健脾益肾、活血化瘀中药复方对高糖刺激下肾小球系膜细胞增殖的影响

目的 探讨健脾益肾、活血化瘀中药复方对高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞(RMCs)增殖的影响及对转化生长因子-β1(TGF-β1)和骨形态发生蛋白-7(BMP-7)表达的影响.方法 将常规培养的RMCs分为对照组(5.6 mmol/L葡萄糖组)、甘露醇组(5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖组)、高糖+中药复方组(30 mmol/L葡萄糖+0.65 mg/mL中药复方).培养48 h,采用4-甲偶氮唑蓝(MTr)法检测细胞增殖情况,分析健脾益肾、活血化瘀中药复方对高糖刺激下RMCs增殖的影响.酶联免疫法检测TGF-β1的表达,实时定量PCR法检测BMP-7 mRNA的表达.结果 高糖组RMCs增生及TGF-β1的表达较对照组增加明显,BMP-7 mRNA的表达更明显下降,高糖+中药复方组较高糖组RMCs增生及TGF-β1的表达明显下降,BMP-7mRNA的表达明显升高.结论 健脾益肾、活血化瘀中药复方能够抑制高糖刺激下的RMCs增殖及TGF-β1的表达,并上调BMP-7 mRNA的表达.     

钙调神经磷酸酶在醛固酮致心肌成纤维细胞增殖中的作用

目的:检测醛固酮(Ald)诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖中钙调神经磷酸酶(CaN)mRNA,蛋白表达及螺内酯(Spi),环孢素A(CsA)对其表达的影响,从而探讨CaN在Ald致心肌纤维化中的作用.方法:本研究以体外培养的新生SD大鼠CFs为研究对象,以Ald诱导其增殖和胶原合成,并加入CsA,Spi干预,应用RT-PCR和Western Blot分别测定CaN mRNA和蛋白表达的变化.结果:与对照组相比,Md组促进CFs增殖和增加羟脯氨酸含量(P＜0.05),与Ald组相比,Ald CsA组,Ald Spi组则可以明显抑制CFs增殖和减少羟脯氨酸含量(P＜0.05);与对照组相比,Ald组CaN mRNA和蛋白表达呈浓度依赖性升高(P＜0.05),与Ald组比较,Ald CsA组,Ald Spi组的CaN mRNA,蛋白表达均降低(P＜0.05).结论:外源性Ald可通过CaN依赖的信号转导通路诱导心肌纤维化,其作用与Ald的基因组通路有关.     

阿托伐他汀对醛固酮诱导心脏成纤维细胞内皮素表达的影响

目的:研究阿托伐他汀对醛固酮诱导大鼠心脏成纤维细胞(CFs)内皮素(ET)表达的影响.方法:以培养的新生SD大鼠CFs为实验模型,放免法检测CFs培养液中ET水平,流式细胞术测定CFs中的ET-1含量,RT-PCR测定内皮素-1前体(ppET-1)mRNA的表达.结果:醛固酮(1×10-7 mol/L)组CFs培养液中ET水平和CFs中的ET-1含量及ppET-1mRNA的表达明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);醛固酮(1×10-7 mol/L) 阿托伐他汀(1×10-6,1×10-5,1×10-4 mol/L)组明显低于醛固酮(1×10-7 mol/L)组,差异有统计学意义(P＜0.01);醛固酮(1×10-7 mol/L) 阿托伐他汀(1×10-4 mol/L) 甲羟戊酸(1×10-3 mol/L)组明显高于醛固酮(1×10-7 mol/L) 阿托伐他汀(1×10-4mol/L)组,差异有统计学意义(P＜0.01),但和醛固酮(1×10-7 mol/L)组接近,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:阿托伐他汀可抑制醛固酮诱导的CFs ppET-1 mRNA表达以及ET-1的合成和分泌,其机制可能与甲羟戊酸代谢途径有关.     

