移植骨髓间充质干细胞对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响.方法 以各兔L2/3、L3/4、L4/5、L5/6节段分为正常组、退变组、成纤维细胞(SFs)移植对照组、MSCs移植治疗组.MSCs和SFs分别经绿色荧光蛋白(GFP)转染后,注射植入退变椎间盘的髓核.通过透射电镜观察退变椎间盘凋亡髓核细胞形态;用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测退变组织中髓核细胞凋亡相关基因bcl-2和box mRNA的表达;免疫荧光法标记髓核细胞凋亡相关蛋白Caspase-3,并通过TUNEL法标记凋亡髓核细胞,激光共聚焦显微镜检测髓核细胞凋亡蛋白表达率和细胞凋亡比率.结果 透射电镜下,退变椎间盘中凋亡髓核细胞呈现出核染色质边集,空泡形成,核膜断裂,凋亡小体形成等变化.MSCs移植治疗组bcl-2 mRNA的表达量高于退变组和SFs移植对照组(P<0.05),bax mRNA的表达量与退变组差异无统计学意义(P>0.05).MSCs移植治疗组细胞凋亡率和Caspase-3表达率均高于正常组[细胞凋亡率分别为(16.75±2.14)%和(6.86±1.08)%;Caspase-3表达率分别为[(20.34±1.03)%和(6.09±0.77)%](P<0.05),低于退变组和SFs移植对照组[细胞凋亡率分别为(31.87±4.16)%和(29.02±2.16)%;Caspase-3表达率分别为(31.50±3.78)%和(30.20±4.93)%](P<0.05).结论 髓核细胞凋亡在椎间盘退变过程中起重要作用.MSCs移植能有效抑制椎间盘髓核细胞凋亡,延缓椎间盘退变过程.     

大鼠尾椎间盘退变不同时期Hippo信号差异性研究

目的:探讨纤维环穿刺诱导的不同时期大鼠尾椎椎间盘退变过程中Hippo信号通路的表达变化。方法:SD雄性大鼠共60只,随机分为三组:未行尾椎纤维环穿刺的20例作为对照组(A组);40只大鼠进行尾椎纤维环穿刺,构建椎间盘退变动物模型,术后4周(B组,20只)和术后3个月(C组,20只)为实验组,术后4周和3个月行尾椎X线、MRI和病理学HE染色观察,评估上述三组椎间盘退变状况;免疫组化染色检测椎间盘髓核组织内Hippo信号通路下游因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)、磷酸化Yes相关蛋白(phosphorylat Yes-associated protein,p-YAP)和富半胱氨酸蛋白61 (cysteine-rich angiogenic inducer 61,CYR61)表达情况,分析早期和后期椎间盘退变Hippo信号通路表达变化情况。结果:与A组相比,B和C两组椎间盘纤维环穿刺术后椎间盘高度明显丢失(P0.05),MRI T2像灰度值增加(P0.05),表明椎间盘已经发生退变。且与A组(2.44±0.17)相比,B、C两组椎间盘退变病理学分级评分(4.33±0.23、4.22±0.22)显著增加(P0.05);p-YAP免疫组化和蛋白印迹检测显示B组表达相对减少,在A组中表达稍高,B和C组间p-YAP的表达具有显著性差异(0.33±0.02 vs 0.99±0.11,P0.05),而B组和A组(0.56±0.05)相比较无明显差异(P0.05);YAP在B组表达明显增高,而在C组表达明显减少,与B组相比YAP表达具有显著性差异(P0.05)。但是,与YAP表达不一致的是下游靶基因CYR61在B组中呈低表达,且与C组相比差异无统计学意义(P0.05)。结论:Hippo信号通路参与不同时期椎间盘退变的发生发展,在维持椎间盘内稳态中起重要作用。     

