甲基转移酶SETDB2对肝癌侵袭迁移的影响及其机制研究

摘要：目的 检测甲基转移酶SETDB2对肝癌侵袭转移的影响并探讨其机制。方法 应用Western blot、免疫组 化以及 Real-time PCR 等方法检测 37 例肝癌及对应癌旁组织标本中 SETDB2 蛋白及 mRNA 表达情况。将靶向 SETDB2 的短发卡 RNA（sh-SETDB2）和空载体（sh-NC）分别转染至人肝癌 MHCC97H 细胞构建稳转细胞系,应用 Tanswell侵袭实验、细胞划痕实验检测2组细胞的侵袭和迁移能力。通过基因芯片检测敲低SETDB2后表达有变化 的基因。敲低SETDB2后,运用Real-time PCR检测PTEN的mRNA的表达变化以及Western blot检测PTEN和组蛋白 H3第9位赖氨酸的三甲基化（H3K9me3）的表达变化,CHIP 检测H3K9me3在PTEN 的启动子区域的变化。在敲低 SETDB2的同时敲低PTEN的表达,Tanswell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果 （1）Western blot和Real-time PCR的结果均表明肝癌组织中SETDB2蛋白及mRNA表达水平均高于癌旁组织;SETDB2表达的高低与肝癌组织学 分级和TNM分期有关。（2）转染sh-SETDB2的MHCC97H细胞的侵袭和迁移能力均明显低于sh-NC组。（3）基因芯 片、Western blot以及Real-time PCR等实验结果显示敲低SETDB2后PTEN表达上调。（4）在敲低SETDB2后H3K9me3 表达下调,PTEN启动子区域的H3K9me3减少。（5）与敲低SETDB1组相比,敲低SETDB2的同时敲低PTEN后细胞的 侵袭能力恢复。结论 SETDB2通过下调PTEN的表达促进肝癌细胞的侵袭迁移。     

白藜芦醇对CXCL12 诱导的胃癌细胞增殖的影响

目的　探讨白藜芦醇对趋化因子CXCL12 诱导的人胃癌SGC-901 细胞增殖及其CXCR4、CXCR7和VEGF mRNA 表达的影响。 方法　用CXCL12 刺激人胃癌SGC-7901 细胞后,采用MTT 法检测细胞增殖率;应用RT-PCR 法检测细胞内CXCR4、CXCR7 和VEGF mRNA 的表达水平。同时观察白藜芦醇对CXCL12所诱导的人胃癌SGC-7901 细胞增值率,CXCR4、CXCR7 和VEGF mRNA 表达水平的影响。结果　不同浓度的CXCL12 均可以显著促进人胃癌SGC-7901 细胞体外增殖（P<0.001）。CXCL12 可显著上调SGC-7901 细胞 CXCR4、CXCR7 和VEGF 的mRNA 表达,而白藜芦醇显著抑制CXCL12 所诱导的胃癌细胞体外增殖和CXCR4、CXCR7、VEGF mRNA 的表达。结论　白藜芦醇抑制CXCL12 诱导的胃癌细胞增殖,其机制可能与下调CXCR4 和CXCR7 水平,从而抑制VEGF 分泌有关。     

靶向METCAM/MUC18的siRNA调节肝癌细胞迁移、侵袭的实验研究

目的　研究靶向METCAM/MUC18 的siRNA 在肝癌细胞迁移、侵袭中的作用。方法　培养肝癌细胞株HepG2 并转染MUC18 的siRNA 和阴性对照（NC）的siRNA，转染siRNA 后检测细胞的迁移和侵袭数目、MMPs 及上皮间质转化标志基因的mRNA 表达量。结果　MUC18-siRNA 组HepG2 细胞中MUC18 的mRNA 表达量显著低于NC-siRNA 组；转染siRNA 后12 h、24 h，MUC18-siRNA 组HepG2 细胞的迁移数目和侵袭数目均显著低于NC-siRNA 组；转染siRNA 后24 h，MUC18-siRNA 组HepG2 细胞MMP8、MMP9、MMP14、N-cadherin、Vimentin 的mRNA 表达量均显著低于NC-siRNA 组，E-cadherin 的mRNA 表达量显著高于NC-siRNA 组。结论　靶向METCAM/MUC18 的siRNA 能够通过抑制MMPs 表达和上皮间质转化来抑制肝癌细胞的迁移、侵袭过程。     

