生孢噬纤维菌CMcase基因的分离与表达

从生孢噬纤维菌中分离完整的基因组DNA,经过PstI限制性内切酶部分酶切后,在T4DNA连接酶作用下,将酶切的片段连接到载体pUC18的PstI位点中,然后转化到E.coli DH5α中,构建了基因组文库,经过筛选获得4.2x103个重组子。经过刚果红平板筛选获得了含有CMCase基因片段的重组子,在E.coli中进行表达,E.coli在37℃培养25~30h,培养液中CMCase活力达到22.8U/mL。     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径,以提高L-组氨酸的产量．用NTG诱变大肠杆菌M-17（SG^r）,依次赋予其2噻唑丙氨酸（2-TA）和组氨酸氧肟酸盐（HisHx）遗传标记,再以突变株M-18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his—operon,将重组质粒导入突变株M—18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）得到工程菌Ecoli M-19（SG^r＋2．TA^r＋HisHx^r／pUC118-his—operon）．根据硝和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E．coli MZH-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L-组氨酸的产量．摇瓶发酵结果显示,L-组氨酸产量与对照株相比,工程菌E．coli M-19提高了4．5倍,双质粒系统重组工程菌E．coli MZH-19、Ecoli MPH-19和E．coil MZPH-19分别提高了5．14、5．78、8．43倍．     

表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性

构建了组成分泌表达载体pUC18ompA,将荧光假单胞菌Pf-5鞭毛蛋白的编码基因fliC克隆到pUC18ompA构建pUC18ompA-fliC,重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建了工程菌。工程菌与无菌松材线虫混合接种黑松无菌苗,研究其对无菌苗的致病能力。接种试验结果表明,工程菌与无菌松材线虫混合接种同样可以引起黑松无菌苗的萎蔫。进一步验证了体内荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松材线虫病致病过程中的作用。     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌(IAM11001)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB,构建具T7强启动子的PET-20-(b)-BgaB质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，经IPTG诱导的后，重组菌周质中乳糖酶酶活达到0.12U/mL，胞内酶活为1.35U/mL，比酶活为6.66U/mg蛋白，比酶源菌产生的酶活提高5倍，通过对IPTG诱导时机，诱导浓度和诱导时间的优化研究，重组细菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的90倍。     

乳酸脱氢酶A(ldha)基因的克隆与原核表达

乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶,在厌氧条件下能催化丙酮酸生成乳酸;当动物体内缺乏葡萄糖时,还可氧化乳酸生成丙酮酸并经葡萄糖异生途径转变为葡萄糖。通过反转录PCR获得了Hela细胞中的ldha基因,并将它克隆到pET28a(+)载体上,获得重组表达载体pET28a(+)-ldha。重组质粒通过转化法转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中。SDS-PAGE分析表明,在1.0 mmol·L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了一条分子质量约为36 kDa的目标蛋白。     

小鼠肝脏羧酸酯酶的cDNA克隆、表达及应用

从小鼠肝脏中克隆羧酸酯酶（CES）基因家族成员Ces1f的cDNA,在大肠杆菌中表达,并验证重组酶对农药的作用。采用RT-PCR克隆Ces1f cDNA,与pUCm-T载体连接测序后,亚克隆至表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a-Ces1f,转化到宿主菌BL21（DE3）后经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定,采用Ni柱对表达产物进行纯化并测重组CES的酶比活,利用HPLC验证重组酶对不同农药的作用。结果显示：成功获得纯化的77kDa的重组CES蛋白,其酶液的比活为55.37U/mg,HPLC检测发现重组CES对西维因、呋喃丹及甲基对硫磷等具有降解作用。成功表达重组CES,其对农药具有降解作用,为环境中农药残留的降解奠定了基础。     

纺织用嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶 在大肠杆菌中的重组表达、纯化与酶学性质

首先从Pyrococcus horikoshii中克隆出编码热稳定性的内切纤维素酶基因，以载体pet21a为表达质粒， 构建重组质粒pet21a-1171，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达，目的基因得到明显的可溶性表达，通 过加热变性处理和离心后，重组酶纯度达到80%以上，随后对加热处理后的粗酶液进行简单酶活测定，结果表明， 最适反应温度为95℃，与国外文献报道相一致，嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重组可溶性表达。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

蔗糖转化酶SUC2在商品化酿酒酵母中的高水平表面展示

蔗糖转化酶SUC2是酿酒酵母水解菊糖的关键酶,但SUC2在酿酒酵母中的低水平表达限制了其理性改造酿酒酵母以获得高效生产菊糖基乙醇工程菌的进程。本实验通过克隆获得蔗糖转化酶SUC2的编码基因,并利用AGA1-AGA2锚定蛋白复合体将SUC2表面展示于商品化酿酒酵母菌株EBY100中。酶活力测定结果表明,表面展示有SUC2的重组菌EBY-S蔗糖酶活及菊糖酶活分别达到241.6和9.4 U/mL,较之前报道的过表达SUC2的酿酒酵母重组菌酶活力有显著提高。该结果表明,AGA1-AGA2锚定蛋白复合体能够成功地将SUC2表面展示于酿酒酵母细胞壁上。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

分解酒糟生物质的纤维素酶生产菌的筛选研究

从白酒糟采集的样品中分离到15株菌,经过刚果红染色,初筛得到产纤维素酶酶活较高的5株菌。纤维素酶和滤纸酶活研究结果表明,这5株菌在分泌纤维素酶活力及降解滤纸能力方面均较强,其分解纤维素的酶活最高达到11.9 U/mL,而分解滤纸的酶活力则最高达到6.4 U/mL。最适产酶条件为:发酵时间72~96 h,发酵温度25~30℃。对酒糟发酵减重最高达18%。     