海藻酸钠复合多能诱导干细胞修复椎间盘研究

[目的]探讨海藻酸钠盐微球凝胶复合多能诱导干细胞(induced pluripotent stem cells, IPS)定向分化的髓核细胞对退变椎间盘修复作用。[方法] 50只新西兰大白兔分为5组,10只作为正常对照组,40只建立兔椎间盘退变模型,并随机分为4组,每组10只。模型组不行治疗,材料组注射不含髓核细胞的海藻酸钠盐微球凝胶材料,细胞组注射诱导分化的髓核细胞,联合组注射IPS定向分化的髓核细胞与海藻酸钠盐微球凝胶材料复合物,治疗8周后,采用组织学Mankin评分评估各组椎间盘软骨退变情况;采用免疫组化分析各组椎间盘组织蛋白多糖、Ⅱ型胶原和MMP3的表达水平。[结果]与细胞组比较,联合组兔椎间盘软骨退变改善最显著,各组组织学评分分别为:对照组(1.27±0.19)分,模型组(19.43±3.48)分,材料组(18.59±4.01)分,细胞组(13.11±3.81)分,联合组(5.90±2.01)分,差异有统计学意义(P0.05)。与细胞组比较,联合组兔椎间盘组织蛋白多糖和Ⅱ型胶原增加更显著,MMP3蛋白下调更显著,差异有统计学意义(P0.05)。[结论]海藻酸钠盐微球凝胶复合IPS定向分化的髓核细胞可显著改善椎间盘内环境,促进退变椎间盘组织修复。     

腺相关病毒介导Parkin对帕金森模型大鼠的治疗作用

目的探讨腺相关病毒介导Parkin对帕金森模型大鼠的治疗作用。方法 60只SD大鼠随机分为对照组、模型组和Parkin组, 模型组和Parkin组大鼠采用颈背部皮下注射鱼滕酮乳化液建立帕金森(PD)模型。Parkin组大鼠在建模后于左侧黑质定向注射携带Parkin基因的腺相关病毒, 对照组和模型组经左侧黑质定向注射携带空载体的阴性腺相关病毒。在注射21 d后, 对3组大鼠进行行为学分析;并处死大鼠, 采用原位缺口末端标记法(TUNEL)分析3组大鼠黑质细胞凋亡指数;采用超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)-px试剂盒检测SOD和GSH-px水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析凋亡相关蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)和bcl-2相关X蛋白(bax)的水平。不同处理比较采用方差分析, 组间比较采用LSD法。结果 Parkin组大鼠脑组织黑质区Parkin蛋白表达水平(1.54±0.18)明显高于对照组和模型组(0.81±0.11、0.89±0.12), 差异有统计学意义(t=9.257、8.014,...     

大鼠尾椎间盘退变造模器械的研发与应用

目的:研制一种简便、微创、针刺深度可控的大鼠椎间盘退变模型的造模器械。方法 :自行设计一种新型针刺大鼠尾椎间盘退变的造模器械,由C型套环和针筒两部分构成。取3月龄雄性SD大鼠20只,分为针刺组(10只)和对照组(10只),将造模器械的C型套环套在鼠尾上,用21G针对针刺组的大鼠尾椎Co6/7、Co8/9椎间盘分别行横贯(10mm)和半横贯穿刺(5mm);对照组大鼠尾椎无任何处理。造模前和造模后4周时对两组大鼠的尾部行X线片和MRI检查,在X线片上测量椎间盘高度,计算目标椎间盘高度指数(DHI)比;在MRI T2像上采用Pfirrmann评分评价目标椎间盘退变情况。再处死大鼠取目标椎间盘固定切片后行番红O染色,观察椎间盘退变情况;对非针刺节段尾椎间盘内注射造影剂(碘海醇)后,X线下显影并用针抽吸髓核组织。结果:造模过程中大鼠无死亡,术后无感染等并发症。向大鼠椎间盘注射碘海醇后造影显影良好,可以抽取一定量的髓核组织。造模后4周,针刺组Co6/7和Co8/9的DHI比分别为0.65±0.07和0.73±0.09、Pfirrmann退变评分分别为4.3±0.82和3.5±0.71分,对照组分别为0.98±0.02和0.97±0.02、1.1±0.32分和1.1±0.32分,两组同节段比较均有显著性差异(P0.05),针刺组两个节段间比较有显著性差异(P0.05),对照组两个节段间比较无显著性差异(P0.05)。番红O染色针刺组Co6/7髓核消失,与纤维环界限不清,终板骨化;针刺组Co8/9穿刺侧髓核和纤维结构紊乱,另一侧髓核与纤维环较完整;对照组Co6/7和Co8/9髓核、纤维环和终板形状完整,结构清晰。结论:造模器械穿刺可以成功建立大鼠尾椎间盘退变模型,且横贯穿刺较半横贯穿刺椎间盘退变重;利用该造模器械可以向椎间盘内注射造影剂或药物,抽取髓核。     

