梧宁霉素C组分高产突变株的获得和产物初步鉴定

目的 选育抗真菌抗生素梧宁霉素高产菌株.方法 本文通过紫外线诱变的方式对不吸水链霉菌梧州亚种04(Streptomyces ahygroscopicus subsp.Wuzhouensis 04)进行菌种选育,并使用白念珠菌作为生物活性鉴定菌筛选高产突变株.结果 经筛选得到一株具有很高抑菌活性的突变株,在发酵液表观粘度、菌丝形态、组分分布等方面与出发菌株有明显差异.结论 经高效液相色谱及飞行时间质谱对产物的分析,证实该突变株为原出发菌株中含量较低的茴香霉素的高产菌株.     

常压室温等离子体-紫外复合诱变选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

摘要：目的 通过对新硫肽类抗生素166A产生菌小单孢菌TMD166进行诱变选育研究,以期获得产166A的高产菌株。方 法 使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system, MPMS)对出发菌株TMD166的孢子进行等离子体-紫 外(MPMS-UV)复合诱变,单孢子悬液经照射处理、涂布培养后获得单菌落,并以牛津杯固体发酵高通量筛选方法对菌株进行初 筛,之后对高产菌株进行摇瓶复筛,利用突变株摇瓶发酵的化学效价筛选出正突变菌株。结果 对比MPMS-UV不同诱变剂量发 现,MPMS105s-UV60s复合诱变剂量获得的正突变率最高,达到41.43%,相应致死率为99.88%。最终筛选出一株166A高产突 变株TMD166-MU1,在培养温度为28℃、210 r/min的条件下,经过96~120 h培养后,166A产量相比出发菌株提高了7.47倍。结 论 采用MPMS-UV复合诱变方式,再结合牛津杯固体发酵高通量筛选方法和摇瓶复筛,可高效筛选获得166A高产菌株。     

ARTP诱变结合抗性筛选选育西索米星高产菌株

目的 利用等离子体诱变,结合抗生素抗性筛选,获得西索米星高产菌株。方法 首先通过链霉素抗性筛选,获得一株比出发菌株产抗能力高的S4;随后以S4为出发菌株,经等离子体处理40s,借助巴龙霉素抗性筛选,得到双重抗性菌株。最后对突变株进行再次诱变,并结合高浓度链霉素抗性筛选。结果 获得一株高产突变株M. inyoensis SAAP22,比出发菌株效价提高了38.18%,具有稳定的遗传性能。结论 通过等离子体诱变,结合抗生素抗性筛选,可有效提升伊尼奥小单孢菌的西索米星合成能力,所得高产菌株具有潜在应用价值。     

达托霉素产生菌前体物耐受选育及其流加补料发酵

目的 通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,以及前体物补料发酵方式提高达托霉素的产量。方法 采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)技术对玫瑰孢链霉菌进行诱变,以癸酸铵和甘氨酸耐受作为选择压力进行菌株筛选,在摇瓶和100L发酵罐上进行癸酸铵流加补料试验确定最佳的发酵工艺。结果 经诱变选育获得1株突变株FIM-D1568摇瓶效价达到380mg/L,发酵单位较出发菌株提高了35.7%;通过优化100L发酵罐流加补料癸酸铵溶液工艺,使达托霉素发酵效价达到2276mg/L。结论 以ARTP为诱变源,甘氨酸及癸酸铵耐受性为选择性压力,可以快速筛选获得达托霉素高产菌;高产突变菌株在流加补料发酵工艺上优良性状得以发挥,发酵效价大幅提高。     

多杀菌素产生菌的高通量诱变选育

目的 利用高通量筛选方法进行刺糖多孢菌诱变选育获得多杀菌素高产菌株.方法 以ASAGF73为出发菌株,通过亚硝基胍(NTG)诱变,并利用96孔板发酵培养结合快速生物测定进行高通量筛选.结果 诱变剂量为2mg/mL,诱变时间50min时突变株多杀菌素产量有较大幅度提高.通过3轮复筛验证最终获得8株产量分别比出发菌株提高了43.94％、33.76％、29.41％、28.61％、27.40％、26.42％、25.59％和20.40％的突变株.结论 利用高通量筛选方法可以快速获得多杀菌素高产菌株.     

基于深孔板培养高通量筛选rakicidin B1高产菌的研究

目的 获得rakicidin B1的高产突变菌株。方法 建立深孔板发酵rakicidin B1的方法,结合常压室温等离子体技术(ARTP)及核糖体工程对rakicidin B1的产生菌进行高通量诱变选育。结果 获得一株高产突变菌株R36-27,其摇瓶发酵产量达到490mg/L左右,较出发菌株提高了237.9%;经遗传稳定性考察验证了该菌株稳定性较好。结论 采用ARTP为诱变源,以庆大霉素抗性为选择压力,结合深孔板高通量筛选,可以快速有效地获得高产菌株。     

紫外诱变和氨基酸抗性筛选选育那西肽高产菌株

目的 筛选出那西肽高产菌株.方法 以活跃链霉菌CB040517作为出发菌株,通过紫外-氧化锂诱变处理,并结合前体复合氨基酸抗性筛选,选育那西肽高产菌.结果 通过致死率和正突变率的考察,确定紫外最佳诱变剂量为100s.在分离培养基上层加入氯化锂和底层加入复合氨基酸进行正突变株的定向筛选,选育得到那西肽高产菌株UV-19-A12,其摇瓶效价达904.00μg/mL,比出发菌株提高72.5%,经过五代斜面传代试验考察,该菌株遗传性状稳定.结论 紫外诱变和氨基酸抗性筛选可以获得那西肽高产菌株.     

