骨髓造血干细胞分离 保存的研究

目的探讨骨髓造血干细胞分离及保存的方法。方法应用羟乙基淀粉(HES)或percoll液分离骨髓造血干细胞;联合应用二甲基亚砜(DMSO)和HES对造血干细胞进行液氮保存。应用血细胞计数法、锥虫蓝拒染实验、粒-巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)的体外培养等方法对造血干细胞冷冻前后的有核细胞(NC)数、存活率、体外分化能力进行检测;应用流式分析法计数CD34+细胞数。结果利用HES沉降法分离的单个核细胞数、CD34+细胞数、CFU-GM集落数均比percoll液离心法明显增多;骨髓造血干细胞冷冻保存1年后的有核细胞数、CD34+细胞数、锥虫蓝活率、CFU-GM集落计数与保存前差异无统计学意义。结论HES法分离骨髓造血干细胞方法安全、有效;通过程序降温,联合使用DMSO及HES的低温冻存方法对骨髓造血干细胞的长期保存是适合的。     

不同冻存条件对细胞因子诱导的杀伤细胞的细胞表型及杀伤活性的影响

目的 探讨不同冻存条件下细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞表型的变化及对K562细胞杀伤活性的影响.方法 收集培养12 d的CIK细胞,分别冻存于-80℃冰箱及液氮中,于冻存后4、12、24周复苏,通过流式细胞仪检测CIK细胞表型变化,CCK-8法测定其对K562细胞的杀伤活性,并与未冻存CIK细胞进行比较.结果 液氮冻存4、12、24周及-80℃冻存4周后复苏培养的CIK细胞增殖、细胞存活率、免疫细胞表型及对K562的杀伤活性与未冻存组比较差异无统计学意义(P＞0.05).-80℃冻存12周及24后复苏培养的CIK细胞与未冻存组比较,细胞增殖明显抑制,细胞存活率低,CD3+、CD3 +/CD4+、CD3 +/CD8+、CD3 +/CD56+细胞比例显著降低,对K562细胞杀伤活性显著抑制(P＜0.05).结论 临床治疗中CIK细胞应尽量冻存于液氮中,如冻存于-80℃时冻存时间应≤4周.     

二甲基亚砜与羟乙基淀粉联合冷冻保护外周造血干细胞的效果

目的研究并总结二甲基亚砜与羟乙基淀粉联合冷冻保护外周造血干细胞的效果。方法使用二甲基亚砜和羟乙基淀粉作为外周造血干细胞冷冻保护剂,将外周造血干细胞直接降温至-80℃存放。存放两周后,将外周造血干细胞解冻,植入患者体内。统计单个核细胞回收率以及台盼蓝拒染率。结果回收到细胞(4.00±0.69)×10~9/kg,解冻后细胞回收率89.23%,解冻后台盼蓝拒染细胞比例为89.45%。解冻后外周造血干细胞输入患者体内后(10.83±1.55)d,所有研究对象体内中性粒细胞绝对值升至0.5×10~9/L及以上。结论外周造血干细胞直接冷冻应用二甲基亚砜和羟乙基淀粉联合作为冷冻保护剂,细胞回收率高、细胞存活率高,体内能够短时间内恢复活性。     

氨磷汀与峰龄多糖对外周血造血干细胞的刺激增殖及协同作用

目的研究氨磷汀(WR-2721)和峰龄多糖(FLPS)对人外周血造血干/祖细胞的刺激增殖及协同作用.方法分离单个核细胞(MNC),进行甲基纤维素半固体培养,观察氨磷汀和峰龄多糖对骨髓粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)的作用.结果经0.01～5.0 mmol/L氨磷汀37℃作用30分钟的MNC以及峰龄多糖0.5～25μg/ml时CFU-GM集落数均显著高于对照组(P＜0.05),且集落较大.CFU-GM平均集落数在对照组、WR-2721(1 mmol/L)组、FLPS(5μg/ml)组和AMF+FLPS组每105MNC分别为91.4±50.4、119.8±62.9、143.2±76.4和179.2±97.6,各组与对照组相比,差异有显著性(P＜0.05);AMF+FLPS组CFU-GM集落数显著高于AMF和FLPS组(P＜0.01和＜0.05).结论氨磷汀和峰龄多糖对CFU-GM具有明显的刺激增殖及协同作用.     