罗格列酮对内皮素引起心肌细胞损伤的保护作用及机制

目的:以新生大鼠心肌细胞为模型,探讨罗格列酮(RSG)对内皮素-1(ET-1)引起心肌细胞损伤的保护作用及其机制.方法:将原代培养的心肌细胞分为5组:DMEM组,ET-1组,ET-1 RSG(10-9mol/L)组、ET-1 RSG (10-8mol/L)组、ET-1 RSG (10-7mol/L)组;培养24 h和48h ,吸取培养液;按试剂盒说明书进行测定心肌细胞培养液中LDH,SOD 活性及MDA 含量.结果:药物干预24和48 h后,培养液中LDH的活性,ET-1组均高于对照组(分别为P＜0.05,P＜0.01),ET-1 RSG组均低于ET-1组,其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG ET-1组较ET-1组降低有统计学意义(分别为P＜0.05,P＜0.01);SOD 活性:ET-1组均低于对照组(分别为P＜0.05,P＜0.01),ET-1 RSG组均高于ET-1组,其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG ET-1组较ET-1升高有统计学意义(分别为P＜0.05,P＜0.01);MDA 含量:ET-1组均高于对照组(分别为P＜0.05,P＜0.01),ET-1 RSG组均低于ET-1组,其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG ET-1组较ET-1降低有统计学意义(分别为P＜0.05,P＜0.01).结论:RSG对内皮素引起心肌细胞损伤的保护作用及机制与抗氧化、降低氧自由基的产生有关.     

通补奇经法复方对人子宫内膜基质细胞功能影响实验研究

目的 :观察通补奇经法中药复方对人子宫内膜基质细胞(Human endometrial stroma cells,h ESCs)相关纤维连接蛋白(蛋白FN)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、催乳素(PRL)及纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响。方法 :体外培养h ESCs,采用MTT法发现安全中药复方浓度为10~(-4) mol/L,将实验分为溶剂对照组、甲孕酮(10~(-7) mol/L)组、甲孕酮(10~(-7) mol/L)+中药(10~(-4) mol/L)组、雌二醇(10~(-8) mol/L)组、雌二醇(10~(-8) mol/L)+甲孕酮(10~(-7) mol/L)组、雌二醇(10~(-8) mol/L)+中药试剂(10~(-4) mol/L)组、雌二醇(10~(-8) mol/L)+甲孕酮(10~(-7) mol/L)+中药(10~(-4) mol/L)组,采用ELISA方法检测各组子宫内膜基质细胞功能相关蛋白表达变化。结果 :与溶剂对照组比较,各组FN、IGF-1、PRL蛋白表达量均显著升高(P0.05或P0.01),而PAI-1表达显著减低,与甲孕酮组、雌二醇组分别比较,甲孕酮+中药组、雌二醇+甲孕酮组、雌二醇+中药组、雌二醇+甲孕酮+中药组FN、IGF-1、PRL蛋白表达量均显著升高(P0.05或P0.01),且甲孕酮+中药组、雌二醇+中药组、雌二醇+甲孕酮+中药组FN、IGF-1、PRL蛋白表达均分别高于对应的甲孕酮组、雌二醇组、雌二醇+甲孕酮组(P0.05或P0.01),而PAI-1呈现相反趋势。结论 :通补奇经法中药复方可以促进人子宫内膜基质细胞相关蛋白的表达,其作用效果与甾体类激素相近。     

尾加压素Ⅱ对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响及细胞内信号转导机制

目的: 探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)对乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖的影响及其细胞内信号转导机制. 方法: 体外培养CFs,采用MTT法、流式细胞仪(FCM)法分别观察不同浓度UⅡ作用下,CFs的细胞数、细胞周期的变化;蛋白激酶C(PKC)抑制剂Chelerythrine chloride(Che),ERK1/2抑制剂PD98059和钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂Cyclosporin A(CsA)各自对UⅡ诱导的细胞增殖的影响. 结果: 在1×10-10,1×10-9,1×10-8 mol/L UⅡ作用下,CFs的吸光度(A490 nm)值、S期细胞百分率和增殖指数(PI)均较对照组明显增加,而G0/G1期细胞百分率均较对照组明显降低(P<0.01);在1×10-7 mol/L UⅡ作用下,上述各参数与对照组比较无显著差别(P>0.05). 1×10-6 mol/L Che 1×10-8 mol/L UⅡ组,1×10-5 mol/L PD98059 1×10-8 mol/L UⅡ组和5 mg/L CsA 1×10-8 mol/L UII组的A490 nm值均高于对照组的A490 nm值(P均<0.05);而均低于1×10-8 mol/L UⅡ组的A490 nm值(P均<0.05). 1×10-6 mol/L Che 1×10-8 mol/L UⅡ, 5 mg/L CsA 1×10-8 mol/L UⅡ组与对照组比较,S期的细胞百分率和PI均有增高,而G0/G1期细胞百分率则减低(P均<0.05), 1×10-5 mol/L PD98059 1×10-8 mol/L UⅡ组与对照组则无差别(P>0.05);而1×10-6 mol/L Che 1×10-8 mol/L UⅡ, 1×10-5 mol/L PD98059 1×10-8 mol/L UⅡ,5 mg/L CsA 1×10-8 mol/L UⅡ组与1×10-8 mol/L UⅡ组比较,S期细胞百分率和PI均减低,G0/G1期细胞百分率则增高(P均<0.01). 结论: UⅡ具有促进CFs增殖的作用;UⅡ诱导的CFs增殖作用可能是通过PKC/MAPK/CaN途径实现的.     