基于Notch通道右归丸对大鼠退变椎间盘的影响

[目的]探讨右归丸对大鼠退变腰椎间盘结构的潜在干预机制。[方法]将30只雄性SD大鼠随机分为3组,每组10只。正常对照组为健康大鼠,不做特殊处理;退变组采用纤维环穿刺法建立大鼠椎间盘退变模型。药物组在退变组基础上予右归丸灌胃2周。ELISA检测血清炎症因子IL-10、MIF、TNF-α水平;Western blot检测椎间盘组织中Ⅱ型胶原、Notch1蛋白表达水平。[结果]与正常对照组比较,退变组和药物组的大鼠血清白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)[(22.3±2.8) pg/ml vs(30.9±1.7) pg/ml vs (53.2±7.5) pg/ml, P<0.001]、巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）[(0.3±0.0) pg/ml vs (1.3±0.3) pg/ml vs (0.6±0.2) pg/ml, P<0.001]、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)[(12.5±3.0) pg/ml vs (52.6±...     

伏立诺他调控组蛋白去乙酰化酶-2促进软骨炎症修复的研究

目的探讨伏立诺他作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂应用于促进软骨炎症修复作用及其机制。方法首先进行大鼠体内实验, 设置为对照组和退变组, 造模成功后进行软骨取材, 取大鼠软骨, 进行切片行免疫组织化学HDAC-2染色, 继而提取cDNA和蛋白质分别进行HDAC-2的基因、蛋白检测。然后于体外实验部分, 体外分离培养大鼠软骨细胞, 设置为对照组、白细胞介素-1组、白细胞介素-1+伏立诺他组, 通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测HDAC-2、Ⅱ型胶原(Col2a1)、蛋白多糖(Acan)的基因表达, 使用蛋白质印迹法(Western blot)检测乙酰化及总H3组蛋白表达, 使用免疫荧光法标记HDAC-2蛋白。确定伏立诺他的效应后, 最终使用大鼠退变模型, 设置为退变组和退变+伏立诺他组, 于注射7 d后进行取材, 并做番红O染色及阿利新蓝染色。两组间比较行t检验。结果退变组大鼠软骨的HDAC-2免疫组化蛋白分布高于对照组, 其基因转录活性显著升高(0.96±0.05比1.34±0.12, t=5.83, P<0.01)。体外实验部分, 白细胞介素-1诱导HD...     

