金发草GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及功能分析

通过RACE-PCR技术克隆得到金发草GMP基因的cDNA全长序列,命名为PpGMPase(GenBank序列号:KF586841).该基因开放阅读框长度为1086bp,编码361个氨基酸,分子式为C1787H2874N474O509S17;DNA序列由4个外显子和3个内含子组成;该基因与玉米、水稻、猕猴桃、烟草、拟南芥、番木薯等植物GMP基因具有较高的同源性,与二穗短柄草亲缘关系最近.采用荧光定量PCR方法对该基因响应非生物胁迫(盐、干旱和冷胁迫)的表达模式进行分析,结果表明:在高盐、干旱及低温胁迫后GMP基因的表达量都有显著性增加,并且其催化产物抗坏血酸含量也随之增加.     

白桦BpGRAS1基因的克隆及耐盐功能分析

【目的】 GRAS转录因子是植物特有的转录因子家族之一,在植物响应盐、干旱等非生物胁迫中发挥重要的调控作用。从白桦(Betula platyphylla )中克隆GRAS转录因子基因,研究其耐盐功能,为研究木本植物GRAS转录因子的抗逆机制奠定理论基础。【方法】 在白桦转录组数据库中获得一个GRAS转录因子基因,命名为BpGRAS1 (GenBank 登录号: MN117546.1)。利用生物信息学进行多序列比对、构建进化树。分别构建植物过表达(pROKⅡ-BpGRAS1) 及抑制表达(pFGC5941-BpGRAS1) 载体。利用农杆菌介导高效瞬时遗传转化体系获得BpGRAS1基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE) 及对照 (WT) 白桦植株。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR) 技术分析盐胁迫下OE、IE及WT植株中BpGRAS1基因的表达情况,鉴定转基因植株中BpGRAS1的表达效率是否响应盐胁迫。在盐胁迫下比较了BpGRAS1基因瞬时过表达、抑制表达及对照白桦植株的电解质渗透率、失水率、丙二醛(MDA) 含量、过氧化物酶 (POD) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性。【结果】 BpGRAS1基因的开放阅读框为1 425 bp,编码 474个氨基酸。BpGRAS1具有GRAS家族的序列特征,在C端的氨基酸序列相似度较高,与AtSHR亲缘关系较近。盐胁迫处理下,BpGRAS1的表达量升高,过表达植株中表达量高于对照,抑制表达植株中表达量低于对照,说明BpGRAS1受盐胁迫诱导,成功获得过表达及抑制表达植株。过表达BpGRAS1基因能降低白桦在盐胁迫下的电解质渗透率、失水率及 MDA 的积累,并显著增强了 POD 和 SOD 酶的活性,从而提高转基因植株的耐盐性。【结论】 BpGRAS1基因响应盐胁迫,过表达BpGRAS1基因降低了盐胁迫下植株细胞受损程度,通过增强POD 和 SOD 活性提高白桦的耐盐能力。     

美容杜鹃RcHsfB3基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE方法从美容杜鹃(Rhododendron calophytum)中克隆到一个热激转录因子(Heat shock factors,Hsfs),命名为RcHsfB3(GenBank登录号KU145694).RcHsfB3基因全长1130bp,完整的开放读码框(ORF)长771bp,预测可编码257个氨基酸,分子量为28.8KD,等电点为5.38.系统进化树分析发现,该基因与其它几种植物的HsfB3基因属于同一分支,氨基酸同源序列比对结果表明RcHsfB3与葡萄的VvHsfB3的同源性最高,达67.29%.原生质体亚细胞定位表明,RcHsfB3编码蛋白定位在细胞核上.荧光定量PCR分析显示,美容杜鹃分别受到热激、低温和盐害胁迫处理后,RcHsfB3的相对表达量总体呈现先上升,后下降,且"上升-下降"交替的表达趋势.初步研究表明RcHsfB3基因受高温、低温和高盐胁迫的诱导表达.     

甘蓝型油菜BnBRI1基因的克隆及表达分析

以拟南芥油菜素内酯受体BRI1基因序列设计同源简并引物,利用同源克隆技术,克隆了甘蓝型油菜中编码油菜素内酯受体基因全长cDNA序列,命名为BnBRI1(GenBank:JX871217),该基因开放阅读框(ORF)大小为3591bp,与拟南芥中BRI1基因(GenBank:NM_120100)相似性为94.21%,编码1196个氨基酸,与拟南芥中BRI编码的氨基酸相似性为89.23%.采用实时定量PCR分析表明,BnBRI1基因在根、茎、叶中都有表达,但表达量存在显著差异.在两叶一心期和花期的根中表达量最高,四叶一心期和抽薹期的叶中表达量最高.     