血管紧张素-(1-7)对胰岛素分泌细胞株NIT-1增殖的影响

[目的]探讨血管紧张素[Ang-(1-7)]对小鼠胰岛素分泌细胞株NIT-1细胞增殖的影响.[方法]NIT-1细胞按以下分组分别处理24 h,采用CCK-8比色法检测细胞增殖.(1)11.1、25.0、30.0、35.0和40.0 mmol/L葡萄糖液,35.0 mmol/L甘露醇分别处理24 h;(2)0、10-7、10-6、10-5和10-4 mol/L Ang-(1-7)分别处理24 h;(3)高糖(HG,35.0 mmol/L)、HG+Ang-(1-7)(10-5 mol/L)、HG+Ang-(1-7)+Mas受体拮抗剂(A-779,10-5 mol/L)和HG+A-779组.[结果](1)较11.1 mmol/L组,葡萄糖浓度为35.0和40.0 mmol/L时,NIT-1细胞的增殖明显减低(1.02±0.07 vs 1.21±0.10;0.90±0.05 vs 1.21±0.10,P＜0.05).(2)在11.1 mmol/L葡萄糖培养条件下,10-7～10-4mol/L之间的Ang-(1-7)不影响NIT-1细胞的增殖.(3)与HG组相比,HG+Ang-(1-7)组细胞的增殖率明显增加(1.44±0.24 vs 1.14±0.07,P＜0.05),加入A-779共同孵育可逆转Ang-(1-7)的促增殖效应(1.20±0.02 vs 1.44±0.24,P＜0.05).[结论]Ang-(1-7)通过Mas受体拮抗高糖对NIT-1细胞增殖的抑制作用.     

姜黄素mPEG-PLGA纳米粒对香烟提取物刺激巨噬细胞RAW264.7所致激素抵抗现象逆转作用的研究

目的制备以单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)为载体的姜黄素纳米粒(CUR-NPs),探讨姜黄素(CUR)和CUR-NPs逆转香烟提取物(CSE)暴露所致的激素抵抗现象,比较CUR-NPs和CUR生物学作用的差异。方法采用乳化溶剂挥发法制备CUR-NPs,激光粒度测定仪和透射电子显微镜分别对CUR-NPs的粒径分布和形貌进行表征。脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW264.7布地奈德(BUD)(10~(-10)~10~(-5)mol/L)干预。LPS+CSE刺激巨噬细胞RAW264.7,BUD(10~(-10)~10~(-5)mol/L)、CUR(10~(-10)~10~(-5)mol/L)、CUR(10~(-7)mol/L)+BUD(10~(-9)~10~(-5)mol/L)、CUR(10~(-9)~10~(-5)mol/L)+BUD(10~(-7)mol/L)、CUR-NPs(10~(-9)~10~(-5)mol/L)+BUD(10~(-7)mol/L)干预,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测巨噬细胞RAW264.7所分泌的IL-8。CES刺激巨噬细胞RAW264.7,BUD(10~(-7)mol/L)、CUR(10~(-7)、10~(-6)mol/L)和CUR-NPs(10~(-7)、10~(-6)mol/L)干预,实时定量PCR检测细胞中组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)mRNA的表达,蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞中HDAC2蛋白的表达。共聚焦显微镜检测巨噬细胞RAW264.7对CUR和CUR-NPs内CUR的摄取量。结果 CUR-NPs外观呈圆形或类圆形,平均粒径为(356.4±146.6)nm。与LPS刺激相比,LPS+CSE共刺激时BUD(10~(-10)~10~(-5)mol/L)对IL-8分泌的最大抑制率显著降低(P0.05),半数抑制浓度(IC50)显著增高(P0.05)。LPS+CSE共刺激时,与BUD(10~(-10)~10~(-5)mol/L)组相比,CUR(10~(-7)mol/L)+BUD(10~(-9)-10~(-5)mol/L)组BUD对IL-8分泌的最大抑制率显著增高(P0.05),IC50显著降低(P0.05)。在LPS+CSE共刺激,CUR和CUR-NPs浓度梯度同为10~(-9)、10~(-8)和10~(-7)mol/L时,CUR-NPs+BUD(10~(-7)mol/L)组对IL-8分泌的抑制率显著高于CUR+BUD(10~(-7)mol/L)组(P0.05)。CSE刺激后细胞中HDAC2的mRNA和蛋白表达量显著降低(P0.05);与CSE组相比,CUR(10~(-7)、10~(-6)mol/L)组及CUR-NPs(10~(-7)、10~(-6)mol/L)组细胞中HDAC2的mRNA和蛋白表达量显著增高(P0.05)。浓度梯度同为10~(-7)mol/L时,CUR-NPs组细胞中HDAC2的mRNA和蛋白表达量高于CUR组(P0.05)。浓度梯度同为10~(-7)mol/L时,巨噬细胞RAW264.7对CUR-NPs内CUR的摄取量显著高于CUR(P0.05)。结论 CUR及CUR-NPs能够逆转CSE暴露所致的激素抵抗,CUR-NPs能够提高细胞对CUR的摄取量在低浓度梯度情况下,CUR-NPs具有更强的逆转激素抵抗的作用。     

