一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备

 【目的】 制备出一种人硫氧还蛋白(hTrx)基因修饰的肝细胞&#65377; 【方法】 逆转录聚合酶链反应法扩增出hTrx cDNA,应用重组逆转录病毒制备hTrx基因修饰大鼠肝细胞&#65377;白蛋白免疫组化SABC法进行肝细胞活性鉴定,MTT比色试验进行抗氧化应激能力检测&#65377;【结果】 克隆出hTrx开放阅读框cDNA并制备出重组逆转录病毒,感染真核细胞后可分泌融合表达的hTrx并具有生物学活性&#65377;制备出hTrx基因修饰大鼠肝细胞,免疫组化SABC法显示肝细胞功能正常,MTT比色法检测具有较强的抗氧化应激能力(P < 0.05),并可有效增殖&#65377;【结论】 成功制备出一种具有较强抗氧化应激的hTrx基因修饰肝细胞&#65377;     

长白山蜂胶乙醇提取物的体外抗氧化作用

[目的]研究长白山蜂胶乙醇提取物的体外抗氧化活性.[方法]以高铁还原法检测长白山蜂胶乙醇提取物对肝组织总抗氧化能力的影响,以硫代巴比妥酸法检测对肝组织的抗脂质过氧化作用.[结果]长白山蜂胶乙醇提取物具有较强的总抗氧化能力,有效清除羟自由基,同时可质量浓度依赖性地抑制过氧化氢诱导的肝匀浆体系的脂质过氧化发生.[结论]长白山蜂胶乙醇提取物具有较强的体外抗氧化活性.     

人血管内皮生长因子(VEGF165)在大肠杆菌中的表达及鉴定

[目的]克隆人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白.[方法]用PCR技术,从人心脏cDNA文库中扩增VEGF165cDNA,并定向克隆入原核表达载体pET-28a中.用IPTG诱导VEGF165在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165,Western-blot鉴定.根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖的特性,用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性.[结果]从人心脏cDNA文库中扩增出VEGF165cDNA片段.克隆的VEGF165cDNA长576bp,编码191个氨基酸残基,序列与文献报道一致.SDS-PAGE电泳显示,经IPTG诱导,高效表达出25ku的rVEGF165,主要存在于包涵体中,约占菌体总蛋白的20%.MTT检测显示,复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静脉血管内皮细胞增殖.[结论]克隆、测定了人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165.     

逆转录病毒载体介导Fn-TPO基因修饰人骨髓间充质干细胞

目的 应用逆转录病毒载体介导纤维连接蛋白-血小板生成素(Fn-TPO)基因修饰人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察Fn-TPO基因修饰对于骨髓MSCs的影响.方法 构建携带Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体,并以其对骨髓MSCs进行体外基因修饰;台盼蓝拒染法计数活细胞数检测基因修饰后骨髓MSCs的体外增殖能力,RT-PCR检测Fn-TPO基因在骨髓MSCs中的表达情况,MTT法检测基因修饰后骨髓MSCs黏附造血细胞的能力,ELISA检测基因修饰后骨髓MSCs分泌至细胞培养液中的TPO浓度.结果 成功构建携Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体且以该逆转录病毒载体对骨髓MSCs进行体外基因修饰;Fn-TPO基因在骨髓MSCs内能够正常转录;基因修饰后的骨髓MSCs体外增殖能力无明显改变(P＞0.05);黏附造血细胞能力增强(P=0.01),分泌TPO的能力增强且不随培养时间延长而显著减弱(P＜0.01),但受细胞生长状态影响.结论 成功应用携带Fn-TPO基因的逆转录病毒载体对人骨髓MSCs进行基因修饰,使基因修饰后骨髓MSCs黏附造血细胞分泌TPO能力增强.     

BDNF基因逆转录表达载体的构建和在淋巴细胞中的表达

【目的】构建含脑源性神经营养因子基因(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNFgene)逆转录表达载体并了解其在淋巴细胞中的表达,探讨治疗基因的非损伤性脑内转移的新途径。【方法】用RT-PCR方法从大鼠海马组织总RNA中扩增(cDNA)BDNF片段,应用基因重组技术将大鼠(cDNA)BDNF克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒进行鉴定,采用LipofectAMINE将重组大鼠(cDNA)BDNF导入PA317细胞,获取高滴度的病毒上清转染大鼠淋巴细胞,应用流式细胞仪(FCM)检测大鼠淋巴细胞BDNF的表达,噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞培养上清对PC12细胞增殖的影响。【结果】扩增出大鼠(cDNA)BDNF片段,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pLXSN-BDNF,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达BDNF蛋白,其培养上清能促进PC12细胞增殖。【结论】成功构建了BDNF基因逆转录表达载体,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达和分泌具有生物活性的BDNF蛋白,为治疗基因的非损伤性脑内转移奠定了一定基础。     