TGF-β3修饰退变髓核细胞移植修复兔退变椎间盘的效果观察

目的探讨TGF-β3基因修饰后退变髓核细胞生物学效应以及植入兔退变椎间盘后对退变椎间盘的影响。方法将重组腺病毒载体Ad-TGF-β3与第2代退变髓核细胞按10∶1比例混合培养转染(Ad-TGF-β3组),待细胞融合后传代,MTT检测转染细胞增殖活性,Western blot检测TGF-β3蛋白含量,免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率;采用病毒空载体转染髓核细胞(Adv组)和未经转染髓核细胞(空白组)作为对照。取30只新西兰兔,体重3.2～3.5 kg,雌雄不限,通过针刺L3、4、L4、5和L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型。将实验动物按照随机数字法分为3组,转染细胞组(A组,n=12)、退变细胞组(B组,n=12)和空白对照组(C组,n=6)。A、B组将100μL浓度为1×105个/mL对应细胞悬液注射入退变椎间盘,C组同法注入等量PBS。注射后6、10、14周取A、B组各4只、C组2只实验动物处死,取L3、4、L4、5和L5、6椎间盘行组织学观察,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达。结果 Ad-TGF-β3转染后髓核细胞活性明显改善;转染后3、7、14 d,TGF-β3在髓核细胞内表达逐渐升高;Ad-TGF-β3组髓核细胞细胞质内见棕黄色Ⅱ型胶原阳性染色,阳性率显著高于Adv组及空白组(P<0.05)。组织学观察示,A组椎间盘退变程度较B、C组明显减轻。6、10、14周A组Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达显著高于B、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β3基因修饰退变髓核细胞后可明显改善细胞生物活性,转染后髓核细胞植入兔体内可明显增加退变椎间盘的基质分泌。     

外源性肿瘤坏死因子-α诱发兔椎间盘退变中β-catenin蛋白的表达及意义

目的 通过外源性肿瘤坏死因子(TNF)-α注射构建兔椎间盘退变动物模型,探讨该模型中β-catenin蛋白的表达及意义和炎性细胞因子在促进腰椎间盘退变过程中Wnt/β-catenin信号通路的作用.方法 选取12只健康成年日本白兔,雌雄随机,体质量2.5～3.0kg.手术暴露L2～5 3个间隙共36个椎间盘.随机分为4组,分别注入生理盐水、TNF-α 5 ng、TNF-α 10ng、TNF-α 20 ng,于术后第8周统一处死,取椎间盘髓核组织作苏木素-伊红(HE)-番红O染色病理切片进行形态学观察;各组分别随机选取4个椎间盘髓核组织标本,采用蛋白印迹法(Western blot)测定β-catenin蛋白含量并比较各组间差异.结果 HE-番红O染色病理切片显示,在5、10、20 ng组椎间盘组织中髓核细胞数量减少,正常网状结构破坏,细胞形态发生改变,出现肥大空泡样软骨细胞,组织基质蛋白聚糖含量明显降低,番红O淡染,生理盐水对照组椎间盘形态基本正常,无退变发生.蛋白印迹结果显示β-catenin蛋白含量在注射TNF-α组明显增加,各组吸光度比值分别为:0.142±0.036、0.351±0.041、0.472±0.052和0.710±0.063,组间差异有统计学意义(P＜0.05)且与TNF-α浓度相关.结论 通过外源性TNF-α盘内注射能够成功构建兔椎间盘退变动物模型,且退变程度与TNF-α呈浓度依赖性;在退变模型髓核组织中β-catenin蛋白含量增高且与TNF-α浓度正相关,提示炎症细胞因子触发了Wnt/β-catenin信号通路,在椎间盘退变过程中可能发挥了重要作用.     

退变椎间盘纤维环破裂后髓核免疫微环境的变化

目的探究椎间盘退变(IDD)中纤维环破裂引起的免疫微环境变化。方法选取2020年9月至2021年7月在苏州大学附属第二医院骨科诊断为椎间盘突出症行手术治疗的患者, 根据纤维环破裂与否, 分为纤维环完整组(AI)和纤维环破裂组(AR), 收集髓核标本。采用流式细胞仪、实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测组织样本炎性因子表达水平;免疫组织化学染色观察免疫细胞CD68、F4/80、白细胞介素(IL)-1β的表达。结果流式细胞术分析显示AR组巨噬细胞(37.20±0.64比14.50±0.58, t=45.30, P<0.01)和T细胞比例较AI组明显增多[(22.10±0.67)%比(4.06±0.05)%, t=46.20, P<0.01]。在mRNA表达水平上, AR组TNF-α表达倍数高于AI组(8.73±1.56比1.00±0.04, t=8.57, P<0.01), AR组IL-1β表达倍数高于AR组(5.68±0.70比1.00±0.02, t=11.55, P<0.01), AR组IL-4表达倍数高于AI组(2.33±...     