蛋白激酶C不同亚型对丙泊酚血管舒张作用的影响

目的探讨丙泊酚的血管舒张作用与蛋白激酶C(PKC)不同亚型间的关系。方法将SD大鼠胸主动脉环随机分为内皮完整组(n=36)和去内皮组(n=36),每组各分6个亚组:①10 nmol/L Go6976+1×10-6mol/L去甲肾上腺素(NA)+丙泊酚处理组(n=6);②10μmol/L Rottlerin+1×10-6mol/L NA+丙泊酚处理组(n=6);③2μmol/L PKCε-Pseudo(假底物)+1×10-6mol/L NA+丙泊酚处理组(n=6);④2μmol/L PKCθ-Pseudo+1×10-6mol/L NA+丙泊酚处理组(n=6);⑤2μmol/L PKCζ-Pseudo+1×10-6mol/L NA+丙泊酚处理组(n=6);⑥1×10-6mol/L NA+丙泊酚处理组(对照组,n=6)。PKCα抑制剂Go6976,PKCδ抑制剂Rottlerin,PKCζ、θ和ε假底物孵育血管环30 min后,加1×10-6mol/L NA收缩血管环达峰值,每15 min加递增浓度的丙泊酚(1×10-6、5×10-6、1×10-5、5×10-5、1×10-4mol/L),观察血管张力的变化。结果内...     

血管紧张素Ⅱ对足细胞葡萄糖转运蛋白1的表达及膜转位的影响

【目的】观察血管紧张素II(Ang II)对体外培养的小鼠足细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达及膜转位的影响。【方法】Ang II对GLUT1m RNA和GLUT1蛋白表达的检测将体外培养的足细胞分为4组:对照组(C)、低剂量组(Ang II 10-10mol/L)、中剂量组(Ang II 10-8 mol/L)及高剂量组(Ang II 10-6 mol/L),用RT-PCR、Western blot检测GLUT1m RNA和GLUT1蛋白的表达;Ang II对GLUT1足细胞胞膜分布检测也将足细胞分为4组:C组、胰岛素(Ins)10-6 mol/L组、Ang II 10-6 mol/L+Ins10-6mol/L组及氯沙坦(LO)10-6 mol/L+Ang II 10-6 mol/L+Ins 10-6 mol/L组,Western blot检测GLUT1在胞膜的蛋白表达及间接免疫荧光观察GLUT1在胞膜的分布。【结果】m RNA与蛋白表达分组中,与对照组相比,Ang II低、中、高浓度3组GLUT1m RNA水平分别增加了5.89%、21.46%、30.95%(P皆<0.01),各组之间差别亦有统计学意义(P<0.01);蛋白表达水平分别增加了8.40%、11.79%、20.57%(P皆<0.01),各组之间差别亦有统计学意义(P<0.01),Spearman相关分析显示Ang II浓度与GLUT1蛋白表达呈正相关(r=0.934,P<0.001)。足细胞胞膜分布检测中,与对照组相比,足细胞胞膜GLUT1蛋白表达Ins 10-6 mol/L组增加了16.33%(P<0.01)、Ang II 10-6 mol/L+Ins 10-6 mol/L组增加了3.27%(P>0.05),LO 10-6 mol/L+Ang II 10-6mol/L+Ins 10-6mol/L组增加了11.33%(P<0.01);免疫荧光显示Ins组GLUT1在胞膜上的分布明显多于对照组及Ang II+Ins组,而LO干预后,胞膜的荧光强度增加。【结论】Ang II能剂量依赖性地增加足细胞胞内GLUT1的表达及合成;Ang II能够阻碍胰岛素诱发的GLUT1向足细胞胞膜的膜转位,氯沙坦可部分阻断Ang II的作用。     

