PKC/CUGBP1信号通路与强直性肌营养不良骨骼肌病理特征的关系

目的探讨强直性肌营养不良(DM)骨骼肌中蛋白激酶C/CUG三联体重复RNA结合蛋白(PKC/CUGBP1)信号通路与骨骼肌纤维病理特征的关系。方法选取11例DM患者(DM组)与11例无肌不良骨折患者(正常组),均行肌肉活检病理检查;组织化学染色(HE、MGT、NSE、NADH-TR、ACP、ATP)观察病理特征;免疫印迹检查肌肉组织中PKC/CUGBP1信号通路关键蛋白PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1的表达,并分析PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1蛋白表达水平与DM患者病理特征的相关性。结果组织化学染色显示,DM患者骨骼肌出现大量肌纤维异常、肌纤维核内移;DM组肌肉组织中p-PKCδ、CUGBP1蛋白表达水平均明显高于正常组(t=-23.907、-36.743,均P<0.001),且均与肌纤维萎缩、肌纤维肥大、肌纤维核内移发生率呈正相关(均P<0.05)。结论PKC/CUGBP1信号通路在DM中的活性与患者骨骼肌发生肌纤维异常、肌纤维核内移的病理特征存在相关性。     

PKCε信号通路介导甘青铁线莲活性成分APG抗心肌缺血再灌注损伤的机制研究

目的研究不同浓度甘青铁线莲活性成分APG对H9C2大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其可能的机制。方法体外培养H9C2大鼠心肌细胞,经2μM/L和4μM/L的APG预处理24 h后,建立缺氧复氧损伤模型(I/R)(缺氧45 min,复氧3 h)。采用CCK-8法检测细胞活力,检测细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)的释放量、丙二醛(MDA)的释放量和细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活力;采用Western Blot法检测细胞内蛋白激酶Cε(PKCε)、Caspase-3、Bax和Bcl-2表达情况,使用特异性PKCε抑制剂CHE观察PKCε信号通路在此过程中的作用。结果 I/R处理可抑制H9C2细胞活性,细胞培养基中LDH、MDA含量升高,SOD活力降低(与Control组比较,P0.05)。抑制PKCε表达,上调Caspase-3表达,下调Bcl-2/Bax比例(与Control组比较,P0.05)。2μM/L和4μM/L的APG预处理均可发挥细胞保护作用,降低LDH与MDA释放量,提高SOD活力(与I/R组比较,P0.05)。此外,APG处理对抗了I/R损伤引起的PKCε表达下调,抑制Caspase-3表达,提高了Bcl-2/Bax比例(与I/R组比较,P0.05)。CHE处理后细胞活力下降,Caspase-3表达上调,Bcl-2/Bax比例下降,凋亡增加(与APG+I/R组比较,P0.05)。结论甘青铁线莲中活性成分APG可减轻心肌缺血再灌注损伤,其机制可能是激活PKCε相关信号通路,最终抑制心肌细胞凋亡。     

不同糖浓度中大鼠DRG神经元相关蛋白表达及Ca2+浓度的测定

目的观察高糖对背根神经节(DRG)中瞬时感受器电位香草酸受体4(TRPV4)和蛋白激酶Cε(PKCε)的表达以及细胞内Ca2+浓度的影响,探讨其在糖尿病大鼠神经病理性疼痛形成中的作用机制。方法培养的新生大鼠DRG神经元分成正常对照组(C组)、中糖组(M组)和高糖组(H组)。48 h后通过蛋白质免疫印迹法测定DRG神经元TRPV4和PKCε的表达水平,并通过共聚焦显微镜测定DRG神经元[Ca2+]i的水平。结果 TRPV4、PKCε蛋白的表达上调且呈浓度依赖性。C组、M组、H组TRPV4蛋白分别为0.33±0.05、3.20±0.40和7.69±0.60;PKCε蛋白分别为0.88±0.04、1.08±0.08和1.97±0.35。在TRPV4激动剂4α-PDD的作用下,与C组比较,H组[Ca2+]i显著升高(P<0.05),且呈浓度依赖。结论高糖可以上调DRG神经元中TRPV4、PKCε蛋白的表达,增加神经元内Ca2+浓度。TRPV4、PKCε对DRG神经元内Ca2+起到了协同调控的作用。     