S100钙结合蛋白A4在大鼠动脉粥样硬化中的作用

目的探索钙离子拮抗剂(CCB)和干预S100钙结合蛋白A4(S100A4)表达对SD大鼠下肢动脉硬化性闭塞症(ASO)动物模型发病进程的影响。方法将56只健康SD大鼠采用随机数字表分组法等分为8组, 每组7只。A组为对照组, B组为假手术组, C、D、E、F、G、H组则为通过采用手术联合高脂饮食的方式构建大鼠经典ASO模型后, 鼠尾静脉注射CCB、Lv-S100A4、S100A4小干扰RNA(siRNA)。通过茜素红染色评估股动脉中Ca2+浓度的改变, 苏木精-伊红(HE)染色评估股动脉内膜、中膜增生情况, 免疫组织化学检测股动脉S100A4的蛋白表达。计量资料两组间比较用独立样本t检验;多组间比较用单因素方差分析。计数资料采用χ2检验。等级资料采用秩和检验。结果 16周后成功构建大鼠ASO模型。F组中S100A4的表达显著低于E组(0.24±0.03比0.42±0.05, t=-6.774, P<0.01)且F组股动脉内膜及中膜厚度明显低于E组[(82.98±4.76) μm比(101.26±3.18) μm, t=-8.451, P<0.01]。H组中S100A4的表达...     

脐带华通胶间充质干细胞移植对退变椎间盘影响的实验研究

目的:探讨人华通胶间充质干细胞(Wharton′s jelly-derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)移植对犬退变椎间盘的影响。方法:从新生儿脐带中提取WJMSCs,取增殖良好的第3代细胞,用含有绿色荧光蛋白的腺相关病毒(r AAV2-EGFP)感染标记细胞。选择20只健康成年比格犬作为实验动物,使用穿刺抽吸髓核组织法建立椎间盘退变模型(L4/5、L5/6、L6/7)。4周后将犬各节段椎间盘进行分组:L3/4为对照组(A组);L4/5为退变组(B组);L5/6为注射组(C组),注射生理盐水;L6/7为移植组(D组),移植绿色荧光蛋白标记的WJMSCs细胞悬液。造模术前、术后4、8、12、24周行腰椎X线及MRI检查。24周后处死动物取材进行冰冻切片荧光、HE染色及番红O染色等组织学检测,提取髓核组织总RNA,反转录后行Real Time PCR检测,观察蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX-9及Ⅰ型胶原基因表达变化。结果:分离培养的WJMSCs贴壁生长,呈梭形形态,r AAV2-EGFP病毒感染后第3天表达绿色荧光。影像学检查结果显示各组椎间盘高度指数及相对灰度指数在造模术前、术后第4周无统计学差异,术后8、12、24周,D组椎间盘相对高度指数及相对灰度指数较B、C组高(P0.05),比A组低(P0.05)。术后24周,D组髓核组织冰冻切片内能够检测到GFP阳性的WJMSC细胞,HE染色显示D组髓核组织退变比B组和C组轻,番红O染色结果显示D组染色较B组和C组深,基因表达检测结果显示D组Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9基因表达比B、C组高(P0.05),但比A组低(P0.05)。结论:人WJMSCs移植入犬退变椎间盘内能够存活,促进椎间盘细胞外基质Ⅱ型胶原及蛋白多糖合成,维持椎间盘高度及髓核含水量,能够有效延缓椎间盘退变进展。     