六种重组细胞因子对人骨髓造血细胞的体外扩增效应

目的 :观察造血生长因子对骨髓CD34 +细胞的扩增效应及扩增细胞的分化特性。方法 :采用重组人白细胞介素 (rhIL) 1 +rhIL 3+rhIL6 +重组人粒细胞集落刺激因子 +重组人粒 巨噬细胞集落刺激因子和重组人干细胞因子对人骨髓单个核细胞 (MNC)进行刺激 ,动态观察了经上述细胞因子作用后MNC的增殖效应及液态扩增培养后粒 巨噬集落形成率 (CFU GM ) ,利用流式细胞技术 (FACS)分析了扩增前后CD34 +细胞及其亚群的动态变化。结果 :经上述 6种细胞因子作用 2 4d ,骨髓MNC总数是原代MNC的 38.33倍 ,液态扩增 1 0d后 ,CFU GM的数量达高峰 ,是原代MNC的 1 9.0 4倍 ,2 4d时CFU GM总数降至 3.94倍 ,且集落明显小于扩增初期。扩增至 6～ 1 0d ,CD34 +细胞总数是原代MNC的 1 36 .40～ 90 .40倍 ,1 9d时降为 6 1 .40倍。结论 :外源性造血生长因子对CD34 +骨髓细胞具有较强的扩增效应 ,选择适宜的扩增时间是保证骨髓移植后尽快重建造血功能的重要环节。     

利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞的初步研究

目的 利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞.方法 利用非整合型载体,将四个转录因子:Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc导入脐血来源的造血干/祖细胞(CD34+细胞)重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs),再利用与小鼠骨髓基质细胞OP9共培养法将其定向分化成CD34+造血干/祖细胞.借助iPSCs可以在体外无限传代、大量扩增的特点,实现体外保存及大量扩增造血干/祖细胞的目的.结果 脐血CD34+细胞可以在体外重编程为非整合型iPSCs,并能够高效定向分化成为CD34+细胞,其分化效率比胚胎干细胞(ESCs)有显著提高.结论 利用诱导性多能干细胞技术体外大量扩增脐血造血干/祖细胞是一个可行的方案,具有良好的应用前景.     

人脐血CD34+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题

目的通过细胞形态学观察以及计数法对分离得到的脐血CD34+造血干细胞进行研究,掌握脐血CD34+造血干细胞的生长规律和体外培养方法。方法采用Isolex50免疫磁珠法分离纯化脐血CD34+造血干细胞。在体外扩增培养中,将细胞因子SCF、IL-3、IL-6、G-CSF、EPO组合成不同实验组进行诱导,以检测单个核细胞数和集落形成单位(CFU)的形成率来找到细胞培养较好的细胞因子组合。结果本研究中使用细胞因子的细胞培养孔的单个核细胞数明显大于无细胞因子的细胞培养孔,使用此5种细胞因子联合对脐带造血干细胞培养效果最好。结论研究结果表明,不同的细胞生长因子组合会对培养CD34+造血干细胞产生不同的作用效果,对单个核细胞的增殖与扩增有明显的促进作用。     

人成纤维样滑膜细胞冻存时间对其活性的影响

目的探讨适合人成纤维样滑膜细胞(FLS)低温冷藏保存的最佳冻存时间。方法将FLS经-80℃冰箱冷冻保存。在冷冻后2、3、4、5wk分别复苏,培养。观察FLS的生长情况和细胞存活率及24h贴壁率。结果冻存5wk的FLS细胞存活率(66±1.3)%,较冻存2wk(90±2.0)%有明显下降;冻存5wk的FLS24h贴壁率(61.3±2)%,与冻存2wk(85.9±3)%比较有明显下降;未冻存和冻存2wk复苏后FLS的增殖能力无明显差异。结论FLS可以进行低温冷冻,冻存时间4wk为宜。     

树突状细胞前体细胞亚群四色荧光分析方法探讨

目的建立树突状细胞(DC)前体细胞(pDC)亚群四色荧光检测方法,探讨以Lin-人类白细胞抗原(HLA)-DR+细胞群和以CD34-Lin-HLA-DR+细胞群设门检测不同来源标本pDC亚群的适用性。方法以Lin-HLA-DR+细胞群和以CD34-Lin-HLA-DR+细胞群设门分别检测健康成人外周血、脐带血、骨髓、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员外周血pDC亚群各15例,比较两种设门方法的pDC检测结果。结果以该两种方法设门,pDC1/pDC2比值:外周血=脐带血>骨髓>G-CSF动员外周血;对同一种标本,两种设门方法之间比较,pDC1/pDC2比值差异无统计学意义;外周血CD34-Lin-HLA-DR+/单个核细胞(MNC)与Lin-HLA-DR+/MNC比值、pDC/CD34-Lin-HLA-DR+比值与pDC/Lin-HLA-DR+比值差异无统计学意义;而脐带血、骨髓、G-CSF动员外周血的CD34-Lin-HLA-DR+/MNC比值均显著性低于Lin-HLA-DR+/MNC比值,pDC/CD34-Lin-HLA-DR+比值显著性高于pDC/Lin-HLA-DR+比值。结论检测pDC亚群,对一般外周血标本,以Lin-HLA-DR+细胞群设门或以CD34-Lin-HLA-DR+细胞群设门,均可取得理想结果;对CD34+细胞含量相对丰富的脐带血、骨髓、G-CSF动员外周血等的标本,以CD34-Lin-HLA-DR+细胞群设门能明显优化检测结果。     