血管紧张素Ⅱ和坎地沙坦对小鼠骨骼肌细胞C2C12胰岛素敏感性的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ和坎地沙坦对小鼠骨骼肌细胞(C2C12)胰岛素敏感性的影响及其机制。方法 C2C12诱导分化成熟后,分为对照组(C组)、模型组(M组,AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦低剂量组(Can1组,坎地沙坦0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦中剂量组(Can2组,坎地沙坦1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦高剂量组(Can3组,坎地沙坦10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)。各组细胞给予相应药物及胰岛素处理后,使用二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成水平,使用2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)检测细胞对胰岛素的敏感性,并用RT-PCR法和Western印迹法分别检测各组细胞内的核转录因子-2(Nrf2)的m RNA及蛋白表达水平。结果与C组比较,M组ROS生成水平显著升高(P<0.01),摄取2-NBDG量显著降低(P<0.01);与M组比较,Can3组ROS生成水平显著减少(P<0.05),摄取2-NBDG量则显著增加(P<0.05)。M组Nrf2的m RNA及蛋白表达较C组显著降低(P<0.01),Can2组及Can3组Nrf2的m RNA及蛋白表达较M组显著升高(P<0.01或P<0.05)。结论 AngⅡ通过下调C2C12中Nrf2的m RNA及蛋白表达,抑制Nrf2的抗氧化效应,增加ROS生成,引起骨骼肌细胞胰岛素抵抗;而坎地沙坦通过抑制AngⅡ的这种作用改善骨骼肌胰岛素抵抗。     

犀角地黄汤合银翘散对流感病毒感染小鼠肺组织MLC磷酸化信号通路的影响

目的以流感病毒感染的小鼠为模型,检测犀角地黄汤合银翘(XDY)对小鼠肺组织中肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化信号通路的影响,以明确其抗病毒作用的分子机制。方法将50只雄性Balb/c小鼠按体重随机分为5组,每组10只,分别为正常组、病毒组和XDY低、中、高剂量给药组,除正常组小鼠外,其余组用A/FM/1/34(H1N1)病毒株滴鼻感染。1 h后,病毒组蒸馏纯水灌胃,2次/d;其余三组分别用低、中、高剂量的XDY灌胃,2次/d。感染后第4天摘眼球处死小鼠,RT-PCR检测各组小鼠肺组织中病毒RNA水平;Western bolt检测肺组织MLC、p-MLC、PKC、p-PKC、ROCK-1、ERM、p-ERM蛋白表达水平。结果与病毒组相比,XDY中剂量组病毒RNA含量显著降低,差异有统计学意义(P0.01),而高剂量组和低剂量组病毒RNA含量则无明显变化。XDY中剂量组Rho/ROCK、PKC以及p-MLC、p-ERM蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。与正常组相比,病毒组小鼠肺组织中ROCK1、PKC表达显著增加,p-MLC、p-ERM蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 XDY可通过抑制Rho/ROCK、PKC信号通路活化,抑制p-MLC蛋白表达,减少流感病毒在体内的复制,从而起到抗病毒作用。     