重组腺相关病毒2介导hTGF-β_1基因体内转染兔退变髓核细胞对蛋白多糖含量的影响

目的应用重组腺相关病毒2(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)介导hTGF-β1基因体内转染兔退变椎间盘髓核细胞,观察基因产物的表达及其对退变髓核细胞蛋白多糖合成的生物调节作用。方法于24只成年新西兰大白兔,雌雄不限,体重1.7～2.2kg,L1、2、L2、3、L3、4、L4、5椎间盘注射25μL浓度为1mmol/L的纤维结合素片段(fi bronectin fragment,Fn-f)制备椎间盘退变模型,注射Fn-f4周时的造模椎间盘模拟早期退变的椎间盘。将24只兔随机分为3组(n=8),A、B、C组分别于造模椎间盘髓核内注射25μL rAAV2-hTGF-β1(1×1012vg/mL)、rAAV2-增强绿色荧光蛋白(enhanced green?uorescent protein,EGFP,rAAV2-EGFP)、PBS。术后1周A、C组各处死2只兔,取髓核组织采用免疫组织化学染色观察hTGF-β1的表达;术后4、8、12周每组取2只兔髓核组织,35S整合分析法检测新合成蛋白多糖的含量;术后12周处死B组2只兔,荧光显微镜观察髓核组织中EGFP的表达。结果术后1周,免疫组织化学染色示A组髓核细胞及基质中广泛存在强阳性染色颗粒,C组仅存在少量阳性颗粒。35S整合法检测示,各时间点A组35S蛋白多糖合成率均高于B、C组,比较差异有统计学意义(P0.05);B、C组间比较差异无统计学意义(P0.05)。术后12周,荧光显微镜下观察B组盘髓核组织可见大量绿色荧光表达。结论新型基因转导载体rAAV2可有效介导hTGF-β1基因体内转染兔退变髓核细胞,基因产物可持续表达超过12周,hTGF-β1可有效促进退变髓核细胞蛋白多糖的合成。     

尼古丁诱发椎间盘退变的实验研究

[目的]观察皮下注射尼古丁大鼠椎间盘中IL-1β阳性细胞表达率的变化,探讨尼古丁诱发椎间盘退变的可能机制。[方法]选用10~11周龄雄性SD大鼠30只,按照随机分配的原则分为3组,对照组10只,每天皮下注射生理盐水1.5 ml/kg,共注射8周;实验组2组,每组各10只,每天皮下注射尼古丁3 mg/kg(相当于成人每天抽40支香烟~([1])),分别注射2、8周。达到注射时间后,各组分别取出L_4/L_5椎间盘组织制作切片(由于人体椎间盘退变多发生在L_4/L_5椎间盘),行HE染色及IL-1β免疫组化染色,观察椎间盘退变情况及IL-1β阳性细胞率的表达情况。[结果]HE染色结果显示,尼古丁注射2周实验组大鼠椎间盘与对照组比较无明显变化,少数出现1级退变。尼古丁注射8周实验组大鼠椎间盘纤维环结构紊乱,出现3~4级退变。免疫组化染色结果显示,对照组IL-1β阳性细胞表达率为(7.0±0.34)%,实验组IL-1β阳性细胞表达率分别为(32.1±2.69)%、(78.6±2.59)%。对数据进行统计分析,三组间差异具有统计学意义。[结论]尼古丁可能通过刺激机体合成和释放IL-1β而诱发椎间盘退变。     