大鼠系膜细胞醛固酮的合成及其对细胞外基质生成的影响

目的　证明肾脏系膜细胞能够自身合成醛固酮 ,并探讨醛固酮对系膜细胞细胞外基质生成的影响。方法　用RT PCR法检测大鼠系膜细胞醛固酮合成酶CYP11B2mRNA表达 ,PCR产物存化后直接测序 ;放免法测定系膜细胞培养上清液中醛固酮的浓度。用RT PCR半定量法比较 (3 磷酸甘油醛脱氢酶theenzymeglyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase ,GAPDH为内参照 )经 10 -10 ～ 10 -6mol/LAngⅡ或 7mmol/L、9mmol/LKCl干预 4 8h ,系膜细胞CYP11B2mRNA的表达量。大鼠系膜细胞醛固酮特异性受体 (mineralocorticoidreceptor,MR)和保护其配体特异性的 11β -羟类固醇脱氢酶 2 (11β -HSD2 )的mRNA和蛋白质表达分别用RT PCR法和细胞免疫化学法检测。以ELISA和Western印迹方法检测经 10 -7mol/L醛固酮干预 2 4h ,细胞培养上清液中层黏蛋白 (FN)和Ⅳ型胶原的浓度。结果　大鼠系膜细胞能表达CYP11B2mRNA ,且细胞培养上清液中检测到醛固酮 ,浓度为 1 0 6 5pg/ 10 6个细胞。 10 -8、10 -7mol/LAngⅡ (10 -8mol/L :2 15± 0 10 ,10 -7mol/L :1 16± 0 0 4vs非干预组 0 77± 0 0 3,P <0 0 0 1;)和 9mmol/L的KCl (1 2 7± 0 11vs非干预组 0 89± 0 12 ,P <0 0 5 )均能显著提高CYP11B2mRNA的表达。大鼠系膜细胞有MR和 11β -H     

多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1介导高糖致大鼠肾脏系膜细胞tPA/PAI-1的紊乱

目的 探讨多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1(PARP-1)在高糖(25 mmol/L)作用下大鼠肾脏系膜细胞tPA/PAI-1纤溶系统紊乱中的作用.方法 (1)体外培养大鼠肾脏系膜细胞株(MCs 1097),使用高糖(25 mmol/L)处理大鼠肾脏系膜细胞,部分实验组中应用PARP-1特异性抑制剂PJ34(3×10-6 mol/L)进行干预处理.(2) RT-PCR及Western blot检测PARP-1的mRNA及蛋白表达.(3)高通量比色测定法检测PARP-1的活性.(4) ELISA法测定细胞上清液tPA、PAI-1的分泌蛋白.结果 (1)高糖显著诱导大鼠肾脏系膜细胞PARP-1mRNA和蛋白的表达,PJ-34可明显抑制高糖诱导的PARP-1 mRNA和蛋白的过度表达.同时,高糖显著诱导大鼠肾脏系膜细胞PARP-1激活,PJ-34可显著抑制高糖诱导的PARP激活.(2)高糖轻度减少大鼠肾脏系膜细胞分泌型tPA的蛋白表达,显著增加大鼠肾脏系膜细胞分泌型PAI-1的蛋白表达,导致tPA/PAI-1比值降低,PJ-34显著预防高糖诱导的上述改变.结论 高糖可以诱导培养的大鼠肾脏系膜细胞内PARP激活,PARP1表达增加,PJ-34预处理可以明显降低高糖诱导的大鼠肾脏系膜细胞内PARP的激活以及下游tPA/PAI-1纤溶系统紊乱,提示高糖可能通过过度激活PARP来诱导tPA/PAI-1功能紊乱.     