油菜MAP激酶基因BnMPK6基因的克隆及表达分析

从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAP激酶基因BnMPK6,全长1521 bp,其中包括1185 bp的开放阅读框,81 bp的5′非翻译区(5′UTR),255 bp的3′非翻译区(3′UTR).与拟南芥AtMPK6同源性达86.9%,因此命名为BnMPK6(GenBank登录号为HQ156228).该基因编码394个氨基酸的蛋白质,分子量44.8 kDa,等电点为5.13.实时荧光定量PCR结果表明该基因表达量随着低温胁迫时间的增长而增高,说明BnMPK6基因受低温胁迫诱导表达.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

枸杞抗坏血酸氧化酶基因的克隆与表达分析

以枸杞为材料,利用同源克隆技术,克隆了枸杞抗坏血酸氧化酶(AO)的全长cDNA序列,命名为LcAO基因(GenBank:KP712033),该基因开放阅读框(ORF)大小为1737bp,编码578个氨基酸,与西红柿AO蛋白的同源性达到90%.LcAO编码的氨基酸序列包含3个多铜氧化酶结构域和跨膜信号序列.采用实时荧光定量PCR分析显示,LcAO基因在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少.     

柽柳ThPR1基因的克隆与表达分析

通过对盐胁迫后刚毛柽柳(Tamarix hispida)7个转录组分析,鉴定获得病程蛋白相关基因PR1(命名为ThPR1)全长cDNA序列,该基因全长756 bp,编码区长537 bp,编码含178个氨基酸的蛋白质,分子质量为20.53 ku,理论等电点(pI)为9.75。为了研究该基因对逆境胁迫的应答情况,采用实时定量RT-PCR技术分析了刚毛柽柳在PEG、NaCl胁迫及外源ABA处理后不同组织中基因的表达。结果表明,NaCl会诱导ThPR1基因在根和叶中的表达,而PEG和ABA处理则抑制该基因在根和叶中的表达。     

皱纹盘鲍Hdh-MMP-1基因cDNA的克隆及原核表达

利用同源克隆方法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉组织中克隆得到基质金属蛋白酶-1基因(Hdh-MMP-1)cDNA全长序列(GenBank登录号:KR537291)。结果表明,Hdh-MMP-1 cDNA全长2136 bp,其中ORF长度为1551 bp,编码区含有516个氨基酸残基,预测其分子质量为58.94 ku,理论等电点为5.99。Hdh-MMP-1具有MMPs家族典型的N-端前肽区、催化区、铰链区和C-端类血红素结合区。利用SOPMA和SWISS-MODEL软件对该基因编码蛋白质高级结构进行了预测分析。氨基酸序列相似性结果显示,Hdh-MMP-1不仅与多种生物MMP-1基因具有序列相似性,且与某些软体动物和虫类的MMP-14及MMP-19也具有序列相似性。多序列比对结果显示,Hdh-MMP-1与红螺鲍、杂色鲍、美洲牡蛎的MMP-1相似性分别为95.29%、82.35%、38.85%。随后,构建了表达载体pET28a-catMMP-1,利用大肠杆菌原核表达系统,在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功对该蛋白质催化区进行异源表达。     

松墨天牛原肌球蛋白基因的克隆和表达检测

利用先前构建的cDNA文库和RACE方法,克隆了松墨天牛原肌球蛋白基因的cDNA全长,该序列长1 203 bp,命名为MaTm(GenBank登录号:KM099072),其中开放阅读框长852 bp,编码283个氨基酸.MaTm的氨基酸序列与赤拟谷盗 (Tribolium castaneum)相似性最高,为97%,与家蚕相似性 (Bombyx mori)为94%.松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上.用 RT-qPCR 分析了MaTm的相对表达量,结果显示:蛹和幼虫的表达量低于成虫;成虫足和头的表达量高于对照;在幼虫各组织中均有表达,且差异显著(p0.05),其中在体壁的表达量最高.     

佛手挥发油对小鼠体内B16黑色素瘤生长的影响

观察了佛手挥发油对小鼠体内B16黑色素瘤生长的影响．以B16黑色素瘤细胞感染小鼠建立动物肿瘤模型,设正常对照组、阴性对照组和阳性对照组及佛手挥发油低、中、高剂量组,各组荷瘤小鼠予以相应的药物实施干涉14d,每天观察各组荷瘤小鼠的肿瘤生长情况,14d后测定荷瘤小鼠的心、肝、肾中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量．与阴性对照组相比,50mg／kg剂量佛手挥发油能显著抑制雌性荷瘤小鼠移植瘤的增殖（P〈0．05）,显著提高其肝脏中SOD活性（P〈0．01）．表明佛手挥发油对B16移植瘤具有抑制作用．     

茶花和佛手胶孢炭疽菌对不同类型杀菌剂敏感性研究

为检测胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)对保护型、内吸型和复合型3种不同类型杀菌剂的敏感性,在实验室条件下,采用菌丝生长速率法测定了来源于四季茶花和佛手的炭疽病原菌对6种杀菌剂的敏感性.结果表明:炭疽病菌对复合型杀菌剂敏感性最高,其次是保护型,最低是内吸型;2株炭疽病原菌对复合型杀菌剂30%苯甲丙环唑敏感性最强,EC50分别为2.287 8 mg/L和3.075 7 mg/L.综合分析认为,复合型杀菌剂30%苯甲丙环唑和80%多福锌可作为今后防治茶花和佛手炭疽病的有效杀菌剂.     