小鼠椎间盘退变模型的CBX8改变

[目的]探讨CBX8在小鼠椎间盘退变的表达以及其对椎间盘退变的影响。[方法]自小鼠椎间盘中分离出髓核细胞并行免疫组化鉴定,传代培养后用RT-PCR分别检测CBX8、Ⅱ型胶原、蛋白多糖m RNA的表达变化。分别建立正常对照、假手术和椎间盘退变动物模型,并分别于建模手术后8、12、16周进行检测,观察小鼠脊柱大体形态,Westblot检测Ⅱ型胶原和CBX8蛋白含量。[结果]体外实验表明,小鼠髓核细胞经过传代培养,在第5代时Ⅱ型胶原mRNA基本不表达(0.002±0.001),蛋白多糖的mRNA表达也明显下降(0.23±0.02),但是CBX8的mRNA表达却显著增加(1.68±0.26)。体内实验显示,椎间盘退变模型组发生一定程度的退变性侧弯,椎体的高度也明显下降。模型组Ⅱ型胶原蛋白的含量明显低于正常组及假手术组(P0.05);相反,模型组的CBX8的含量显著高于正常对照组和假手术组(P0.05)。[结论] CBX8在小鼠退变模型以及传代多次的髓核细胞中表达比在正常的椎间盘以及髓核细胞明显升高,CBX8与髓核细胞的衰老退变存在一定的关联。     

大鼠正常与退变性髓核突出导致神经根性疼痛的对比研究

目的探讨正常与退变髓核突出对大鼠疼痛阈值以及背根神经节中TNF-α表达的影响,研究椎间盘退变与神经根性疼痛之间的关系。方法72只大鼠随机分为4组:正常对照组(n=18)、假手术组(n=19)、正常髓核(N-NP)组(n=16)和退变髓核(P-NP)组(n=19)。对P-NP组大鼠利用尾椎椎间盘纤维环穿刺的方法建立椎间盘退变模型。分别取出N-NP组和P-NP组大鼠自体的正常髓核与退变髓核组织,置于手术显露后的腰5左侧神经根处,建立髓核突出致神经根性疼痛动物模型。采用行为学测试的方法分别观察各组大鼠术前1天,术后1、4、7、10、14、21天机械刺激阈值与热刺激阈值的变化;采用免疫组化方法分别检测术后第4、14天各组大鼠背根神经节中TNF-α的表达。结果行尾椎间盘纤维环穿刺后2周,组织学与MRI检查均证实椎间盘组织发生明显退变。对照组和假手术组动物未出现明显的痛觉过敏现象,N-NP组和P-NP组大鼠机械性刺激阈值均显著下降,该痛觉过敏现象持续至术后2周消失;与正常髓核组织相比,退变髓核所致机械性刺激阈值下降程度更为严重。各实验组均未发生热刺激阈值的规律性变化。术后第4、14天对照组和假手术组背根神经节中未见TNF-α明显表达,而正常及退变髓核组TNF-α表达量均显著升高。结论大鼠尾椎纤维环穿刺是建立大鼠椎间盘退变模型的一种有效方法。与正常髓核组织相比,发生退变的髓核组织可导致神经根性疼痛的加重,提示椎间盘退变过程中释放的炎症因子在疼痛的发生机制中可能起到了重要作用。     