siRNA 靶向沉默 Lipocalin-2基因下调 MMP-9表达对降低人肺癌 A549细胞的侵袭、迁移能力的影响

目的：利用针对 Lipocalin-2的小干扰 RNA（siRNA）,观察 Lipocalin-2基因沉默对人肺癌 A549细胞MMP-9表达及侵袭、迁移能力的影响。方法采用 Real-time PCR 和 Western blot 检测 Lipocalin-2在3种肺癌细胞株（A549、NCI-H661、NCI-H446）及正常人支气管上皮细胞（HBE）的表达情况。设计并构建靶向 Lipocalin-2的 siRNA 转染 A549细胞,采用 Real-time PCR 和 Western blot 检测转染效率及 Lipocalin-2基因沉默对 MMP-9 mRNA 和蛋白表达的影响。Transwell 小室检测细胞侵袭能力。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 Lipocalin-2 mRNA 和蛋白在肺癌A549、NCI-H661、NCI-H446细胞株中的表达水平均显著高于 HBE 细胞,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。siRNA-Li-pocalin-2转染组 Lipocalin-2 mRNA 和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）;siRNA-Lipocalin-2转染组 MMP-9 mRNA 和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）;siRNA-Lipocalin-2转染组穿膜细胞数、平均迁移距离与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。结论 Lipocalin-2基因沉默通过下调 MMP-9表达降低了人肺癌 A549细胞的侵袭和迁移能力。     

卵巢肿瘤干细胞中趋化因子的表达与细胞侵袭转移能力的关系

目的探讨卵巢肿瘤干细胞中趋化因子的表达与细胞侵袭转移能力的关系,为卵巢肿瘤的治疗提供新的研究思路和药物作用靶点。方法采用流式细胞术与RT-PCR方法检测卵巢肿瘤干细胞系CAOV-3中CXCR4的表达,通过体外微孔隔离室（Transwell）检测CXCR4对CAOV-3细胞侵袭转移能力的影响。结果 CXCR4在CAOV-3中细胞呈阳性表达,CXCL12可促进CAOV-3细胞的迁移,CXCR4的封闭能抑制CXCL12对CAOV-3迁移的促进作用。结论 CXCL12-CXCR4相互作用可促进卵巢肿瘤干细胞侵袭转移,在卵巢肿瘤的生长和侵袭转移过程中起着重要作用。     

CXCL12-CXCR4生物轴与卵巢癌关系的动物实验研究

目的探讨CXCL12。CXCR4趋化因子轴与卵巢癌发病的关系。方法将转染质粒SKOV3／CXCR4、转染载体SKOV3／neg及未转染的SKOV3三种卵巢癌细胞进行体外培养,建立荷人卵巢癌细胞裸鼠腹腔移植瘤模型,观察各组裸鼠自然死亡后腹腔成瘤数、体积、腹水量和存活期的变化。结果3组裸鼠生存时间、腹腔移植瘤的个数和重量比较差异有统计学意义（P〈0．05）,CXCL12浓度越高,受试裸鼠腹腔移植瘤个数越多,重量越大,生存时间越短。结论CXCL12-CXCR4趋化因子轴与卵巢癌的发生有一定的相关性,可能是其发病的一个重要原因,在一定程度上也反映了病情的轻重。     