通过共培养观察醛固酮活化后的肾小管上皮细胞对肾脏成纤维细胞的作用

目的探讨被醛固酮(ALDO)活化的人近端肾小管上皮细胞系(HKC)对人肾间质成纤维细胞(hRIFs)合成Ⅰ型胶原(ColⅠ)的影响。方法利用体外细胞培养及共培养技术进行如下试验。(1)用不同浓度及不同作用时间的外源性ALDO刺激HKC,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附(ELISA)方法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA及蛋白质表达。(2)用不同浓度及不同作用时间的安体舒通与内皮素-1(ET-1)共同刺激HKC,同上检测TGF-β1mRNA及蛋白质表达。(3)用外源性ALDO活化的HKC与hRIFs共培养(培养液中加或不加抗TGF-β1抗体),ELISA方法检测hRIFs的ColⅠ合成量。结果(1)外源性ALDO使TGF-β1表达呈剂量依赖及时间依赖性增加。1×10-9及1×10-7mol/LALDO刺激组TGF-β1表达量显著高于0mol/LALDO组(P<0.05或0.01);10-7mol/LALDO刺激不同时间后,TGF-β1表达量显著高于0h组(P<0.05或0.01)。(2)安体舒通使TGF-β1表达呈剂量及时间依赖性减少。10-9、10-7mol/L安体舒通组TGF-β1表达量显著低于0mol/L安体舒通组(P<0.05或P<0.01)。10-9mol/LET-1加10-7mol/L安体舒通与单用10-9mol/LET-1刺激不同时间后,两组间TGF-β1表达,差异有显著意义(P<0.05或0.01)。(3)10-7mol/LALDO刺激HKC12h活化细胞后,再与hRIFs共培养48h,hRIFs对ColⅠ的合成量显著增多(P<0.01);1.0、2.0μg/ml抗TGF-β1抗体能部分抑制此反应(P<0.05)。结论外源性ALDO能使HKC合成TGF-β1增加;内皮素刺激HKC产生的内源性ALDO能促进其自身合成TGF-β1;被ALDO活化的HKC能通过“传话”作用促进hRIFs合成Col-1,该作用部分为TGF-β1介导。     

地塞米松抑制培养牛眼小梁细胞AQP1表达

目的测定地塞米松对体外培养牛眼小梁细胞水通道蛋白-1(aquaporin1,AQP1)表达的影响,探讨糖皮质激素性青光眼房水引流阻力的形成机制。方法将传3代的牛眼小梁细胞用数字表法随机分为对照和地塞米松处理组。将不同浓度的地塞米松(10-5、10-6、10-7mol/L)分别加入培养液持续培养14 d,免疫细胞化学方法检测小梁细胞AQP1表达水平,计算机图像分析软件测量细胞表面积。结果经不同浓度地塞米松处理后的小梁细胞AQP1表达量吸光度值A显著低于对照组(均P=0.000)。10-7mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著大于对照组,而10-6mol/L和10-5mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著低于对照组(均P=0.000)。结论地塞米松抑制牛眼小梁细胞AQP1表达,可能参与了糖皮质激素性青光眼的发生。     

血管紧张素Ⅱ对肝癌细胞增殖的影响及其机制研究

目的:研究血管紧张素Ⅱ对肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制.方法:采用CCK-8法测定不同浓度血管紧张素Ⅱ作用24、48 h对HepG2细胞增殖的影响.通过蛋白质免疫印迹法测定血管紧张素Ⅱ处理后HepG2细胞内细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)蛋白表达水平.结果:作用24 h,10...     

Dexamethasone-induced adipogenesis in primary marrow stromal cell cultures: mechanism of steroid-induced osteonecrosis