过表达B细胞淋巴瘤/白血病-2对重度创伤性脑损伤大鼠的治疗作用及其机制

目的观察过表达B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)对重度创伤性脑损伤大鼠神经保护作用。方法2018年1月至2019年9月,60只SD大鼠采用随机数字法分为对照组、模型组和bcl-2组。对照组和模型组大鼠经脑室注射对照腺相关病毒1×10^11 v.g/只,bcl-2组经脑室注射bcl-2过表达腺相关病毒1×10^11 v.g/只,注射24 d后,模型组和bcl-2组大鼠采用自由落体撞击法建立重度创伤性脑损伤模型,对照组大鼠不处理。建模24 h后,采用神经行为学评分评价大鼠的神经功能;采用原位缺口末端标记法(TUNEL)染色分析脑组织的凋亡水平;采用JQ1法检测脑组织细胞线粒体膜电位;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析bcl-2、bcl-2相关X蛋白(bax)和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达水平,计量资料比较采用单因素方差分析。结果bcl-2组大鼠神经功能评分(5.72±1.27)低于模型组大鼠神经功能评分(8.59±1.67),差异有统计学意义(t=3.114,P<0.05)。bcl-2组大鼠脑组织细胞线粒体膜电位(1.59±0.13)高于模型组大鼠脑组织细胞线粒体膜电位(1.01±0.10),差异有统计学意义(t=2.011,P<0.05)。bcl-2组大鼠神经细胞凋亡水平[(16.59±3.09)%]显著低于模型组[(39.54±4.09)%],差异有统计学意义(t=3.103,P<0.05)。bcl-2组细胞bcl-2蛋白表达水平(1.79±0.14)高于对照组和模型组(0.96±0.11和1.00±0.12),差异有统计学意义(t=2.019、1.978,P<0.05)。bcl-2组大鼠脑组织Caspase-3和bax蛋白表达水平(1.17±0.09和1.05±0.17)低于模型组(1.32±0.11和1.74±0.12),差异有统计学意义(t=1.280、2.016,P<0.05)。结论过表达bcl-2可显著抑制重度创伤性脑损伤大鼠神经细胞凋亡,提高线粒体功能,保护大鼠神经功能。     

腺相关病毒介导hBMP-2体内转染对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的:了解腺相关病毒介导骨形态发生蛋白-2(adeo-associated virus mediated human bone morpho-genetic protein-2,AAV-hBMP-2)基因体内转染兔退变椎间盘后对髓核细胞Fas与Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法:36只普通级新西兰大白兔,采用针刺兔椎间盘的方法制作L2/3、L3/4、L4/5椎间盘退变模型。造模4周后,在MRI影像学中,髄核的信号比正常减弱,证明造模成功,再随机分为注射20μlAAV-hBMP-2组(6×106pfu,A组)、AAV组(6×106pfu,B组)和生理盐水组(C组),分别于注射2周、4周及8周后对椎间盘进行MRI检查,然后取材,石蜡包埋,组织切片应用SP免疫组织化学法和TUNEL法分别观察Fas与Caspase-3蛋白表达及髓核细胞凋亡情况,IPP6.0图像分析系统测定各指标的平均光密度。结果:注射后2周、4周及8周时A组MRI髓核信号结果与B组、C组比较有统计学意义(P0.05)。各组Fas,Caspase-3及TUNEL染色结果随着时间推移逐渐增强,A组Fas、Caspase-3及TUNEL的平均光密度明显低于B组和C组(P0.01),B组与C组间比较无显著性差异(P0.05)。结论:体内转染AAV-hBMP-2能抑制兔腰椎间盘髓核细胞凋亡。     

LAMP2A和MEF2D在增龄过程中大鼠髓核组织的表达及其意义

目的 探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中LAMP2A和MEF2D的表达及其意义.方法 3、12、24月龄SD大鼠各8只,建立青年大鼠组、中年大鼠组和老龄大鼠组模型,透射电镜检测髓核细胞中自噬体的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法测定髓核组织中LAMP2A和MEF2D的表达.结果 不同年龄组大鼠髓核细胞中均有自噬体的表达;RT-PCR和Western blot法显示LAMP2A在3、12、24月龄组中均有表达(0.91±0.07、1.12±0.11、1.32±0.28和0.45±0.06、0.55±0.08、0.63±0.11),且在老龄组表达较青年组表达明显增高(P＜0.01和P＜0.05),在3、12、24月龄组中,RT-PCR和Western blot法亦显示MEF2D均有表达(0.66±0.10、0.55±0.08、0.52±0.08和0.46±0.03、0.43±0.02、0.41±0.04),且24月龄组表达明显较青年组低(P均＜0.01).结论 自噬存在于椎间盘退变过程中;分子伴侣介导的自噬活性的增加可能与椎间盘退变的发展进程有关.LAMP2A介导的分子伴侣自噬性细胞死亡可能通过MEF2D进行调节.