CXCL12-CXCR4生物轴与卵巢癌关系的动物实验研究

目的：探讨CXCL12-CXCR4趋化因子轴与卵巢癌发病的关系。方法将36只裸鼠按照体重大小编号,随机分为3组,将转染质粒SKOV3／CXCR4、转染载体SKOV3／neg及未转染的SKOV3三种卵巢癌细胞进行体外培养,取三种细胞悬液4×106个（200μl）于裸鼠左下腹注入腹腔,建立荷人卵巢癌细胞裸鼠腹腔移植瘤模型。自注入肿瘤细胞后第2天起,将每组裸鼠又随机分为对照组和处理组,对照组腹腔内注射0い．9％氯化钠溶液0．2 ml,处理组腹腔内注射CXCL12-CXCR4拮抗剂AMD3100,观察各组裸鼠自然死亡后腹腔成瘤数、体积、腹水量和存活期的变化。结果 SKOV3／CXCR4、SKOV3／neg及SKOV3三种卵巢癌细胞接种于裸鼠腹腔后1周左右荷瘤裸鼠在对照组和处理组体重差比较,差异有统计学意义（ P ＜0．05）。接种SKOV3／CXCR4细胞的裸鼠对照组的平均生存期与CXCR4拮抗剂AMD3100处理组裸鼠比较,差异有统计学意义（ Z ＝－2．29, P ＜0．05）;而接种SKOV3／neg细胞的裸鼠对照组的平均生存期与CXCR4拮抗剂AMD3100处理组裸鼠比较,差异无统计学意义（ P ＞0．05）;接种SKOV3细胞的裸鼠平均生存期与CXCR4拮抗剂AMD3100处理的裸鼠比较,差异无统计学意义（ P ＞0．05）。接种SKOV 3／CXCR4细胞裸鼠的对照组腹腔移植瘤的平均个数和平均重量与CXCR4拮抗剂AMD3100处理组比较,差异有统计学意义（ P ＜0．05）。结论 CXCL12-CXCR4趋化因子轴与卵巢癌的发生有一定的相关性,可能是其发病的一个重要原因,在一定程度上也反映了病情的轻重。     

miR-505靶向调控HMGB1逆转肝癌细胞阿霉素耐药

目的 观察miR-505对阿霉素(ADM)耐药肝癌细胞耐药性及HMGB1表达的影响并探讨其机制.方法 采用药物浓度递增法建立肝癌细胞MHCC97阿霉素耐药细胞株MHCC97/ADM即为耐药组,培养48 h肝癌亲本细胞为MHCC97亲本细胞组;以MTT法检测MHCC97亲本细胞组及耐药细胞组(MHCC97/ADM细胞)的...     

慢病毒介导的干扰ClC-3肝癌稳定细胞株的建立及其侵袭和迁移能力的改变

目的建立慢病毒介导的靶向干扰电压门控氯通道3(voltage-gated chloride channel 3,Cl C-3)的稳定肝癌细胞株,并探讨其侵袭和迁移能力的改变。方法构建靶向Cl C-3的3个短发夹状RNA(short-hairpin RNA,sh RNA)慢病毒表达载体,293FT细胞包装慢病毒并测定滴度。重组慢病毒感染肝癌细胞株MHCC97H,筛选稳定干扰细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测Cl C-3 m RNA和蛋白的表达以确定干扰效率。Transwell小室实验(含Matrigel和不含Matrigel)和细胞划痕实验检测Cl C-3基因被抑制后侵袭和迁移能力的改变。结果成功获得4种慢病毒,感染MHCC97细胞后,建立1株阴性对照细胞和3株Cl C-3稳定干扰细胞(MHCC97H/sh Cl C-3-1、sh Cl C-3-2和sh Cl C-3-3)。3株稳定干扰细胞Cl C-3 m RNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照细胞(P<0.01),MHCC97H/sh Cl C-3-2细胞对Cl C-3的抑制效果最好。与阴性对照细胞相比,MHCC97H/sh Cl C-3-2细胞侵袭和迁移能力都下降(P<0.01)。结论成功建立稳定干扰Cl C-3基因的肝癌细胞株,Cl C-3表达抑制会降低MHCC97H细胞的侵袭和迁移能力。     

去甲斑蝥素对CXCR4表达及MCF-7细胞迁移的影响

目的探讨去甲斑蝥素(NCTD)抑制乳腺癌细胞MCF-7侵袭转移的机制。方法体外培养人乳腺癌MCF-7细胞株,采用MTT法检测NCTD对MCF-7细胞增殖抑制浓度;建立体外细胞趋化转移模型分析200,400,600μmol/LNCTD抑制MCF-7细胞迁移的能力;realtime PCR、Western blot分析不同浓度药物处理后的MCF-7细胞中CXCR4及CXCL12表达。结果NCTD可抑制MCF-7细胞增殖,具有明显的量效关系,24h的IC50为582μmol/L;在体外条件下,NCTD可以抑制CXCL12所趋化的细胞迁移;同时可以抑制MCF-7细胞中的CXCR4表达。结论NCTD通过下调CXCR4的表达抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移。     