不同诱变方法选育高产G-418菌株的比较

目的 选育抗生素G-418高产的棘孢小单孢菌突变株，以提高抗生素G-418的产量。方法 采用紫外诱变、NTG诱变、微波诱变、超声诱变的方法对棘孢小单孢菌进行诱变处理，结合生物活性测定方法，以发酵单位为主要评价标准进行筛选。结果 获得两株G-418高产菌株，其产量比出发菌株分别提高了102%和115%。结论 本研究表明紫外诱变可以显著提高G-418产生菌的正突变率，尤其是种子液衰亡期的正突变率最高，为选育G-418棘孢小单孢高产菌株奠定了基础。     

复合诱变法选育普那霉素高产菌株

以始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)ZP2为出发菌株,经紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)复合诱变,并结合普那霉素抗性突变株的理化筛选,选育到一株高产突变菌株UN2056,其普那霉素产量达到1490 mg/L,比出发菌株提高了45.7%.传代试验表明该高产突变菌株的高产性能遗传特性稳定.高产突变株UN2056在5 L发酵罐中进行发酵试验,其平均发酵产量达到1645 mg/L,比出发菌株提高了60.8%.     

白色念珠菌酮康唑抗药株的筛选

目的获得白色念珠菌的酮康唑抗药株。方法采用美国国家临床实验标准化委员会 (NC CLS)推荐的最小抑菌浓度 (MIC)测定法 ,从 8株不同来源的白色念珠菌中筛选出YS2 0 1 (MIC为0 0 62 μg/mL)作为出发菌株 ,分别利用紫外线 (UV)和亚硝基胍 (NTG)对其原生质体进行诱变。结果经大量筛选 ,得到抗药突变株UP1 1及NP2 9,其MIC分别达到 3 5 μg/mL和 75 μg/mL。结论获得酮康唑抗药株 ,突变株的抗药特性稳定。     

不吸水链霉菌中沉默基因簇的激活和产物结构鉴定

不吸水链霉菌S.ahygroscopicus S91(CGMCC4.7082)的次级代谢产物中含有多种抗真菌组分，目前已发现的组分有四霉素、制霉菌素、丰加霉素、白诺菌素和茴香霉素。通过生物信息学分析，不吸水链霉菌S91基因组中含有云南霉素和谷氏菌素的生物合成基因簇，但目前在该菌株发酵产物中并没有检测到这两种抗生素的存在。对四霉素、制霉菌素、丰加霉素生物合成阻断株Streptomyces ahygroscopicus ΔttmS1ΔnysBΔtymH进行发酵培养，发现其发酵液中具有水溶性的抑制黑曲霉的活性组分。以抑菌活性跟踪目标未知抑菌化合物，发酵液经离心、草酸酸化后，上清液经大孔吸附树脂DM-2脱色，脱色液经732阳离子交换、中性氧化铝柱柱层析和Sephadex LH-20色谱分离，最终得到两个具有抗真菌的化合物A和B。化合物经紫外、质谱和核磁进行结构鉴定，化合物A为云南霉素，B为谷氏菌素或宁南霉素。生物信息学分析与分离纯化技术相结合，进一步证实该菌株具有产生云南霉素和谷氏菌素抗生素的能力。     

氮离子注入土霉素产生菌的诱变育种

目的获得土霉素产生菌的高产菌株,提高发酵单位。方法用土霉素产生菌龟裂链霉菌经分离纯化的2810#菌株的分生孢子作处理样品,使用发射能量为15×103eV的氮离子束对其进行诱变处理,氮离子的注入剂量为每平方厘米注入2.0×1015个离子,分生孢子死亡率为98.2%。结果诱变处理后经摇瓶筛选得到1082#高产菌种,其摇瓶发酵单位提高11.2%,投入发酵生产后平均发酵单位提高8.9%。结论氮离子注入方法对提高龟裂链霉菌的产量正向突变频率有明显效果。     

透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达

目的通过将透明颤菌血红蛋白基因vgb克隆到林可链霉菌染色体黑色素生物合成基因m elC位点,使m elC基因被破坏失活,vgb基因实现表达同时提高林可霉素产量。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pYHT04,通过接合转移实验将重叠延伸PCR得到的具有红霉素抗性基因启动子的透明颤菌血红蛋白基因,以双交换的方式整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因m elC中。采用不同装瓶量摇瓶发酵,HPLC检测发酵液中林可霉素含量。结果重组菌株颜色变浅,CO结合差光谱显示在420 nm处有明显吸收峰,随着装瓶量的增加重组菌株发酵液中林可霉素效价与对照菌株相比降低幅度较小。结论重组菌株m elC基因失活不能继续合成黑色素,vgb基因得到表达并表现出生物学功能,限氧条件下重组菌株发酵液中林可霉素效价高于对照菌株,有希望应用于工业发酵生产。     