贻贝粘合蛋白基因转化巴斯德毕赤酵母

贻贝粘合蛋白可以作成性能优异的生物防腐剂和粘合剂。报道了一种新的贻贝(Mytilus sp．JHX-2002)的粘合蛋白基因(msfp-1)转化载体的构建，以及该质粒转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris，Gs115)。将克隆载体pUC118／msfp-1以及质粒pPIC9K分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，连接获得表达载体pPIC9K／msfp-1，电击法转化至Gs115中。组氨酸野生型检测以及PCR检测，从而获得msfp-1基因重组酵母菌Gs115／msfp-1。     

HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

对构建HPV16 E6基因的原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6进行研究.从宫颈癌细胞株CaSki细胞中提取的的DNA基因组为模板,设计一对特异性引物,用PCR法扩增出HPV16E6基因片段.HPV16E6基因片段和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后用T4 DNA连接酶连接.构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6转化大肠杆菌DH5α,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21 Star-DE3 Plyss中,构建了HPV16 E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16E6.HPV16E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6的构建为HPV16 E6重组蛋白的制备和为宫颈组织HPV16型感染的早期诊断和相关治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

重组质粒pMG36e-nisI-gfp在乳酸菌中的应用

本研究将带有nisI和咖（绿色荧光蛋白）基因的乳酸菌表达载体pMG36e-nisI-gfp转化至乳酸菌中,观察其在宿主内的稳定性．对重组菌进行了菌体形态、传代培养、质粒验证等研究,考察了该质粒的稳定性．结果显示：重组菌在不含抗生素的培养基中连续传代20代后,质粒丢失率低;菌体大小和形态基本不变;质粒经HindⅢ酶切后大小不变;GFP在第0、5、10、15和20代宿主菌中都可以表达,表达量没有明显差别,在SDS-PAGE中的带型一致;初步的动物实验验证了该质粒作为遗传标记的应用效果．说明该质粒在宿主菌中具有良好的稳定性．     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus的耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB被克隆到大肠杆菌—枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中，然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合栽体pSAS144中，转化Bacillus subtilis受体菌BD170，在5μg／mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子，经摇瓶发酵后，得到耐热乳糖酶的比酶活为0．32U／mg，是出发菌株比酶活的2倍。     

透明颤菌vgb基因整合型大肠杆菌的培养特性

透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种氧调节、氧结合蛋白，其基因vgb的表达在转录水平上受氧调控。大肠杆菌E.coli BV是采用基因同源重组方法将vgb基因整合到基因工程常用宿主菌E.coli BL21中构建得到的。研究了不同价态的铁离子对同源重组菌的生长特性及VHb合成的影响，研究表明，0．2mmol/L的二价铁离子具有促进VHb表达从而刺激菌体细胞生长的作用。在0．1L／h低通气量条件下，E．coli BV分别进行间歇培养和流加培养，低溶氧刺激VHb在短时间内迅速大量合成，改善了细胞内氧的传递性能，使生长期分别延长到25h和45h，生物量(DCW)分别达到9．6g/L和26g/L。     

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌cglutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵卜异亮氨酸产量的影响．以L-异亮氨酸生产菌cglutamicum YILW基因组为模板克隆horn基因,将horn基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入Cglutamicum YILW构建C．glutamicum YILW（pXMJ19．hom）．通过5L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响．结果显示,重组酶的表达使菌株对卜苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强．最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36．5g／L和2．8g／L,分别较出发菌株提高7％和33％,同时L-赖氨酸合成量仅为2．1g／L,较出发菌株降低了63．8％．     

大肠杆菌生产重组极耐热木聚糖酶的诱导条件及其酶学性质

构建重组菌(JM109／pTre-99A-xylIV)作为极耐热木聚糖酶的生产菌株，研究了IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长的不同阶段加IPTG和温度对重组菌生产极耐热木聚糖酶的影响以及它的酶学性质．结果表明，IPTG诱导8h后极耐热木聚糖酶的表达量基本维持不变，0．5～5mmol／L浓度的IPTG诱导重组菌表达极耐热木聚糖酶的效果基本相同；当重组菌生长到OD600为1．2左右时加IPTG诱导最好，诱导温度对极耐热木聚糖酶表达水平的影响不大．重组耐热木聚糖酶的最适反应pH值为5．4～5．8，重组极耐热木聚糖酶的最适反应温度大于100℃，重组极耐热木聚糖酶在pH值4．2～7．5都比较稳定，重组极耐热木聚糖酶的温度稳定性好，在90℃下保温2h后残存酶活还有90％。     

GLP-1毕赤酵母表达载体的构建及重组菌株的筛选

选择了一种人胰高血糖素样肽(GLP)-1作为研究对象,全基因合成GLP-1基因序列,用限制性内切酶Xba I和Xho I双酶切合成后的pUC57质粒获得目的基因。以XbaI和XhoI双酶切表达质粒pPICZαA,将目的基因与表达质粒pPICZαA用T4连接酶连接,构建pPICZαA-GLP-1质粒,转入毕赤酵母GS115。合成的目的基因序列为128bp,用GLP-1特异性引物扩增阳性重组子,得到120bp左右的片段。将此特异性片段扩增回收,测序发现确为GLP-1基因,表明成功转入毕赤酵母中。为进一步研究GLP-1在毕赤酵母中的高效表达奠定了坚实的基础。