低温冻存对人牙周膜干细胞生物学特性的影响

目的观察超低温冻存对人牙周膜干细胞(PDLSCs)生物学特性的影响。方法体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限元稀释法筛选PDLSCs。将第3代人PDLSCs经液氮冻存半年后复苏,测其存活率,检测细胞免疫表型,对PDLSCs进行成骨诱导,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及体外矿化能力,观察超低温冻存对PDLSCs生物学特性的影响。结果第3代人PDLSCs冻存、复苏前后两组细胞在细胞形态、生长过程、免疫表型、成骨分化能力等方面均无显著性差异(P>0.05)。结论超低温冻存对人PDLSCs活性、增殖、细胞免疫表型及成骨分化能力没有明显影响。     

实体瘤自体造血干细胞动员不佳患儿应用普乐沙福的经验分享

目的 分析普乐沙福对实体瘤自体造血干细胞动员不佳患儿的作用及安全性。方法 回顾性分析5例实体瘤造血干细胞动员不佳患儿的临床资料,所有患儿均应用普乐沙福自体造血干细胞动员,分析干细胞动员血象变化、采集结果及不良反应发生情况。结果 外周血(PB) CD34⁺细胞计数<10 cells/μl及第1天采集物CD34⁺细胞计数<1.5×10⁶/kg时及时加用普乐沙福;加用普乐沙福后1例采集1次,1例采集2次,3例采集3次。5例患儿中3例采集成功。未出现乏力、失眠、腹痛、腹泻、头晕、关节痛等不良反应。3例患儿已行自体干细胞移植,粒细胞及血小板均植入。结论 外周血CD34⁺细胞计数<10 cells/μl及第1天采集物CD34⁺细胞计数<1.5×10⁶/kg时加用普乐沙福获得采集成功普乐沙福用于实体瘤动员不佳患儿自体造血干细胞动员,不良反应少,耐受性好。     

两种rhG-CSF制剂用于自体外周造血干细胞移植的效果比较

目的探讨两种重组人粒细胞集落刺激因子吉赛欣(国产rhG-CSF)和惠尔血(进口rhG-CSF)在外周造血干细胞(PBSC)动员及移植后造血恢复中的效能差异。方法选择2000-01～2003-05在本院进行自体外周造血干细胞动员的47例血液肿瘤患者,随机分为两组,在化疗后白细胞降至最低点时分别接受国产rhG-CSF和进口rhG-CSF进行干细胞动员,比较rhG-CSF使用时间及采集所得CD34+细胞数量,其中接受干细胞回输的41例再随机分组,在预处理和干细胞回输后,外周WBC达到0×109/L时分别接受两种rhG-CSF促进造血恢复,比较外周血中性粒细胞绝对计数(ANC)恢复至≥1.5×109/L的天数及rhG-CSF使用时间。结果47例进行干细胞动员的患者中,24例应用进口rhG-CSF,23例应用国产rhG-CS,使用时间分别为6.17±2.64d和5.78±1.83d,所得采集物CD34+细胞总数分别为(5.90±5.06)×106/kg体重和(5.13±6.07)×106/kg体重,两者比较无显著性差异。41例接受自体干细胞回输的患者,22例应用进口rhG-CSF,19例应用国产rhG-CSF,使用时间分别为10.86±2.41d和10.83±4.75d,ANC恢复至≥1.5×109/L的时间分别为9.07±1.50d和10.00±4.20d,两者比较亦无显著性差异。结论两种rhG-CSF制剂在PBSC动员、PBSC回输后造血恢复等方面无明显差异,均可供临床上选择使用。     