高糖环境下大鼠DRG神经元中PKCε和TRPV4 mRNA的表达

目的观察高糖环境对大鼠背根神经节(DRG)细胞瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(TRPV4)﹑蛋白激酶Cε(PKCε)mRNA表达的影响,明确高糖环境对以上2种受体的调控作用。方法急性分离新生大鼠DRG细胞,培养48 h后更换培养液并分组。按照培养基含糖量不同分为:对照组(5.5 mmol/L,C组)、高糖1组(17.5 mmol/L,H1组)、高糖2组(35.0 mmol/L,H2组)。换液后48 h提取细胞总RNA并进行逆转录。用RT-PCR及实时定量PCR检测TRPV4和PKCεmRNA表达的变化。结果与对照组比较,PKCεmRNA在H1组表达没有明显变化(P>0.05),而在H2组表达显著上调(P<0.05)。与对照组比较,TRPV4 mRNA在H1组表达显著上调(P<0.05),而在H2组表达没有明显变化(P>0.05)。结论高糖环境可以上调TRPV4/PKCε基因的表达,但是2种基因明显上调时糖浓度不一致,说明TRPV4的激活除了PKCε的调控外还受其它因素调节。     

复方丹参对缺血预适应大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响

目的　探讨复方丹参加强缺血预适应 ( IPC)的机制 ,是否通过促进蛋白激酶 C ( PKC)蛋白、m RNA水平表达发挥作用。方法　采用冠脉结扎大鼠 5 min缺血 ,5 min再灌反复循环 3次的缺血预适应方案 ,缺血 30 m in,再灌 2 h的缺血再灌模型 ,通过免疫组化、RT— PCR的方法观察 PKC蛋白、m RNA表达以及复方丹参对其影响。结果　 PKC在正常对照组中主要存在胞浆 ,但经过 IPC和使用复方丹参后 ,在胞膜和胞核也可见 ;不论早期 ,还是晚期 IPC组 PKC表达均高于假性预处理组 ,以早期 IPC组明显 ( P<0 .0 1) ;经复方丹参预处理后 ,PKC的表达均高于再灌组、早期、晚期 IPC组 ,以药物预处理 +缺血预处理组 ( DIPC)为优 ,显著高于早期 IPC组 ( P<0 .0 1)。PKCm RNA在正常心肌组织、再灌组、假性预处理组间无明显差异 ,但 IPC后不论早期 ,还是晚期 PKC m RNA表达均高于假性预处理组 ,晚期 IPC组表达更加明显 ;经复方丹参预处理后 ,可明显促进早、晚期 IPC及再灌组 PKC m R-NA的表达 ( P<0 .0 5 )。结论　复方丹参可激活 PKC,使其发生转位 ,促进其蛋白、m RNA表达水平增高。这可能是此方加强 IPC的主要机制之一     

瑞芬太尼诱导的SH-SY5Y细胞中PKCε与MOR相互作用的研究

目的 利用人神经母瘤细胞（SH-SY5Y）,探讨瑞芬太尼对蛋白激酶Cε(PKCε)和μ阿片受体（MOR）之间相互作用的影响以及PKCε对瑞芬太尼诱导MOR内化的调节作用。方法 设置对照组和瑞芬太尼处理组（R2 h组）,R2 h组采用10μmol/L瑞芬太尼处理SH-SY5Y细胞2 h。采用细胞免疫荧光观察MOR蛋白分布变化,免疫印迹检测MOR蛋白膜浆组分表达变化;细胞免疫荧光检测PKCε与MOR共定位情况,免疫共沉淀检测瑞芬太尼作用不同时间后PKCε与MOR相互作用变化;构建PKCε、MOR及PKCε截短蛋白的原核表达载体并诱导表达和纯化蛋白,采用pull-down实验检测两者直接相互作用情况。分别通过PKCε特异性激动剂和抑制剂预处理,观察激活或抑制PKCε后对瑞芬太尼诱导MOR内化的影响。结果 免疫荧光结果显示,与对照组比较,R2 h组MOR显著内化[（0.72±0.07）vs.(12.57±1.10)],差异有统计学意义（t=8.90,P<0.000 1）。免疫印迹结果显示,胞膜MOR蛋白显著减少,胞浆组分MOR蛋白增加。细胞免疫荧光共染显示,SH-SY5Y细胞中的PKCε...     