舒芬太尼调控 miR-1抑制肝癌细胞 MHCC97-H增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的 探讨舒芬太尼调控微小RNA-1(miR-1)表达对人肝癌MHCC97-H细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制.方法 本研究起止时间为2018年3月至2019年9月,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测不同浓度的舒芬太尼对人肝癌MHCC97-H细胞活力的影响,qRT-PCR检测舒芬太尼对MHCC97-H细胞中miR-1表达的影响;通过脂质体转染法将miR-1抑制剂(inhibitor)及阴性对照转染至MHCC97-H细胞,实验分为Control组、舒芬太尼(Sufentanil)组、转染对照(Sufentanil+NC)组和转染(Sufent-anil+miR-1)组.细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测各组MHCC97-H细胞增殖能力,Transwell实验检测各组MHCC97-H细胞侵袭能力,划痕实验检测各组MHCC97-H细胞迁移能力,蛋白质印迹法(Western blotting)检测各组MHCC97-H细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达情况.结果 不同浓度的舒芬太尼对肝癌MHCC97-H细胞活力具有不同程度的抑制作用;与Control组比,Sufentanil组MHCC97-H细胞中miR-1的表达[(1.00±0.09)比(2.25±0.24)]明显升高(P<0.05),细胞增殖[(0.54±0.05)比(0.34±0.03)]、侵袭[(106.24±8.25)个比(51.34±5.02)个]和迁移能力[(37.36±4.01)％比(16.34±1.72)％]降低(P<0.05),MMP-2[(0.33±0.04)比(0.15±0.02)]和MMP-9[(0.24±0.02)比(0.11±0.01)]的表达下调(P<0.05);与Sufentanil+NC组比,Sufentanil+miR-1组MHCC97-H细胞中miR-1的表达[(2.20±0.21)比(1.42±0.15)]明显降低(P<0.05),细胞增殖[(0.32±0.03)比(0.46±0.04)]、侵袭[(52.36±5.14)个比(91.16±6.06)个]和迁移能力[(17.11±1.71)％比(29.85±3.10)％]升高(P<0.05),MMP-2[(0.15±0.02)比(0.27±0.02)]和MMP-9[(0.13±0.01)比(0.19±0.02)]的表达上调(P<0.05).结论 舒芬太尼可通过调控miR-1的表达抑制人肝癌MHCC97-H细胞的增殖、侵袭和迁移,其机制可能与调控MMP-2和MMP-9表达有关.     

改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型

目的 建立桡足类超绿色荧光蛋白（copepod super green fluorescent protein，copGFP）与纳米荧光素酶（nano luciferase，Nluc）标记的MHCC97-H人肝癌细胞株，通过改进型颈动脉注射法构建应用小动物活体成像系统观察的裸鼠脑转移模型。方法 使用携带目的基因的慢病毒载体质粒通过磷酸钙法转染293FT细胞，包装慢病毒后感染MHCC97-H细胞，经嘌呤霉素筛选感染阳性细胞，通过有限稀释法纯化得到稳定表达copGFP及Nluc的单克隆细胞株。通过改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移模型，应用活体成像系统监测颅内转移灶生长情况。结果 成功建立了copGFP与Nluc标记的MHCC97-H肝癌细胞稳定株。分别使用稳定株与原始株细胞通过改进型颈动脉注射法造模，2组荷瘤裸鼠体质量变化及生存曲线无统计学差异，使用稳定株造模裸鼠可通过活体成像系统实时监测到脑转移的形成，所检测生物发光信号强度随肿瘤生长逐渐增强。结论 经copGFP与Nluc标记的MHCC97-H人肝癌细胞通过改进型颈动脉注射法成功构建裸鼠脑转移模型，可通过活体成像系统进行无创、连续可视化监测，为肝癌脑转移机制的研究及治疗药物的研发提供理想的动物模型。     

