利用基因芯片技术筛选棉纤维伸长相关基因

从回交近交系(backcross inbred lines, BIL)群体中选取纤维长度差异较大的两个系NMGA-062 (33.03 mm)和 NMGA-140 (25.87 mm),利用Affymetrix棉花基因芯片,分析其开花后10 d (DPA, days post anthesis)棉纤维伸长相关基因表达谱。在24 029条转录本中,两材料间差异表达的转录本有7 282条,占总数的30.31%;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3 993条,占筛选转录本总数的16.62%,功能分类表明这些转录本主要包括功能预测基因(15.57%)、翻译、核糖体结构相关基因(13.54%)和翻译后修饰、蛋白质转换相关基因(9.29%)3大类。为了验证芯片数据的可信性,8个差异表达显著的基因(Ghi.10655.1.S1_s_at, ACO1, ARF1, SAHH, TUA6, TUA7, β-tub1, β-tub10)被用于实时荧光定量PCR。两种检测手段表现出一致性。随后,利用实时荧光定量PCR对3个与棉纤维相关基因(ARF1, β-tub1, β-tub10)在纤维发育不同时期(5、10、15、20和25 DPA)的表达模式进行了研究,结果表明,3个基因在纤维伸长发育时期(10和15 DPA)大量表达,推测这3个基因可能与棉纤维伸长有重要关系。     

棉花纤维发育相关基因时空表达特性的差异比较

棉花纤维发育过程包括起始、伸长、次生壁加厚和脱水成熟等阶段,是一个较为复杂的网络基因调控过程。为分析相关基因在不同棉种(属)纤维发育过程中时空表达特性,本研究以陆地棉、海岛棉和亚洲棉为研究对象,选取已确定与棉纤维发育相关的特异基因(GhACT1,GhCAD1,GhCCR1,GhExp1,GhExp2,GhCIPK1和GhPL),利用实时荧光定量PCR技术,系统分析这些基因在棉纤维发育过程的授粉当天(0 day post anthesis,0 DPA)、5天(5 DPA)、10天(10 DPA)、15天(15 DPA)、20天(20 DPA)、25天(25 DPA)的表达趋势变化。研究结果表明,所选特异基因在棉花纤维发育过程都有较高表达水平,但由于遗传背景不同,这些基因在不同棉种(属)纤维发育过程中表达趋势呈一定差异。通过对比分析GhExp1和GhExp2的基因表达趋势,本研究推测GhExp1对棉花纤维伸长的作用效果较为显著。此外,考虑到陆地棉、海岛棉和亚洲棉在纤维长度等方面的差异性,本研究推测GhACT1和GhExp1表达趋势变化对调控棉花纤维伸长有着重要作用。本研究结果可为深入分析棉花纤维发育相关基因与棉花纤维伸长的相关性提供参考。     

棉花纤维发育相关基因表达谱的比较分析

本研究通过3年4环境的田间试验,在BIL(backcross inbred lines)群体中选取断裂比强度最大的材料NMGA-062(32.5cN/tex)和断裂比强度最小的材料NMGA-144(26.67cN/tex),利用Affymetrix棉花基因芯片,比较分析NMGA-062和NMGA-144纤维发育10d时的基因表达谱。在24029条转录本中,两个基因型中差异表达的转录本6504条,占筛选转录本总数的27.07%;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3461条,占筛选转录本总数的14.41%,对其进行功能分类。对8个差异表达明显的基因(Ghi.10655.1.S1_s_at,ACO1,ARF1,SAHH,TUA6,TUA7,β-tub1,β-tub10)进行实时荧光定量PCR的检测,发现表达模式均与芯片结果一致,说明芯片数据具有生物学意义上的可重复性,结果是可信的。本研究为以后克隆及功能验证纤维发育相关基因提供了重要参考。     

棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

以14个纤维品质差异的棉花品种(或品系)为材料,研究10个纤维发育相关基因时空表达变化与纤维品质的关系,为阐明棉纤维发育相关基因与纤维品质形成关系提供理论基础。利用实时荧光定量PCR技术检测10个基因在14个供试品种(或品系)不同纤维发育时期的相对表达量,结果表明,虽然遗传背景完全不同,但它们具有某些共同表达特征。GhExp1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhPL这5个基因都是在纤维伸长期优势表达;GhACT1、GhRacA和GhRacB是在纤维伸长前期和次生壁加厚期高表达;而GhCelA1和GhcelA3是在纤维伸长后期和次生壁加厚期优势表达。这些基因表达谱与纤维品质关联分析显示,GhRacA在23DPA高表达且表达量与纤维品质显著正相关,其余基因在低表达时其表达量与纤维品质呈显著性相关,而在高表达时其表达量与纤维品质无相关性。GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度呈显著负相关,与伸长率呈极显著正相关;GhPL在23DPA的表达量与纤维长度呈显著负相关;GhRacA在5DPA和23DPA的表达量均与伸长率呈极显著正相关;GhRacB在10DPA的表达量与长度和整齐度呈显著负相关;GhCelA1基因在5DPA的表达量与纤维长度呈显著正相关,与马克隆值呈显著负相关,在10DPA的表达量与马克隆值呈显著正相关,与伸长率达到极显著正相关,与比强度呈显著负相关,与长度和整齐度呈极显著负相关;GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA3 这5个基因在纤维发育各时期的表达量与纤维品质各指标未检测到相关性。     

棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

以14个纤维品质差异的棉花品种(或品系)为材料,研究10个纤维发育相关基因时空表达变化与纤维品质的关系,为阐明棉纤维发育相关基因与纤维品质形成关系提供理论基础。利用实时荧光定量PCR技术检测10个基因在14个供试品种(或品系)不同纤维发育时期的相对表达量,结果表明,虽然遗传背景完全不同,但它们具有某些共同表达特征。GhExp1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhPL这5个基因都是在纤维伸长期优势表达;GhACT1、GhRacA和GhRacB是在纤维伸长前期和次生壁加厚期高表达;而GhCelA1和GhcelA3是在纤维伸长后期和次生壁加厚期优势表达。这些基因表达谱与纤维品质关联分析显示,GhRacA在23DPA高表达且表达量与纤维品质显著正相关,其余基因在低表达时其表达量与纤维品质呈显著性相关,而在高表达时其表达量与纤维品质无相关性。GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度呈显著负相关,与伸长率呈极显著正相关;GhPL在23DPA的表达量与纤维长度呈显著负相关;GhRacA在5DPA和23DPA的表达量均与伸长率呈极显著正相关;GhRacB在10DPA的表达量与长度和整齐度呈显著负相关;GhCelA1基因在5DPA的表达量与纤维长度呈显著正相关,与马克隆值呈显著负相关,在10DPA的表达量与马克隆值呈显著正相关,与伸长率达到极显著正相关,与比强度呈显著负相关,与长度和整齐度呈极显著负相关;GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA3 这5个基因在纤维发育各时期的表达量与纤维品质各指标未检测到相关性。     

利用马克隆值差异显著的BILs鉴定棉纤维品质相关基因

【目的】马克隆值是衡量棉纤维品质的重要指标之一。利用马克隆值存在显著差异的2个陆海回交近交系材料进行高通量基因芯片分析,旨在筛选和鉴定棉纤维发育相关的关键基因。【方法】从SG747(Gossypium hirsutum L.)和Giza75(Gossypium Barbadense L.)高世代回交近交系(Backcross Inbred Lines,BILs)群体中选取NMGA-140(马克隆值6.2)和NMGA-051(马克隆值4.0)为材料,利用Affymetrix公司的棉花寡聚核苷酸基因芯片对其开花后10 DPA(Days after anthesis)的棉纤维进行了表达谱分析。【结果】获得了2655个差异表达基因,包括功能预测基因(15.57%),翻译、核糖体结构与生物合成相关基因(13.54%)和翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣相关基因(9.31%)等。推测β-tub10正向调控棉纤维发育过程,β-tub1负向调控棉纤维发育过程,Ghi.3578.1.S1_s_at在棉纤维发育早期起到了作用。【结论】为棉花纤维品质的遗传改良提供了丰富的基因资源,为分子标记辅助育种开发更多新的分子标记。     

棉花GhCCR4基因的瞬时表达研究

利用棉纤维发育调控基因瞬时表达体系,分析目的基因在棉花纤维发育过程中可能存在的功能。实验构建了由CaMV35S启动子驱动的pGUS-CCR4融合瞬时表达载体,使用基因枪轰击法转化棉花胚珠,确定了转化0DPA胚珠的最佳条件:轰击压力为1350psi,轰击距离为9cm,轰击次数为2次。GUS组织化学染色结果表明,GhCCR4基因在棉花纤维伸长期和次生壁增厚期持续表达。不同发育时期纤维长度测量结果发现,在8DPA时转GhCCR4基因纤维长度和对照相比没有明显差别,但在27DPA时纤维长度明显短于对照。纤维透射电镜切片观察发现,转GhCCR4基因的细胞次生壁与对照相比增厚达17%。     