苦碟子注射液对缺氧损伤血管内皮细胞PKCδ/MARCKS通路的调节

目的观察苦碟子注射液对血管内皮细胞缺氧损伤后的保护作用,并初步研究PKCδ/MARCKS信号通路在血管内皮细胞缺氧损伤后的作用机制。方法建立CoCl_2诱导的人脐静脉血管内皮细胞缺氧损伤模型,分为正常组、模型组、苦碟子注射液组、PKCδ特异性抑制剂Rottlerin组。光镜下观察缺氧损伤24 h后各组细胞形态学改变,MTT比色法检测各组细胞的活力,免疫细胞化学法(IHC)及蛋白印迹法(Western Blot)检测各组细胞p-PKCδ、p-MARCKS蛋白质的分布与表达。结果苦碟子注射液、Rottlerin可显著减轻细胞缺氧损伤形态改变,苦碟子、Rottlerin可明显增强缺氧损伤后的细胞活力(P0.01)。与正常组相比,模型组p-PKCδ、p-MARCKS蛋白表达显著增加(P0.05),苦碟子、Rottlerin显著抑制p-PKCδ、p-MARCKS蛋白的表达(P0.05)。结论苦碟子注射液对缺氧诱导的血管内皮细胞损伤具有保护作用,其作用机制与下调PKCδ/MARCKS信号转导通路的活性有关。     

高浓度葡萄糖诱导大鼠肾小球系膜细胞VEGF的表达上调依赖于PKCβⅠ和RhoA的活化

目的:研究高浓度葡萄糖是否通过蛋白激酶C(PKC)βⅠ和RhoA信号通路介导大鼠肾小球系膜细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达上调。方法:体外培养SD大鼠肾小球系膜细胞,给予葡萄糖和各种抑制剂处理细胞,提取细胞蛋白,采用Western免疫印迹检测PKCβⅠ及RhoA蛋白的表达量变化,同时提取RNA,采用实时定量PCR观察VEGF mRNA浓度变化。结果:高浓度葡萄糖(30mmol/L)诱导肾小球系膜细胞VEGF mRNA表达增加,而甘露醇对照组VEGF mRNA表达水平未见明显改变(P>0.05)。高浓度葡萄糖刺激系膜细胞RhoA和PKCβⅠ发生活化,RhoA-GTP蛋白和胞膜PKCβⅠ蛋白均呈时间依赖性增加。使用Rho激酶特异性抑制剂(HA-1077)预处理细胞后,VEGF mRNA表达量与高糖组相比明显下调(P<0.05)。进一步使用广谱PKC抑制剂(PMA)、传统PKC抑制剂(G6976)以及PKCβ特异性抑制剂(LY333531)预处理细胞后,VEGF mRNA和RhoAGTP蛋白表达量与高糖组相比均受到抑制(P<0.05)。结论:高浓度葡萄糖可能通过间接活化PKCβⅠ来激活RhoA信号通路,从而上调系膜细胞VEGF的表达,该信号通路在糖尿病肾病的病理过程中发挥着重要作用。     

Corilagin对OX-LDL损伤的巨噬细胞中CRP表达的影响

目的 研究Corilagin对氧化型低密度脂蛋白 (oxidized low density lipoprotein, OX-LDL) 损伤的巨噬细胞中C反应蛋白 (C-reactive protein, CRP) 蛋白和m RNA表达的影响.方法 体外培养小鼠单核细胞源性巨噬细胞, 复制OX-LDL诱导损伤模型;Western Blot和RT-PCR方法分别观察Corilagin对巨噬细胞中CRP蛋白和m RNA表达的影响.结果 与正常对照组比较, OX-LDL损伤模型组的CRP/β-actin和2-△△Ct值明显增加 (P<0.05) ;与模型组比较, Corilagin 3.12550μmol/L组的CRP/β-actin和2-△△Ct值明显减少 (P<0.05) .结论 Corilagin能明显下调OX-LDL损伤的巨噬细胞中CRP蛋白及m RNA的表达.     