CXCR4和VEGF-C在胃癌的表达及与肿瘤转移的关系

目的探讨趋化因子受体(CXCR4)和血管内皮生长因子C(VEGF-C)在人胃癌组织中的表达及其与转移的关系。方法选择207例胃癌标本,应用免疫组织化学染色方法,检测CXCR4和VEGF-C在人胃癌组织中的表达,同时对其与临床病理参数的关系进行统计学分析。结果CXCR4在胃癌组织中的阳性表达率为35.7%,其中淋巴结转移组表达率为54.2%,无淋巴结转移组表达率为25.6%,有显著性差异(P<0.01)。腹膜转移组表达率为78.4%,无腹膜转移组表达率为26.5%,有显著性差异(P<0.01)。VEGF-C在胃癌组织中的阳性表达率为32.4%,其中淋巴结转移组表达率为48.2%,无淋巴结转移组表达率为21.8%,二者差异显著(P<0.01)。腹膜转移组表达率为27.0%,无腹膜转移组表达率为33.5%,无统计学差异(P>0.05)。同时,CXCR4阳性表达与VEGF-C阳性表达呈显著正相关(P<0.05)。胃癌CXCR4和VEGF-C的表达水平与肿瘤细胞淋巴结转移和腹膜转移密切相关,与胃癌组织学类型、分化程度及肿瘤浸润深度、年龄、性别、肿瘤大小等无相关性(P>0.05)。结论CXCR4和VEGF-C的表达可作为评估胃癌转移与复发的一个观测指标。     

Inhibition of invasion and metastasis of MHCC97H cells by expression of snake venom cystatin through reduction of proteinases activity and Epithelial-Mesenchymal Transition

Snake venom cystatin (sv-cystatin) is a member of the cystatin family of cysteine protease inhibitors. To further evaluate the possibility of sv-cystatin in cancer therapy, this study examined the effects of sv-cystatin on the invasion and metastasis of liver cancer cells (MHCC97H) in vitro and in vivo as well as the underlying mechanism. sv-cystatin cDNA was transfected into MHCC97H cells and the anti-invasion and antimetastasis effects of sv-cystatin were determined using migration and matrigel invasion assays and a lung-metastasis mice model. The results suggest that sv-cyst clone (sv-cystatin expression in MHCC97H cells) delayed the invasion and metastasis in vitro and in vivo compared to the parental, mock and si-sv-cyst clone cells (inhibited sv-cystatin expression by siRNA). The decreased activities of cathepsin B, MMP-2 and MMP-9 and EMT change index including higher E-cadherin, lower N-cadherin and decreased Twist activity were observed in the sv-cyst clone, which contributes to the change in invasion and metastasis ability of MHCC97H cells. This study provides evidence that expression of the sv-cystatin gene in MHCC97H cells inhibits tumor cell invasion and metastasis through the reduction of the proteinases activity and Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT), which might contribute to the anticancer research of the sv-cystatin protein.     

趋化因子CXCL12/CXCR4在非小细胞肺癌中的表达

目的:探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及与临床病理特征间的关系。方法:采用免疫组织化学SP三步法检测95例NSCLC患者肿瘤组织及27例肺部良性肿瘤患者(对照组)的石蜡标本中CXCL12、CXCR4的表达情况,并比较其在不同临床病理参数患者间表达的差异。结果:对照组中,CXCL12和CXCR4的高表达率分别为0和7.4%(2/27),NSCLC患者的高表达率分别为54.7%(52/95)和42.1%(40/95),差异均有统计学意义(P<0.01)。在NSCLC中,淋巴结转移组的CXCL12和CXCR4的高表达率(67.2%、51.7%)均高于非转移组(35.1%、27.0%),差异均有统计学意义(P<0.05)。CXCL12、CXCR4的高表达率均随TNM分期的增高而逐渐增高,且Ⅲ期的高表达率明显高于Ⅰ期,差异有统计学意义(P<0.01)。NSCLC患者CXCL12与CXCR4之间无明显相关性。不同年龄、性别、肿瘤大小、组织学分型及分化程度NSCLC患者之间CXCL12、CXCR4的高表达率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CXCL12、CXCR4的表达水平可作为判断NSCLC预后的参考指标。