过表达组细胞菌落形成、迁移细胞及侵袭细胞数量均显著低于空白组、阴性转染组（P＜0.05）;miR-429过表达组细胞中ZEB1、MMP-2蛋白表达水平显著低于空白组、阴性转染组,而E-cadherin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。结论:鼻咽癌细胞中miR-429呈低表达,miR-429过表达后可显著抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭。     

E-cadherin和p16基因蛋白在鼻咽癌中的表达及意义

目的：探讨Ｅ－钙粘素（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）和p１６基因与鼻咽癌发生发展的关系。 方法：采用免疫组化方法检测７４例鼻咽癌组织和２０例炎性鼻咽部组织中Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ和p１６基因蛋白的表达。结果：炎性组织Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ和p１６显著高于鼻咽癌组织（Ｐ〈０．０５）；Ｅ－ｃａｄｈｅｉｎ和p１６保留表达与临床分期、病灶大小 无关（Ｐ〉０．０５），但在颈淋巴结转移组显著低于无颈淋巴结转移组（Ｐ〈０．０５）     

肾癌中E-cadherin甲基化状态的检测及其与β-catenin表达的关系

目的:研究肾癌（renal cell carcinoma,RCC）中E-钙黏蛋白(E-cadherin)甲基化状态的检测及其与β-链蛋白（β-catenin）表达的关系。方法:应用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific PCR,MSP）技术检测53例肾癌组织及相应癌旁正常组织中E-cadherin基因的甲基化状态。免疫组织化学SP法检测53例肾癌组织及相应癌旁正常组织中E-cadherin和β-catenin蛋白的表达。结果:在基因水平和蛋白水平,E-cadherin甲基化与β-catenin的蛋白表达呈负相关（r=-0.361,P<0.05）;在蛋白水平,E-cadherin与β-catenin呈正相关（r=0.716,P<0.001）,在基因水平和蛋白水平,E-cadherin甲基化与蛋白表达呈负相关（r=-0.296,P<0.05）。结论:E-cadherin和β-catenin可能共同参与了包括肾癌的发生、发展、侵袭、转移等一系列病理过程。肾癌组织E-cadherin基因甲基化的发生可能与β-catenin抑制表达有关,可通过β-catenin与Wnt传导通路产生交互协同作用,影响β-catenin的细胞内分布,共同影响肾癌的侵袭转移进程。同时,提示Wnt通路在肾癌中处于激活状态,表明该传导通路的异常激活与肾癌的发生关系密切。     

细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin在胃癌中的表达及其临床意义

目的 探讨胃癌组织、癌旁胃组织中细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin在胃癌转移 扩散中的作用及三者间的相互关系。方法 收集52例胃癌标本（腺癌）、30例距癌组织边缘10 cm以 上的癌旁胃组织标本作为对照。应用免疫组织化学Elivision法检测这些组织中的细胞骨架蛋白4.1N与 E-cadherin、β-catenin的蛋白表达情况。结果 胃癌组织中细胞骨架蛋白4.1N、E-cadherin及β-catenin 蛋白表达明显低于对照组（P<0.05）;低分化胃癌组织中细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin的 蛋白表达较高-中分化胃癌组织表达显著降低（P<0.05）;细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin 的蛋白在无淋巴结转移的胃癌组与有淋巴结转移的胃癌组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;细胞 骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin的蛋白在胃癌组织中的IOD值随着TNM分期的增高而降低,组间 比较差异具有统计学意义（P<0.05）,细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin的蛋白的表达与胃癌 患者的年龄、性别无关（P>0.05）;细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin（r=0.381,P<0.05）、E-cadherin 与β-catenin（r=0.571,P<0.05）、细胞骨架蛋白4.1N与β-catenin（r=0.602,P<0.05）之间均呈正相关 关系。结论 细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin在胃癌中的表达呈正相关,三者在胃癌发生发 展中可能具有重要的协同作用。     

siRNA干扰KLF8表达对鼻咽癌细胞上皮间质转化的作用

目的 探讨下调KLF8的表达对鼻咽癌CNE1-LMP1细胞侵袭能力的影响及其机制。方法 通过脂质体转染法将KLF8 siRNA真核表达质粒稳定转染至鼻咽癌细胞株CNE1-LMP1。Western blot和RT-PCR法检测CNE1-LMP1细胞中KLF8、E-cadherin、N-cadherin蛋白和mRNA表达水平的变化。Transwell侵袭实验观察siRNA后对CNE1-LMP1细胞侵袭能力的影响。结果 KLF8 siRNA转染的CNE1-LMP1细胞株与其阴性对照NC-si组比较KLF8蛋白和mRNA表达水平均下调,证实稳转细胞株建立成功。KLF8 siRNA可上调CNE1-LMP1细胞中E-cadherin的表达,而下调N-cadherin的表达。Transwell侵袭实验显示siRNA干扰CNE1-LMP1细胞侵袭能力下降。结论 KLF8在鼻咽癌CNE1-LMP1细胞中高表达;通过siRNA下调KLF8的表达能干扰上皮间质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达,阻断EMT过程,抑制CNE1-LMP1细胞侵袭转移。     