余甘子中没食子酸抑制高糖诱导胰岛β细胞凋亡

目的 探究余甘子中没食子酸对高糖诱导胰岛β细胞凋亡的保护作用, 为从中药中发现治疗糖尿病的天然化合物提供一定参考依据.方法 体内实验造模:以wistar雄性大鼠作为体内研究对象, 腹腔注射50mg/kg STZ, 造模成功后口服给予25 mg/kg的没食子酸, 阳性药选用西格列汀, 给药4周后, 取血、摘取胰腺, 进行HE染色, 采用Western blot法测定高糖状态下胰腺组织中NLRP3、TXNIP蛋白表达;体外实验造模:以胰岛瘤细胞株INS-1细胞作为体外研究对象, 建立高糖诱导细胞凋亡模型, 在无糖RPMI1640完全培养基中添加25mmol/L葡萄糖培养INS-1细胞, 以没食子酸为受试样品, 将实验分为正常对照、高糖模型、没食子酸低、中、高剂量组.采用MTT法测定细胞活性, 采用QPCR法、Western blot法测定高糖状态下INS-1细胞中NLRP3、TXNIP的m RNA表达, 检测NLRP3、TXNIP蛋白表达.结果 (1) INS-1细胞在葡萄糖浓度为25 mmol/L的培养基中培养48 h后, 与对照组比较, 凋亡率升高 (P<0.01) , 表明高糖状态下细胞凋亡模型建立成功. (2) 10、5、2.5μmol/L的GA分别处理对照组和高糖模型组细胞, 对照组细胞存活率没有明显变化 (P>0.05) .体内实验中与对照组比, 高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3、TXNIP的蛋白表达具有统计学差异 (P<0.05) ;GA处理后蛋白表达水平明显下调, 有统计学差异 (P<0.05) , 体外实验中与对照组比, 高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3的蛋白表达有统计学差异 (P<0.01) , GA处理后蛋白表达水平明显下调 (P<0.01) ;TXNIP的蛋白表达水平上调 (P<0.05) ;GA处理后蛋白表达水平明显下调 (P<0.05) ; (3) 与对照组比, 高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3、TXNIP m RNA表达水平均上调 (P<0.01) ;GA处理后蛋白表达水平明显下调 (P<0.01) .结论 将细胞置于添加25 mmol/L浓度葡萄糖的无糖RPMI1640完全培养基中培养48 h.GA对正常INS-1细胞增殖无影响, GA具有保护高糖状态下INS-1细胞凋亡的作用, 其机制可能与GA下调NLRP3、TXNIP的基因表达有关.     