佛手叶挥发油的成分分析及生物活性研究

分析了佛手叶挥发油的成分,检测了其生物活性.采用水蒸气蒸馏法提取佛手叶挥发油,气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测了佛手叶挥发油的成分,比浊法检测了其抑菌活性,噻唑蓝法检测了其细胞活力.佛手叶挥发油含有40种成分,以d-柠檬烯、γ-松油烯、对伞花烃、α-蒎烯、β-蒎烯为主要成分,其中d-柠檬烯和γ-松油烯的含量分别占50.53%和24.05%.佛手叶挥发油对草绿色链球菌、肺炎克雷伯菌、摩氏摩根菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌和溶血性链球菌等均有抑制作用,其半抑制浓度(IC50)分别为1.1,2.1,6.8,7.2,13.7和19.3 mg/mL;佛手叶挥发油对Hep3B,HUVEC,Huh7,SP2/0,A549和PANC-28等癌细胞具有抑制作用.     

佛手叶挥发油对HeLa细胞形态与结构的影响

探讨了佛手叶挥发油对HeLa细胞形态与结构的影响.采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,倒置显微镜、荧光显微镜和电子显微镜观察细胞形态与结构的变化,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察微管的分布.结果表明:佛手叶挥发油能够抑制HeLa癌细胞的增殖,呈剂量和时间依赖性;不同浓度的佛手叶挥发油处理HeLa癌细胞24 h后,低剂量(200μg/mL)佛手叶挥发油使HeLa细胞皱缩,染色质凝集,出现凋亡小体,微管解聚,表现为典型的凋亡特征;中、高剂量(400和800μg/mL)佛手叶挥发油使HeLa细胞膜裂解,内容物外泄,细胞碎片增多,表明细胞已坏死.     

金华佛手的介质栽培及生理指标分析

对栽培金华佛手的7种介质、4种培养液组合，通过分析金华佛手的生长势、叶绿素含量、蛋白质含量、光合作用强度、结实率和产量等生理指标，筛选出了适合栽培金华佛手的介质和培养液。     

物料干燥特性的研究

本文通过对四种中药材的干燥性能试验，探讨了影响物料干燥过程的主要因素，给出了干燥过程的数学模型，为设计物料干燥装置和提高热能利用率提供了依据．     

Cloning of human cytokine signal transduction inhibitor genehumSOCS-2

An EST (gb/AA115239) with high identity to the mouse cytokine signal transduction inhibitor genemmSOCS-2 was selected in GenBank EST database by the homologous screening method. The cDNA with the same sequence of the EST was got in human placenta cDNA library by PCR and a 1011 bp cDNA fragment was selected using above cDNA as probes to perform walking hybridization in placenta cDNA library. The cDNA fragment contains one 594 bp open reading frame (ORF) which encodes 198 amino acid residues. It was proved to be novel after NCBl database screening. Homology comparison showed that this gene has 93% identity tommSOCS-2 at the amino acid level and it has high identities to other related genes in SH₂ domain and SOCS box, so it was namedhumSOCS-2 and the accession number in GenBank is gb/AF020590. The expression analysis showed that the gene is expressed obviously higher in prostate than in other 15 human tissues.     

寄主植物对不同龄期中华稻蝗若虫酯酶活性的影响

以中华稻蝗为研究对象,以狗尾草、小麦、晋稻8号、晋稻9号、旱稻297号为寄主植物,测定了饲喂不同寄主植物后中华稻蝗1-5龄若虫的酯酶活性.结果表明,饲喂不同寄主植物后,中华稻蝗各龄期若虫酯酶比活性均是狗尾草组最低,晋稻9号组最高,且两者差异显著,晋稻9号组的活性是狗尾草组的1.65-2.22倍,推测晋稻9号可能有某种特殊的物质,对中华稻蝗若虫酯酶的诱导作用较强.研究结果还显示,无论饲喂何种寄主植物,中华稻蝗若虫酯酶比活性均表现为随着龄期的增长,活性逐渐增高的趋势.     

一个由 HSV-1诱导的人成纤维细胞差异基因的电子克隆和特性分析

目的 :对单纯疱疹病毒1型感染KMB -17细胞后的早期基因反应进行研究。方法 :从HSV -1感染后细胞特异性cDNA文库中筛选出一个EST片段 (GeneBank登录号:Aw307599) ,NorthernBlot分析证实了该基因片段的病毒相关特异性 ,并采用生物信息学的方法进行基因的电子克隆。结果 :克隆出一个新的全基因序列HSP -5contig(GeneBank登录号 :AY142148)。结论 :HSP -5含有完整的ORF框架 ,cds全长456bp,编码156个氨基酸 ;对该基因及其编码蛋白序列的特征进行了分析和预测 ,初步推测了该基因和编码蛋白的结构特点。