E1A基因通过抑制NF-κB信号通路增加鼻咽癌细胞放射敏感性实验研究

目的 探讨E1A基因对人鼻咽癌细胞放射敏感性的影响及其可能机制。方法 通过腺病毒载体介导,将E1A基因转染至鼻咽癌CNE-2R细胞,采用RT-PCR鉴定E1A基因的表达;分别给予未转染组(PBS组)、转染空载体Ad-β-gal组(Ad-β-gal组)和转染E1A组(Ad-E1A组)的CNE-2R细胞0、2、4、6、8 Gy照射,应用克隆形成实验检测各组CNE-2R细胞放射敏感性的变化;流式细胞术检测各组细胞的凋亡;蛋白印迹法检测各组细胞NF-κB、CK2α、Bcl-2及Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果 RT-PCR确认E1A基因已整合到CNE-2R细胞中且稳定表达;Ad-E1A组CNE-2R细胞克隆形成率明显少于PBS和Ad-β-gal组的克隆形成率,Ad-E1A组CNE-2R细胞SF2为0.217小于 PBS组和Ad-β-gal组的0.602和0.585(P<0.05),Ad-E1A组α/β值为24.68大于PBS组和Ad-β-gal组的5.268和5.132(P<0.05);流式细胞术显示单独放射可促进CNE-2R细胞的凋亡,当与E1A基因联合使用时,细胞凋亡率明显增加(P<0.05);蛋白印迹法显示E1A基因可下调NF-κB/P65、CK2α、Bcl-2和上调Cleaved caspase-3的表达。结论 E1A基因可以通过抑制CK2的表达阻断NF-κB信号通路以及促进细胞凋亡,来提高鼻咽癌细胞对放射的敏感性。     

ZONAB和E-cadherin在膀胱癌细胞系中的表达及RNA干扰ZONAB表达对癌细胞侵袭力的影响

目的:探讨慢病毒介导ZONAB基因的RNA干扰对膀胱癌侵袭力的影响.方法:用Realtime PCR法分别检测人类尿路上皮永生细胞系sv-huc-1和膀胱尿路上皮癌细胞系UM-UC-3、T24、5637中ZONAB和E-cadherin的mRNA表达水平,用Western blot法分别检测各细胞系中ZONAB蛋白表达水平,设计、合成干扰靶点,构建纯化重组慢病毒,感染人膀胱癌UM-UC-3细胞,根据ZONAB基因的抑制率,筛选最有效的ZONAB基因RNAi靶序列组,验证ZONAB基因的沉默效果,用Transwell侵袭试验检测UM-UC-3细胞体外侵袭力的改变.结果:Realtime PCR法和Western blot法测得UM-UC-3、T24、5637中ZONAB的表达水平高于sv-huc-1,均具有显著性差异(P<0.05);而Realtime PCR法测得UM-UC-3、T24、5637中 E-cadherin的mRNA表达水平低于sv-huc-1(P<0.05).成功构建ZONAB基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,与对照组相比RNA干扰组UM-UC-3细胞ZONAB基因mRNA水平的抑制率为71.4%(P<0.05),蛋白水平抑制率为76.8%,其穿过人工基底膜的平均细胞数为13.1±2.8/HP,明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05).结论:ZONAB在膀胱癌细胞系中表达上调,慢病毒介导ZONAB基因的RNA干扰能够抑制UM-UC-3细胞侵袭.     

lncRNA LAMA5-AS1通过上调TFPI2表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移

目的:检测鼻咽癌组织和细胞株中长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LAMA5-AS1的表达，观察lncRNA LAMA5-AS1对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响并探讨其作用机制。方法:荧光实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分别检测lncRNA LAMA5-AS1在68例鼻咽癌组织及62例慢性鼻咽炎组织、鼻咽癌细胞株及永生化鼻咽上皮细胞中的相对表达。选择lncRNA LAMA5-AS1表达最少的细胞株，分别转染阴性对照质粒（对照组）或载有lncRNA LAMA5-AS1序列质粒（实验组）。MTS法和细胞划痕实验分别检测高表达lncRNA LAMA5-AS1对细胞增殖和迁移能力的影响。qPCR检测高表达lncRNA LAMA5-AS1对组织因子途径抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）基因mRNA表达的影响，Western blotting检测TFPI2蛋白和ERK信号通路蛋白表达。结果:与慢性鼻咽炎组织比较，lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌组织中表达明显降低（P＜0.01）。与人永生化鼻咽上皮细胞比较，lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌细胞株中表达明显降低（P＜0.01），在CNE-2Z细胞中的表达最少（P＜0.01）。与对照组比较，实验组CNE-2Z细胞的增殖能力从第3天开始明显降低（P＜0.05），实验组CNE-2Z细胞迁移能力明显下降（P＜0.01）。与对照组比较，实验组CNE-2Z细胞中TFPI2在mRNA和蛋白水平的表达明显增加（P＜0.01），ERK信号通路蛋白p-ERK、MSK1、MNK和STAT3表达明显降低。结论:lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌组织和细胞株中表达明显降低，高表达lncRNA LAMA5-AS1可通过上调TFPI2基因表达、下调ERK信号通路活性，抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖和迁移能力。     

MYB基因沉默抑制子宫颈癌细胞侵袭、迁移及其作用机制探讨

目的:探究沉默转录因子MYB对子宫颈癌细胞侵袭、迁移的影响以及可能的作用机制。方法:将携带MYB目的片段的siRNA转染入人子宫颈癌HeLa细胞中。实验分为对照组、阴性对照组和siRNA-MYB组。采用荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）检测转染效果。细胞划痕实验和Transwell法检测细胞的迁移、侵袭能力。Western Blot检测各组细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、钙黏蛋白E（E-cadherin）、钙黏蛋白N（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）水平。结果:与对照组相比,阴性对照组细胞中MYB的表达量、细胞侵袭、迁移均无显著变化,差异不具有统计学意义;siRNA-MYB组细胞中MYB的表达量显著降低（P<0.05）,沉默MYB显著抑制子宫颈癌细胞的侵袭、迁移（P<0.05）,并下调细胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达量（P<0.05）,上调E-cadherin蛋白的表达量（P<0.05）。结论:沉默宫颈癌细胞中MYB的表达量可通过抑制EMT、下调MMP-2蛋白水平,从而降低细胞的侵袭、迁移能力。