SiRNA干扰慢性炎性痛大鼠患侧背根神经节MrgC表达及PKCε磷酸化的研究

目的：观察鞘内注射小干扰 RNA （ small interference RNA, siRNA ）对完全弗氏佐剂（ complete freund’s adjuvant, CFA）诱导的慢性炎性痛大鼠患侧背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）中MrgC（Mas-related G protein-coupled receptor C, MrgC） mRNA与蛋白表达的干扰作用,并观察该作用对大鼠患足痛阈及患侧DRG PKCε丝氨酸729点位磷酸化（ phosphorylation of PKCε Ser729, p-PKCε Ser729）水平的影响。方法健康雄性 SD （ Sprague-Dawley,SD）大鼠16只,随机分为对照siRNA组,MrgC siRNA组,每组8只。大鼠脊髓鞘内插管成功后,两组大鼠给予相应药物鞘内注射4 d,1次／d,5μg／d／只。给药第4 d,大鼠右后足底注射CFA 0.1 mL建立慢性炎性痛模型,此后隔日注射药物,直至给药第11 d处死。分别于鞘内置管前、给药前、给药4 d（ CFA造模0 h）、给药5 d （CFA造模24 h）、给药11 d（CFA造模7 d）5个时点检测大鼠患足机械缩腿阈（Paw withdrawal thresholds, PWTs）的变化。荧光定量PCR法检测患侧DRG MrgC的mRNA的表达,免疫荧光法检测患侧DRG MrgC表达量及p-PKCεSer729的含量。结果与给药4 d比较,给药5 d两组大鼠的PWTs均有显著的下降（ P＜0.01）;给药前后各时点,两组大鼠之间PWTs没有明显差异。观察给药11d时大鼠患侧L4-L6 DRG MrgC mRNA的表达,与对照siRNA组比较,MrgC siRNA组各神经节MrgC mRNA的表达均明显下降（P＜0.01）;观察大鼠给药11d时大鼠患侧L4-L6 DRG MrgC与p-PKCεSer729的表达,与对照siRNA组比较,MrgC siRNA组患侧DRG的MrgC阳性细胞率明显减少（ P＜0.01）,而p-PKCεSer729的阳性细胞率显著上升（P＜0.05）。结论 MrgC siRNA片段可有效干扰CFA慢性炎性痛大鼠患侧L4-L6 DRG MrgC mRNA与MrgC的表达,对MrgC的干扰作用能显著上调PKCεSer729磷酸化的水平,但不影响大鼠患足机械缩腿阈。     

黄芪多糖对高糖刺激小鼠肾小球足细胞Nephrin和Desmin表达的影响

目的 模拟体外高糖病理微环境, 探讨黄芪多糖对实验鼠肾脏肾小球足细胞Nephrin及Desmin表达的影响.方法 试验 (1) :将培养的实验鼠肾脏肾小球足细胞分为5个组, 分别是D-葡萄糖30 mmol/L+黄芪多糖干预组 (0.0 g/L, 0.1 g/L, 0.2 g/L, 0.4 g/L及0.8 g/L) ;干预时间为72 h, 筛选出黄芪多糖干预的最佳浓度点0.Z g/L.试验 (2) :将培养的实验鼠肾脏肾小球的足细胞分7个组, 分别是D-葡萄糖30 mmol/L+黄芪多糖的干预 (干预浓度是0.Z g/L) , 干预的时间分别是0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h及72 h;筛选出干预的最佳时间点Y h.试验 (3) :根据上述试验 (1) 、 (2) 结果, 将培养的小鼠肾小球足细胞分为:正常对照组、甘露醇高渗对照组、高糖组和黄芪多糖干预组 (黄芪多糖的干预浓度是0.Z g/L, 干预的时间是Y h) , 采用流式细胞术与实时聚合酶链反应 (real-Time Polymerase Chain Reaction, real-Time PCR) 分别检测七组足细胞Nephrin、Desmin蛋白与m RNA的表达.结果 随着黄芪多糖干预梯度浓度的递增, 实验鼠肾脏肾小球的足细胞Nephrin蛋白表达逐渐上调, Desmin蛋白表达逐渐下调, 呈浓度依赖性 (P<0.05) ;随着黄芪多糖干预时间的延长, 实验鼠肾脏肾小球的足细胞Nephrin的表达逐渐上调, 但肾小球的足细胞Desmin的表达逐渐下调, 呈时间依赖性.相比正常对照组和甘露醇高渗对照组, 高糖组小鼠肾小球足细胞Nephrin蛋白和m RNA表达均下降, Desmin蛋白和m RNA表达均增加 (P<<0.05) ;而相较高糖组, 黄芪多糖干预组Nephrin蛋白和m RNA表达明显上升, Desmin蛋白和m RNA表达明显降低 (P<0.05) .结论 在高糖刺激下, 黄芪多糖干预可上调肾小球足细胞Nephrin表达, 降低肾小球足细胞Desmin表达, 是黄芪治疗DN蛋白尿的可能作用靶点.     