Background In steroid-induced osteonecrosis, hypertrophy and hyperplasia of marrow fat cells and lipid deposition of osteocytes can be found in the femoral head. However, the precise reason is not clear yet. The aim of this study was to observe the effect of dexamethasone （Dex） on differentiation of marrow stromal cells （MSCs）, and to investigate the pathobiological mechanism of steroid-induced osteonecrosis. Methods MSCs in cultures were treated with increasing concentrations of Dex （0, 10^-9, 10^-8, 10^-7, and 10^-6 mol/L） continuously for 21 days. The cells, which were exposed to 0 mol/L （control） or 10^-7 mol/L Dex for 4-21 days, were then cultured for 21 days without Dex. MSCs were stained with Sudan Ⅲ. Number of adipocytes was counted under a light microscope. The activity of alkaline phosphatase （ALP） of MSCs treated with 0, 10^-8, 10-7, and 10^-6 mol/L Dex for 12 days, and that treated with 0 mol/L and 10^-7 mol/L Dex for 8, 10, or 12 days were determined. The levels of triglycerides, osteocalcin and cell proliferation of MSCs treated with 0 mol/L and 10^-7 mol/L Dex were detected. The mRNA expression levels of adipose-specific 422（aP2） gene and osteogenic gene type I collagen in MSCs treated with 0 mol/L and 10^-7 mol/L Dex for 6 days were analyzed by whole-cell dot-blot hybridization. Statistical analysis was performed using Student＇s t test and analysis of variance. P values less than 0.05 were considered significant statistically. Results The number of adipocytes in cultures increased with the duration of MSCs＇ exposure to Dex and the concentration of Dex. The level of ALP activity in the MSCs decreased with concentration of Dex. In the control group, it was 8.69 times of that in the 10^-7 mol/L Dex group on day 12 （t=20.51, P〈0.001）. The level of triglycerides in 10^-7 mol/L Dex group was 3.40 times of that in the control （t=11.00, P〈0.001）. The levels of cell proliferation and osteocalcin in the control were 1.54 and 2.42 times of that in the 10^-7 mol/L Dex group respectively. As compared to the control, the mRNA expression of adipose-specific 422（aP2） gene in 10^-7mol/L Dex group was significantly increased （t=36.48, P〈0.001）, and that of osteogenic gene type I collagen was decreased （t=42.07, P〈0.001）. Conclusions Dex can directly induce the differentiation of MSCs into a large number of adipocytes and inhibit their osteogenic differentiation, which provide a novel explanation for the pathologic changes of steroid-induced osteonecrosis.     

ERK1/2丝裂原活化蛋白激酶对醛固酮促进肾小管上皮细胞合成转化生长因子β1的作用

目的探讨ERK1/2丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径在醛固酮(ALDO)促进肾小管上皮细胞系(HKC)合成转化生长因子β1(TGF-β1)中的作用。方法利用体外培养的HKC细胞行如下试验。(1)不同浓度MAPK三种支通路特异性阻滞剂对其分别进行阻断,以酶联免疫吸附方法(ELISA)检测外源性ALDO作用下HKC合成TGF-β1量的改变。(2)不同浓度及不同作用时间的外源性ALDO刺激HKC,以Western印迹方法检测细胞裂解物中磷酸化ERK1/2以及总ERK1/2表达,并对ERK1/2相对表达量(磷酸化ERK1/2/总ERK1/2)与相应刺激条件下TGF-β1合成量进行相关分析。(3)在不同浓度的安体舒通和糖皮质激素受体阻滞剂RU486作用细胞后,以外源性ALDO刺激HKC,同上方法检测细胞裂解物中磷酸化ERK1/2及总ERK1/2表达。结果(1)15μmol/L及25μmol/LERK1/2通路阻滞剂(U0126)分别使TGF-β1的合成量减低至(87±11)pg/ml及(75±19)pg/ml,而仅使用10-7mol/LALDO刺激作用下HKC中TGF-β1的合成量(121±10)pg/ml,与前者比较差异有统计学意义(P<0·05),而JNK和P38两条支通路阻滞剂(SP600125、SB203580)未使TGF-β1合成量出现显著性变化(均P>0·05)。(2)外源性ALDO可使HKC对ERK1/2相对表达量呈现剂量依赖性增加。10-9及10-7mol/LALDO刺激组ERK1/2相对表达量分别为0·67±0·06及0·80±0·05,显著高于0mol/LALDO组(P<0·05或0·01)。相应浓度醛固酮刺激下ERK1/2相对表达量与TGF-β1合成量之间具有显著正相关关系(R=0·793,P<0·01);10-7mol/LALDO刺激HKC15min后,磷酸化ERK1/2开始出现显著性增加并达到高峰(P<0·01),其相对表达量为0·84±0·06,此后逐渐减低,至360min时其表达量为0·49±0·08,与0min比较差异无统计学意义(P>0·05)。(3)10-7mol/LALDO与10-9、10-7mol/L安体舒通共同孵育HKC30min,可使ERK1/2的相对表达量分别为0·62±0·08及0·60±0·04,显著低于0mol/L安体舒通组(P<0·05或P<0·01),但其表达量仍显著高于未加任何刺激的对照组(P<0·05);10-7mol/LALDO与相应浓度的RU486共同刺激HKC30min未使ERK1/2相对表达量显著低于0mol/LRU486组(P>0·05)。结论ERK1/2信号转导通路可能是介导醛固酮促HKC合成TGF-β1的主要通路之一,醛固酮与胞质内受体结合是其通过活化ERK1/2途径而发挥上述病理作用的重要条件。     