Expression of human VEGF121 cDNA in mouse bone marrow stromal cells

目的构建人VEGF121逆转录病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因治疗骨科缺血性疾患的可行性.方法采用分子克隆技术从pCDⅠ/VEGF121质粒获得hVEGF121cDNA, 并克隆到pLXSN逆转录病毒质粒.经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒, 并进行滴度测定.培养小鼠骨髓基质细胞,用重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞.经筛选后,用PCR及RT-PCR方法测hVEGF121cDNA在基质细胞中的整合及转录;用免疫印迹及免疫组化检测VEGF121蛋白的表达;用MTT检测转基因细胞培养上清中VEGF的促人内皮细胞增殖活性.结果经酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒正确,包装的病毒滴度为6×105.PCR证实基因组DNA有hVEGF121cDNA的整合;RT-PCR证实有hVEGF121mRNA的转录;Western blot及免疫组化检测有VEGF121蛋白的表达;MTT试验显示转基因细胞培养上清中VEGF121能促进人内皮细胞增殖.结论我们成功地构建了pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒载体,该载体不仅能够有效地表达VEGF121蛋白,且表达的蛋白具有促进人内皮细胞增殖的生物学活性,这些均为进一步应用该载体研究VEGF基因治疗骨科缺血性疾患打下了基础.     

逆转录病毒转染法建立耐药性大鼠CRBH-7919细胞系

目的:建立高效、稳定的大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系.方法:利用逆转录病毒转染法将带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR转入到大鼠CRBH-7919细胞中,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率;免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-GP)表达,RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量,PCR检测mdr1基因转移到细胞内的基因片段.结果:转基因的细胞系对阿霉素、丝裂霉素的耐药性分别提高 9和7.9倍,免疫组化见转基因细胞系P-GP表达增加,RT-PCR示细胞内mdr1 mRNA的表达量增加,PCR表明转基因细胞内扩增出mdr1片段.结论:利用逆转录病毒转染法成功建立了大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系,该细胞系具有耐药强度高、耐药性稳定等特点.     

BDNF基因逆转录表达载体的构建和在淋巴细胞中的表达

【目的】构建含脑源性神经营养因子基因(brain-derived neurotrophic factor，，BDNF gene)逆转录表达载体并了解其在淋巴细胞中的表达，探讨治疗基因的非损伤性脑内转移的新途径。【方法】用RT-PCR方法从大鼠海马组织总RNA中扩增(cDNA)BDNF片段，应用基因重组技术将大鼠(cDNA)BDNF克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒进行鉴定，采用Lipofect AMINE将重组大鼠(cDNA)BDNF导入PA317细胞，获取高滴度的病毒上清转染大鼠淋巴细胞，应用流式细胞仪(FCM)检测大鼠淋巴细胞：BDNF的表达，噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞培养上清对PCI2细胞增殖的影响。【结果】扩增出大鼠(cDNA)BDNF片段，限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pLXSN．BDNF，BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达：BDNF蛋白，其培养上清能促进PCI2细胞增殖。【结论】成功构建了BDNF’基因逆转录表达载体，BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达和分泌具有生物活性的BDNF蛋白，为治疗基因的非损伤性脑内转移奠定了一定基础。     

流式细胞仪快速优化大鼠原代培养肝细胞基因转染

[目的]用流式细胞仪(FCM)快速检测外源性血管内皮生长因子基因(VEGF基因)在大鼠原代培养肝细胞转染表达,根据结果优化其转染表达条件.[方法]以加强型黄色荧光素蛋白(EYFP)为标记,用FCM快速检测重组质粒pIRES-EYFP/VEGF121在大鼠原代培养肝细胞中转染表达,根据结果优化pIRES-EYFP/VEGF121转染表达条件.[结果]pIRES-EYFP/VEGF121得以成功构建,并转染大鼠原代培养肝细胞;优化的转染表达条件:在细胞数密度0.1×106/mL,质粒孵育时间30 min,质粒与脂质体混合物孵育时间15 min,质粒与脂质体比例为1:10,转染时间2 h,NAIR-1作转染培养液时,转染效率达17.5%.[结论]以EYFP为标记,FCM可简便快捷地检测并优化外源性VEGF基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达,可为研究VEGF基因修饰大鼠原代培养肝细胞移植和肝基因治疗打基础.     

草苁蓉提取物对肝脏癌前病变大鼠肝线粒体超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量的影响

[目的 ]探讨草苁蓉经甲醇提取后进一步分离的水层成分对二乙基亚硝胺所致肝脏癌前病变大鼠血清抗氧化活力的影响 .[方法 ]按Solt Farber氏方法建立大鼠肝脏癌前病变模型 ,用草苁蓉提取物饲养大鼠 ,6周后处死 ,测定大鼠肝细胞线粒体超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量 .[结果 ]草苁蓉经甲醇提取后进一步分离的水层成分对肝脏癌前病变大鼠肝细胞线粒体超氧化物歧化酶活性有回升作用 ,并能降低丙二醛含量 .[结论 ]草苁蓉经甲醇提取后进一步分离的水层成分具有抗氧化作用