糖尿病大鼠心肌细胞Caveolin-3与PKCβ_2蛋白表达及其相互作用关系

目的:研究糖尿病大鼠心肌细胞小窝蛋白(Caveolin-3,Cav-3)与蛋白激酶C(PKC)β2蛋白的变化并探寻两者的相互作用关系。方法:20只SD雄性大鼠[(250±10)g]随机分为正常对照组(Control)与糖尿病组(Diabetes),分离纯化心肌细胞。Western blot检测Cav-3,PKCβ2蛋白表达水平;免疫共沉淀、免疫荧光与共聚焦观察及Caveolins成分蛋白分析Cav-3与PKCβ2的相互作用关系。结果:与Control组比较,Diabetes组大鼠心肌细胞pPKCβ2表达水平增加而Cav-3表达水平降低。免疫共沉淀结果显示糖尿病促进PKCβ2与Cav-3形成蛋白复合体,免疫荧光与共聚焦观察发现高糖促使PKCβ2向Cav-3蛋白转位增加,进一步Caveolins成分蛋白分析发现PKCβ2共表达于Cav-3蛋白。结论:糖尿病心肌细胞PKCβ2活化水平增加及Cav-3表达水平降低,Cav-3可能参与了糖尿病心肌PKCβ2活化信号向下游分子的的转导。     

高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞c-myc和p21基因表达的影响

目的 :探讨高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞 c- myc和 p2 1基因表达的影响。方法 :体外培养的人腹膜间皮细胞经含 1.5 %、2 .5 %、4 .2 5 %葡萄糖的 M199培养基培养 2 4 h,以正常 M199培养基和含 4 .2 5 %甘露醇的 M199培养基为对照。应用半定量 RT- PCR检测 c- m yc、p2 1基因 m RNA表达。结果 :2 .5 %葡萄糖组、4 .2 5 %葡萄糖组间皮细胞 c- myc和 p2 1m RNA的表达量显著高于 1.5 %葡萄糖组、M199对照组及 4 .2 5 %甘露醇渗透压对照组 (P<0 .0 5 ) ;而 1.5 %葡萄糖组、M199对照组及 4 .2 5 %甘露醇渗透压对照组间间皮细胞 c- myc和 p2 1m RNA的表达量无显著差异 (P>0 .0 5 ) ,且葡萄糖浓度越高 ,c- myc和 p2 1m RNA表达量越高 (r=0 .96 8,0 .96 7,P<0 .0 1)。结论 :高浓度葡萄糖能上调 C- myc和 P2 1m RNA基因表达 ,这种作用与葡萄糖浓度呈正相关。     

人心房肌蛋白激酶C表达下调参与心房颤动发病机制

目的：研究心房颤动（atrial fibrillation, AF）时心房肌组织中PKCα、δ、ε、θ4种亚型mRNA和PKC总蛋白的表达变化,探讨PKC与AF发生发展的相关性。方法：泸州医学院附属医院行体外循环手术患者常规切除的右心耳组织作为研究对象。①实时定量PCR实验：提取人右心耳组织总RNA,β-actin为内参照基因,采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR技术检测SR和AF患者PKCα、δ、ε、θ基因mRNA水平。②western blotting实验：右心耳组织提取总蛋白,测定蛋白浓度,GAPDH作为内参照,SDS-PAGE电泳检测SR和AF患者PKC的蛋白表达变化。结果：①AF患者心房肌细胞PKCα和PKCδ亚基mRNA水平下调;PKCε和PKCθ亚基mRNA水平明显上调。②SR组与AF组PKC总蛋白相对表达量分别为1.37±0.09（n=23）、1.00±0.10（n=18）,（P〈0.05）有统计学意义。结论：与SR患者相比,AF患者心肌细胞中PKCα、δ亚基mRNA明显下调,PKCε、θ亚基mRNA上调,PKC总蛋白表达降低。 PKC亚型mRNA和总蛋白的表达变化可能是参与AF发生发展的分子基础之一。     