基于AO/PI荧光染色原理的杀伤细胞数量及活率检测方法学验证和细胞培养、冻存、复苏稳定性研究

目的 验证基于吖啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)荧光染色原理的自动细胞分析仪检测细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)数量及活率的可行性,并对 CIK 细胞培养全过程及冻存复苏后至使用前过程进行检测,建立相应的数量及活率标准。方法 采集健康供者的外周血分离、培养 CIK 细胞,取培养过程中的细胞使用 AO/PI 荧光染色法、应用自动细胞分析仪检测细胞数量及活率,对结果的专属性、准确度、精密度、数量线性及范围、活率线性及范围进行验证。应用建立的方法对外周血分离后的外周血单个核细胞(PBMC)、培养过程中、冻存前及复苏后的 CIK 细胞数量及活率进行全过程检测。结果 专属性、准确度、精密度、数量线性及范围、活率线性及范围验证均符合预期要求。CIK 细胞培养全过程活率均不低于 80%,样本平均倍增时间为(42.26±1.17)h。冻存前的 CIK 细胞在加入含 5% DMSO 的冷冻保护剂后 90 min 内活率稳定,复苏后未经稀释或洗涤处理 120 min 内活率稳定,复苏后经洗涤去除 DMSO 处理后 12 h 内活率稳定。结论 基于AO/PI荧光染色原理的自动细胞分析仪可以用于检测 CIK 细胞的数量及活率,其结果可以用于细胞放行评价及稳定性研究。     

紫杉醇(泰素)动员外周血干细胞的临床研究

目的:研究紫杉醇(TXL)联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在恶性实体瘤患者动员外周血干细胞(PBSC)的效率和安全性。方法:10例恶性实体瘤患者入组,第1d给予化疗动员TXL175mg7m2～190mg7m2,在白细胞1.0×1097L左右时联合rhG-CSF5mg7Kg动员,分早晚2次皮下注射至采集结束,血细胞分离机分离外周血单核细胞(MNC),每日采集1次,共2次,流式细胞仪检测CD34+细胞占白细胞的百分率。结果:在给予化疗TXL中位8d后白细胞降至1.0×1097L左右,皮下注射G-CSF中位4d,即化疗动员TXL中位12d后进行外周血造血干细胞采集,共采集20次。TXL动员获MNC6.12×1087Kg,CD34+细胞中位数7.05×1067Kg(1.89～11.84×1067Kg)。单次采集获得CD34+细胞大于2.0×1067Kg占总采集次70%;占总例数90%。所有患者均能耐受动员、采集全过程,相关不良反应较轻,经对症处理后均缓解。结论:TXL联合G-CSF是恶性实体瘤患者动员采集自体干细胞的有效安全方案。     

异基因外周血造血干细胞移植治疗骨髓增生异常综合征转化的急性髓细胞白血病1例及文献复习

目的探讨异基因外周血造血干细胞移植(强行移植)治疗原发耐药的急性髓细胞白血病(由骨髓增生异常综合征转化)的可行性。方法患者,女,16岁,供者为其胞弟,HLA配型全相合。预处理方案:改良BuCy。移植单个核细胞(MNC)6.22×108/kg(受者),CD34+占6.1%。结果移植后+14d粒系植入,+21巨核系植入。+30d染色体转为46,XY。移植后合并肺炎克雷伯杆菌败血症。无急慢性移植物抗宿主病发生。随访14个月,患者获得无病生存,生活质量良好。结论对于原发耐药的急性髓细胞白血病(由骨髓增生异常综合征转化),如有合适供者,宜尽早行造血干细胞移植。     

造血干细胞移植预处理对人骨髓间充质干细胞的影响

目的研究造血干细胞移植前的预处理对白血病患者骨髓间充质干细胞(MSC)的影响.方法MSC克隆培养集落形成单位(CFU-F),检测19例移植后、15例缓解期白血病患者和12例正常人骨髓中的MSC数量;流式细胞术测定MSC细胞的免疫表型,性染色体的间期FISH,测定患者移植后MSC的来源.结果MSC免疫表型为CD34-、CD45-、CD105+、CD19-、CD13+、CD14-.骨髓CFU-F 12例正常人为(35.9±16.5)/1×106单个核细胞(MNC);15例白血病患者为(30.6±17.45)1×106MNC;19例移植术后者为(4.6±4.2)/1×106 MNC,明显少于前两组(P＜0.001).间期FISH结果表明异基因骨髓移植后患者骨髓中99%以上骨髓细胞为供体来源,而MSC仍为患者受体自身的.结论骨髓移植前的预处理对骨髓MSC有损伤作用.     