海岛棉GbVIN1基因的克隆与表达分析

根据前期棉纤维发育转录组、表达谱数据分析比较通过PCR技术从海岛棉‘新海21号’中克隆了一个同源基因,命名为GbVIN1,该基因具有一个1 938 bp的开放阅读框,编码645个氨基酸;多序列比对分析表明该蛋白的保守性较高,具有GH32家族保守的-NDPNG-和-WECVD-基序;进化树分析表明,GbVIN1基因与GhVIN1基因处于同一进化树分支。实时荧光定量PCR分析表明,GbVIN1基因在棉纤维发育不同时期中都有表达,且在5 DPA、10 DPA的纤维中表达量最高。本研究为进一步揭示GbVIN1基因可能对棉纤维伸长具有重要作用提供了一定的理论依据。     

利用马克隆值差异显著的BILs鉴定棉纤维品质相关基因

【目的】马克隆值是衡量棉纤维品质的重要指标之一。利用马克隆值存在显著差异的2个陆海回交近交系材料进行高通量基因芯片分析,旨在筛选和鉴定棉纤维发育相关的关键基因。【方法】从SG747(Gossypium hirsutum L.)和Giza75(Gossypium Barbadense L.)高世代回交近交系(Backcross Inbred Lines,BILs)群体中选取NMGA-140(马克隆值6.2)和NMGA-051(马克隆值4.0)为材料,利用Affymetrix公司的棉花寡聚核苷酸基因芯片对其开花后10 DPA(Days after anthesis)的棉纤维进行了表达谱分析。【结果】获得了2 655个差异表达基因,包括功能预测基因(15.57%),翻译、核糖体结构与生物合成相关基因(13.54%)和翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣相关基因(9.31%)等。推测β-tub10正向调控棉纤维发育过程,β-tub1负向调控棉纤维发育过程,Ghi.3578.1.S1_s_at在棉纤维发育早期起到了作用。【结论】为棉花纤维品质的遗传改良提供了丰富的基因资源,为分子标记辅助育种开发更多新的分子标记。     

棉花无腺体近等基因系差异表达基因分析

为了揭示棉花腺体发育的分子机制,本研究利用RNA-Seq对棉花无腺体性状近等基因系Z12/Z12YW的幼嫩叶片进行转录组测序,寻找差异表达基因。转录组测序结果表明,与有腺体棉Z12相比,无腺体棉Z12YW中共有306个基因表达发生变化,其中282个基因下调,24个基因上调。差异表达基因GO(Gene ontology)功能注释显示,细胞组分、胞外基质组分的功能变化以及细胞杀伤生物学过程在腺体形成过程中发挥重要作用;COG(Cluster of orthologous groups)功能和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路显著性富集发现,棉酚等萜烯物质的合成主要受甲羟戊酸途径上游基因的表达调控。此外,本研究共筛选到13个差异表达转录因子,可能在腺体发育和棉酚合成过程中发挥关键作用。     

棉花纤维次生壁加厚期基因的表达谱分析

本研究以高纤维强度材料0-153和转基因抗虫棉sGK9708为亲本构建的高代重组自交系群体(F608)中纤维强度具有显著差异的两个系(高强材料69307和低强材料69362)作为材料,利用cDNA芯片技术,对纤维次生壁加厚阶段(15 DPA和20 DPA)的基因表达谱进行研究.共检测到差异表达基因3 383个,占cDN...     

亚洲棉短绒突变体纤维发育及其差异基因表达分析

棉花纤维是重要的天然纺织材料,是最长的单细胞,是研究纤维发育的良好材料。本研究以亚洲棉短绒突变体(FZ)及其野生型(fz)为材料,结合扫描电镜、石蜡切片、RNA-seq技术,解析棉花短绒起始的可能机制。与野生型(fz)的0DPA时期胚珠相比,突变体的胚珠在该时期仅有少量的纤维起始。在+3DPA时,突变体没有短绒细胞起始,仅有长纤维细胞,而野生型有大量的短纤维细胞和长纤维细胞。对这2个材料的0DPA、+3DPA、+5DPA和+8DPA胚珠差异基因分析结果显示,在短绒突变体(FZ)和野生型(fz)的4个纤维发育时期共挖掘出3780个差异表达基因,其中0DPA时差异基因数目最少,随着胚珠发育时间的延长,差异基因的数目逐渐增加。KEGG分析发现这些基因主要参与蜡质、角质生物合成,以及苯丙烷代谢和植物信号传导过程。共表达趋势分析显示,在突变体+3DPA上调的差异基因中,参与离子结合、MAPK级联反应、氧化还原活性和转录调控的基因表达受到正影响(表达水平提高),造成突变体短绒纤维不能正常起始。这些结果描述了二倍体亚洲棉短绒起始的动态变化,可为进一步研究棉纤维发育提供参考。     