基因组重排选育麦迪霉素高产菌株

目的以生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)突变株为研究对象,选育麦迪霉素高产菌株。探索并验证基因组重排技术在菌种选育中的重要作用。方法通过2轮多亲株灭活原生质体融合技术实现基因组重排。将来自不同育种方法的5株麦迪霉素高产菌株B64-5、01-GM-1、H-101、H-106和H-108作为第一轮亲本,在质量浓度为3 g.L-1溶菌酶3、2℃水浴60 min条件下制备原生质体,分别采用紫外线照射148 s和52℃加热60 min灭活原生质体,然后采用质量分数35%PEG 4000、37℃保温2 min诱导原生质体融合。融合子经过初筛和复筛,获得产量进一步提高的重组子作为亲本进行第二轮的多亲株灭活原生质体融合实验。用生物学方法测定麦迪霉素效价,用HPLC方法测定麦迪霉素A1含量。结果与结论经过2轮基因组重排实验成功选育出3株高产且遗传稳定的麦迪霉素生产菌株。其中1株菌株GSZ2-32发酵前补加前体X-1后摇瓶产量比原始出发菌株Streptomyces mycarofaciens var.464提高1.1倍,麦迪霉素A1(MDMA1)质量分数含量保持在80%以上。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在那西肽产生菌—活跃链霉菌中的表达

目的将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到那西肽产生菌—活跃链霉菌(Streptomyces actuo-sus)的染色体上进行表达,从而提高菌体对溶解氧的利用,提高那西肽的发酵产量。方法采用分子生物学方法构建了携带vgb的重组质粒pZV02,采用接合转移的方法将其导入那西肽产生菌—活跃链霉菌中,采用抗生素抗性标记筛选法获得了基因重组菌株。结果在低溶氧的发酵条件下,重组菌株的那西肽产量显著高于对照菌株。结论 vgb在活跃链霉菌中的表达,可以改善菌体对溶解氧的利用,在低溶氧的条件下可以提高发酵产物那西肽的产量。     

菌株Streptomyces capillispiralis 1070代谢产物的抗肿瘤机制

目的考察菌株Streptomyces capillispiralis 1070的代谢产物抑制肿瘤细胞A549增殖的作用机制。方法采用MTT法考察菌株Streptomyces capillispiralis 1070的活性代谢产物对A549细胞增殖的抑制作用,采用吖啶橙活细胞染色荧光显微镜观察法、罗丹明123活细胞染色流式细胞检测技术及扫描电镜技术、透射电镜技术观察A549细胞增殖受到抑制后的各种变化。采用全波长扫描与Molish反应对活性物质的成分做初步判断。结果该活性物质可使A549细胞存活率降低至25.79%,可使A549细胞线粒体膜电位明显下降,能使A549细胞胞浆内出现酸性自噬泡,但细胞膜结构完整、无细胞内容物外漏。结论推测该活性物质是通过诱导细胞自噬而发挥其抗肿瘤作用。菌株Streptomyces capillispiralis 1070的活性代谢产物为多糖类物质。     

链霉菌702抗药性致死突变标志微波诱变筛选研究

目的 筛选出产抗真菌活性物质的高产链霉菌702突变株.方法 分别以链霉菌702菌株为试验材料和以庆大霉素为敏感抗生素建立链霉菌702孢子致死突变标志的微波诱变筛选模型,通过微波对链霉菌702菌株孢子进行不同时间的诱变处理,将诱变处理后的孢予悬液涂布于含致死浓度的庆大霉素的PDA平板培养基上,获得抗庆大霉素突变株,分别挑取单个抗药性突变菌株进行摇瓶初筛和复筛.生物效价测定采用一剂量法.结果 微波处理30s对菌株的致死率可达70.53%,抗药性突变率高达23.13%,获得的抗药性突变株经过摇瓶初筛和复筛,获得高产突变株20-29-47菌株,产抗真菌活件物质的摇瓶发酵单位达到1478μg/ml,比出发菌株发酵单位986μg/ml提高T49.9%.结论 采用抗药性致死突变标志的微波诱变筛选模型可以获得产抗真菌活性物质的链霉菌702高产菌株.     

链霉菌JXJ-402产生的抗生素JXJ-402-1的研究

在筛选微生物来源抗生素的过程中，从500余株链霉菌中发现十余株抗真菌阳性菌株，其中JXJ-402菌株显示出较强的抗稻瘟病菌活性。从该菌株固体发酵粗提取物中分离纯化到化合物JXJ-402-1。经^13C-NMR数据分析，确定其化学结构与文献报道的尼日利亚菌素（nigericin）结构一致。生物学活性研究发现，化合物JXJ-402-1具有抗稻瘟病菌、赤星病菌、白念珠菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌等真菌和细菌活性，其中抗稻瘟病菌和赤星病菌活性未见文献报道。