血液肿瘤自体造血干细胞移植后患者的DC/CIK培养及临床应用安全性观察

目的采用自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者的外周血单个核细胞,经体外培养扩增出树突状细胞(dendritic cell DC)/细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell CIK),应用DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解血液肿瘤患者,观察其不良反应。方法采集10例血液肿瘤自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞,在体外经GM-CSF、IL-4、TNF-α等诱导产生DC,经IFN-γ、抗CD3单抗、IL-2等诱导产生CIK,观察其细胞形态及临床应用的不良反应并分析其细胞免疫表型。结果培养产生形态学典型的DC/CIK。诱导成熟的DC经流式细胞仪分析显示CD80、CD83、CD86、CD1a等阳性细胞比率大幅上升。CIK随着培养时间的延长,CD3+CD56+、CD3+CD8+双阳性细胞的比率亦大幅度上升。在DC/CIK细胞免疫治疗过程中,3例患者DC注射部位出现轻微疼痛,可自行缓解。2例患者输注CIK后出现低热,持续时间2～6h,可自行消退。4例患者输注完CIK后出现乏力,约2h可自行缓解。结论自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞对DC/CIK的培养不受影响。DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者,安全性好,不良反应少。     

结肠癌SW480细胞冻存与复苏方法的改进

目的：探索一种程序简洁、易于操作的细胞株冻存与复苏的方法。方法采用常规方法体外培养肠癌细胞株SW480,胰酶消化后,收集细胞悬液,A组细胞采用传统冻存与复苏方法,B组采用改良的冻存与复苏方法,分别于2周、3个月、6个月后立即复苏冻存细胞进行培养,观察细胞的存活情况,并于1周内不同时间点用MTT法检测细胞增殖情况并进行比较。结果采用改良方法冻存与复苏的SW480细胞存活率及生长曲线与传统方法比较无显著差异,细胞贴壁率、形态学特点及增殖能力无明显变化。结论改良的细胞冻存体系以及快速复苏法是细胞株冻存与复苏的一种可行方法,且更加方便快捷。     

自体外周血造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮9例临床疗效探讨

目的 :探讨自体外周血造血干细胞移植 (Autologousperipheralbloodstemcellstransplantation ,ABSCT)治疗系统性红斑狼疮 (SLE)的临床效果。方法 :选择 9例SLE患者 ,应用BaxterCS - 30 0 0plus连续血流式血细胞分离机进行自体外周血造血干细胞采集。预处理方案 :分次全淋巴照射 (TLI) 12 - 16Gy ,环磷酰胺 5 0mg/kg(- 3,- 2 ,- 1d) ,ATG 10mg/kg(+1,2d)。外周血干细胞动员 :环磷酰胺 2 0 0 0mg/m2 ,G -CSF 5ug/kg/d。结果 :造血干细胞采集量 :MNC 3.32× 10 9/Kg(2 .6 7- 4.2 8) ,患者造血功能重建迅速 ,免疫重建特征为CD4 ,CD19细胞减低 ,CD8,CD16+ 56细胞升高。随访 8例完全缓解 ,1例部分缓解 ,未发生移植相关的严重并发症。结论 :ABSCT治疗SLE近期临床疗效显著 ,远期疗效尚须进一步探讨。疗效机理可能与预处理后组织中免疫病理细胞的减少 ,免疫球蛋白降低 ,自身抗体量的下降有关。     

化疗联合G-CSF动员恶性血液病患者外周血造血干细胞

目的　探讨恶性血液病患者使用化疗联合造血生长因子进行自体外周血造血干细胞动员的效果及影响因素。方法　 19例恶性血液病患者采用化疗联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhG CSF)进行外周血造血干细胞动员和采集 ,检测采集物中有核细胞及CD34+ 细胞数量。结果　 19例共采集 5 6次 ,化疗结束至采集开始平均 11 5 (6～ 19)天。获有核细胞数平均 4 0 0 (1 6 4～ 6 4 6 )×10 8/kg ;CD34+ 细胞数平均 6 78(0 0 5～ 2 3 33)× 10 6/kg。CD34+ 细胞≥ 2 5× 10 6/kg的比率为 78 9%(15 /19,95 %可信区间为 5 4 %～ 96 % ) ;CD34+ 细胞≥ 5 0× 10 6/kg的比率为 5 2 6 % (10 /19,95 %可信区间为 2 9%～ 76 % )。仅 3例 (15 79% ,95 %可信区间为 3%～ 4 0 % )CD34+ 细胞 <2 0× 10 6/kg。CD34+细胞产率与病程、动员前化疗次数、Drake化疗积分、动员前外周血白细胞计数相关 ,而与年龄、疾病状态等因素无明显相关性。动员效果也与化疗后外周血白细胞计数恢复时间相关。结论　化疗联合rhG CSF方案应用在大多数血液系恶性肿瘤患者中可获得足够的干祖细胞。对于动员病程长、化疗次数多、Drake化疗积分高、白细胞减少的患者动员效果不良。