红景天苷对CoCl2诱导PC12细胞低氧损伤的保护作用

目的研究红景天苷（Sal）对Co Cl2诱导PC12细胞低氧损伤的影响。方法用200μM Co Cl2诱导PC12细胞致其损伤,用不同浓度的红景天苷（0.1、1、10μM）作用于PC12细胞,TUNEL染色法观察细胞凋亡情况;RT-q PCR法测定Arc m RNA的表达;Western blot法测定Arc蛋白的表达。结果不同浓度红景天苷能明显抑制Co Cl2诱导的PC12细胞凋亡,并能显著提高PC12细胞中Arc m RNA和蛋白表达水平。结论红景天苷对Co Cl2诱导的PC12细胞低氧损伤具有一定的保护作用,其机制可能与红景天苷抵抗Co Cl2诱导PC12细胞的凋亡,上调PC12细胞Arc m RNA和蛋白表达水平有关。     

沉默 Fas和 PKCδ表达对游离脂肪酸诱导的 HUVEC 凋亡的影响

目的：探讨Fas与PKCδ在游离脂肪酸（ FFA）诱导的人脐静脉内皮细胞（ HUVEC）凋亡中的作用。方法：①取对数生长期HUVEC,分为空白组,对照组,50、75、100μmol／L FFA组及相应FFA＋PKCδsiRNA转染组,采用比色法检测细胞增殖情况,Western blot检测p-PKCδ蛋白的表达。②将HUVEC分为空白组,对照组,FFA组（100μmol／L FFA处理）和FFA＋PKCδsiRNA组,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。③取100μmol／L FFA干预后的HUVEC分别转染无关序列siRNA和Fas siRNA,以未转染细胞作空白对照,Western blot法检测p-PKCδ和Fas蛋白的表达。结果：①各组细胞增殖水平差异有统计学意义（F＝20．863,P＜0．001）,FFA可抑制细胞增殖（P＜0．05）,而PKCδ siRNA能减弱FFA对细胞增殖的抑制（P＜0．05）。各组细胞p-PKCδ蛋白的表达差异有统计学意义（F＝229．072,P＜0．001）,FFA能提高p-PKCδ蛋白的表达水平（P＜0．05）,而PKCδ siRNA可抑制FFA引起p-PKCδ蛋白的表达（P＜0．05）。②各组细胞凋亡率差异有统计学意义（F＝86．973,P＜0．001）,FFA可增加细胞凋亡（P＜0．05）,而PKCδ siR-NA能降低FFA所致的凋亡（P＜0．05）。③各组细胞Fas蛋白表达差异有统计学意义（F＝122．162,P＜0．001）,Fas siRNA可减低HUVECFas蛋白的表达（P＜0．05）。结论：FFA诱导的HUVEC凋亡可能由PKCδ涉及的Fas通路介导。     

大肠癌多药耐药细胞蛋白激酶C的表达及作用

目的:检测电离辐射作用后大肠癌多药耐药细胞蛋白激酶C(PKC)的表达和观察蛋白激酶C在多药耐药发生发展中的作用。方法：对大肠癌HCG-8多药耐药细胞照射,照射后用间接免疫荧光技术,采用流式细胞仪检测 X射线对HCG-8细胞PKC表达的影响。结果：与假照组相比,2 Gy大剂量照射后PKC阳性细胞百分率明显增加(P<0.05),先给予低剂量照射(50和100 mGy),再给予大剂量照射,PKC阳性细胞百分率增加不明显,200 mGy+2 Gy组PKC阳性细胞百分率明显增加(P<0.05)。与单纯2 Gy大剂量照射组比较,100 mGy+2 Gy组PKC阳性细胞百分率明显降低(P<0.05)。结论：大剂量辐射可使大肠癌细胞PKC蛋白表达明显增加,而预先给予低剂量辐射后再给予大剂量辐射可使大剂量辐射增强PKC蛋白表达作用不明显。