利用高通量测序技术鉴定棉纤维发育相关miRNAs及其靶基因

miRNA (microRNA)是一类21～24个核酸长度的非编码小分子RNA(sRNA),它主要通过抑制或降解靶基因来调控植物生长发育等过程.试验利用在纤维长度上有显著差异的2个回交自交系BILs (Backcross inbred lines)的0DPA (Days post anthesis)、3 DPA的胚珠和10 DPA的纤维构建6个sRNA文库并进行Solexa 测序.以已公布的棉花D5基因组序列和棉属其他序列为参考,经分析共发现561个miRNAs,其中包括254个已知的miRNAs(属于40个miRNA家族),75个候选的miRNAs和232个新的miRNAs,研究结果极大地丰富了棉属miRNAs.通过miRNA靶基因预测分析发现多数miRNAs负调控其对应的靶基因,少数正调控.KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释结果表明miRNA的靶基因在植物激素代谢途径中显著富集.     

两个棉花ß-葡聚糖酶新基因的结构与表达特征分析

β-葡聚糖酶是一类能降解β-葡聚糖的水解酶。本研究分别通过电子克隆和棉纤维发育cDNA文库筛选法克隆到2个棉花β-葡聚糖酶新基因,内切-1,4-β-葡聚糖酶基因(GhEG,GenBank登录号为HM462003)和1,3-β-葡聚糖酶基因(GhGLU,GenBank登录号: HM462004)。GhEG全长ORF为1 581 bp,编码526个氨基酸残基。GhGLU全长ORF为1 410 bp,编码469个氨基酸残基。基因组水平分析表明,GhEG含5个内含子和6个外显子,而GhGLU无内含子,仅1个外显子。新克隆的2个基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝,而在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝。通过开发SNP标记分别将GhEG和GhGLU在四倍体中的一个拷贝定位在第19染色体和第4染色体上。Q-PCR表达分析表明,GhEG在根、茎、叶中表达水平很低,而在纤维伸长期优势表达,在15 DPA和20 DPA纤维中,该基因在海岛棉海7124中的转录本显著高于陆地棉TM-1。GhGLU在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达,属于组成性表达基因,特别在根、纤维发育初始期和伸长后期优势表达,且表达水平在陆地棉TM-1和海岛棉海7124间也有显著差异。     

cDNA芯片检测棉花纤维发育相关基因的表达

利用cDNA芯片技术分析E6、Lipid transfer protein(LTP)、Proline-rich protein(PRP）、Expansin、Tubulin、Annexin等家族的63个棉花纤维发育相关基因,在陆地棉徐州-142开花后10d纤维组织及其无长绒无短绒突变体开花后10d胚珠中的表达差异,发现属于E6、LTP、PRP、Expansin家族的基因在两种组织中存在显著的表达差异,符合前人的报道。其中E6、LTP家族的基因在两种组织中的表达差异最大,个别基因表达差异甚至达到15倍之多。而Tubulin家族的基因在两种组织中的表达差异不大,检测的24个Tubulin家族基因中,仅2个基因在纤维组织和胚珠中存在显著表达差异。cDNA芯片技术可以高通量鉴定棉花纤维相关基因以及研究棉花发育相关基因的表达谱。     

绿色棉纤维发育过程中DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性分析

【目的】分析绿色棉纤维发育过程中DNA甲基化状态差异。【方法】利用2组限制性内切酶Eco RⅠ/HpaⅡ和Eco RⅠ/MspⅠ对绿絮棉1号纤维基因组甲基化位点进行识别和切割,并采用甲基化敏感扩增多态性引物对切割产物进行扩增,分析基因组内5'-CCGG-3'位点的甲基化状态;同时对扩增的差异片段进行测序,分析其生物学功能。【结果】66对甲基化敏感扩增多态性引物共扩增出4112个条带;平均每个样品共扩增出822.4个带型,平均每对引物扩增出12.46个片段。随着绿色棉纤维的发育,甲基化条带总数、甲基化条带比率、全甲基化条带百分比均逐渐升高;其中,开花后10、15、20和25 d时甲基化条带总数分别比开花后5 d时增加11.45%,13.86%,20.10%和33.13%。与开花后5 d相比,开花后10、15、20和25 d时纤维DNA发生甲基化变化位点的比例分别为3.15%,3.43%,3.65%和2.52%;而去甲基化位点的比例分别为12.87%,14.72%,13.31%和48.81%。通过测序和Blast分析表明,17个片段与已知的功能基因同源性较高,包括棉花线粒体基因组、丝氨酸蛋白酶基因和酯酶基因,且这些基因均在开花后25 d发生去甲基化。【结论】绿色棉纤维发育过程中DNA发生了甲基化与去甲基化现象。