阿托伐他汀对心肌肥大的抑制作用及FoxO1表达的影响

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肥大心肌细胞的抑制作用及对转录因子FoxO1表达的影响。方法将H9C2细胞分为3组,对照组:未给予任何干预;心肌肥大组:给予AngⅡ(10-7 mol/L)刺激细胞;阿托伐他汀组:预先给予atorvastatin(10-5 mol/L),30min后AngⅡ(10-7 mol/L)刺激细胞。western-blotand real time PCR检测H9C2细胞FoxO1蛋白及mRNA含量,脑钠肽(brain natriuretic pepide,BNP)作为判断心肌肥大的指标。结果 AngⅡ诱导心肌细胞肥大后FoxO1表达较正常心肌细胞明显降低(P<0.05),而给予阿托伐他汀干预的肥大心肌细胞其FoxO1表达较肥大心肌明显升高(P<0.05)。结论阿托伐他汀可能通过上调FoxO1表达,从而抑制心肌肥大。     

睾酮对小鼠RAW264.7巨噬细胞肿瘤坏死因子-α和单核细胞趋化蛋白-1表达的影响及其分子机制

目的 探讨雄激素对RAW264.7巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α和单核细胞趋化蛋白(MCP)-1表达的影响及其分子机制.方法 (1)用不同浓度睾酮处理小鼠RAW264.7巨噬细胞不同时间,分别用RT-PCR和ELISA法检测细胞TNF-α和MCP-1 mRNA和培养上清液中的表达;(2)10-7 mol/L睾酮处理细胞0、10、30、60、180、360 min后,Western印迹检测磷酸化NF-κB(p-NF-κB)的表达.(3)NF-κB的抑制剂PDTC处理细胞1 h后再用不同浓度睾酮处理,用RT-PCR和ELISA法检测TNF-α和MCP-1的表达.结果 (1)①10-9和10-7 mol/L睾酮处理细胞6 h后,TNF-α mRNA表达分别增加1.78倍和1.87倍(均P<0.05),MCP-1 mRNA的表达也显著增加(均P<0.01);②睾酮处理6 h后TNF-α和MCP-1的分泌量的变化差异均无统计学意义;睾酮处理24 h后,TNF-α和MCP-1的分泌量显著增加(均P<0.05);10-7 mol/L睾酮处理组的分泌量显著高于10-9 mol/L睾酮处理组(均P<0.05).(2)随着睾酮处理时间的增加,p-NF-κB的表达增加,60 min达峰值(2.49±0.40)倍,P<0.05,以后逐渐降低.(3)PDTC预处理后再用睾酮处理6 h,TNF-α和MCP-1 mRNA的表达均低于同浓度单纯睾酮处理组(均P<0.05),但仍高于空白对照组(均P<0.05).PDTC预处理后再用睾酮处理24 h,TNF-α和MCP-1的分泌量均低于同浓度单纯睾酮处理组(除10-9mol/L睾酮组外,均P<0.05),但仍高于空白对照组(均P<0.05).结论 睾酮能促进离体的小鼠RAW264.7巨噬细胞TNF-α和MCP-1表达.NF-κB的活化是介导睾酮这一效应的分子机制之一.     

阿托伐他汀对骨髓来源的成骨细胞中OPG mRNA/RANKL mRNA水平的影响

目的:观察阿托伐他汀对体外培养骨髓基质细胞来源的成骨细胞中OPGmRNA/RANKLmRNA表达的影响。方法:小鼠骨髓基质细胞在成骨条件培养基中传代培养,加入不同浓度的阿托伐他汀。通过半定量RT鄄PCR的方法,比较不同浓度药物影响下OPGmRNA和RANKLmRNA表达的变化,评判阿托伐他汀对这两种蛋白表达的影响作用。结果:半定量RT鄄PCR的观察显示在传代培养7天时各组均有OPGmRNA的转录,随着药物浓度的增加,mRNA转录水平逐渐增加,10-6mol/L组和10-7mol/L组明显高于对照组(P<0.05)。RANKLmRNA水平随着药物浓度的增加呈现出下降的现象,10-6mol/L组和10-7mol/L组明显低于对照组。结论:在小鼠骨髓基质细胞来源的成骨细胞中,阿托伐他汀促进了成骨细胞OPG的表达,同时能抑制细胞RANKL的表达。