蛋白激酶C在缺氧人RPE细胞表达血管内皮生长因子中的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)信号转导通路在缺氧诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达中的作用。方法在细胞培养液内加入CoCl2溶液以模拟缺氧环境,培养RPE细胞0·5、48h后,用免疫荧光法检测人RPE细胞内PKC的表达。将PKC激动剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸(PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液,在缺氧状态下分别培养6、12、24h后,用ELISA检测各组RPE细胞中VEGF的表达。对照组为常氧状态下培养的RPE细胞。结果免疫荧光染色显示缺氧及常氧状态下,RPE细胞浆及胞核内均有PKC的表达。PKC激动剂PMA可增强缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达,而PKC抑制剂Chelerythrine可减弱缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达。结论缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。     

曲安奈德对高糖培养RPE细胞ICAM-1和ILK表达的影响

目的 检测高糖诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和整合素连接激酶(integrin-)linked kinase,ILK)的表达,并观察曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)时二者表达的影响,探讨炎症在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)发病过程中的作用.方法 体外培养人RPE细胞,应用免疫荧光细胞染色法、Western-blot法,分别检测在低糖对照组(5.6 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)、高糖组(30.0 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)、TA组(0.1 mol·L-1TA+30.0 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)RPE细胞ILK和ICAM-1蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测二者mRNA的表达.结果 Western-blot和免疫荧光细胞染色都显示RPE细胞在高糖组培养6 h时ICAM-1表达量最高,为0.378±0.012,是对照组0.220±0.008的1.71倍,TA对其表达有抑制作用,抑制率为26.98%(P＜0.05);高糖组作用2 h ILK蛋白表达量最高,是对照组的1.45倍,TA组中虽然ILK表达量较高糖组减少(为高糖组的76.20%),但差异无统计学意义(P＞0.05),TA对其表达无明显抑制作用.而实时荧光定量PCR检测显示在在高糖组作用1 h后RPE细胞表达ICAM-1、ILK mRNA开始上升,ICAM-1 mRNA表达在2 h达到高峰,2 h时TA对高糖组ICAM-1 mRNA的抑制率为83.67%,差异具有统计学意义(P＜0.05).TA组ILK mRNA的表达与高糖组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RPE细胞在高糖环境下能高表达ICAM-1和ILK,高糖对RPE细胞表达ICAM-1的上调作用能被糖皮质激素TA抑制,而ILK的上调不受其抑制,提示炎症在早期DR病理过程中有重要作用,RPE细胞可能通过这两种因子的信号途径参与DR的病变.     

葛根素抑制缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞低氧诱导因子-1α表达

目的研究葛根素缺氧状态下对人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelial,RPE)细胞分泌低氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactor1α,HIF1α)的抑制作用。方法用100μmol·L-1CoCl2模拟缺氧环境,不同浓度(0g·L-1、0.01g·L-1、0.1g·L-1、1g·L-1)葛根素作用于RPE细胞24h。用免疫组织化学法和Westernblot分析法检测RPE细胞中HIF1α的表达,并以计算机图像分析仪进行分析。结果不同浓度葛根素作用于100μmol·L-1CoCl2刺激的RPE细胞24h。免疫组织化学法检测显示,与对照组比较,0.01g·L-1以上浓度葛根素均能显著抑制CoCl2诱导的RPE细胞HIF1α的表达,其中0.01g·L-1葛根素使HIF1α的表达降低了12.67%,0.1g·L-1葛根素则降低了39.83%,1g·L-1葛根素则达到53.93%.Westernblot分析显示,与CoCl2组比较,3种不同浓度的葛根素不同程度地抑制HIF1α的表达,随着葛根素浓度的增加,HIF1α免疫印迹带逐渐减弱,0.01g·L-1葛根素使HIF1α的表达降低了12.45%,0.1g·L-1葛根素则降低了39.21%,1g·L-1葛根素则达到53.61%.结论葛根素可显著抑制缺氧状态下RPE细胞HIF1α的表达,提示抑制HIF1α的表达可能是抑制缺血性视网膜病变新生血管形成的新策略,葛根素有望用于缺血性视网膜病变药物治疗的研究。     

基质细胞衍生因子-1α对牛视网膜血管内皮细胞CXCR-4和VEGF表达的影响

目的 观察基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)对体外培养的牛视网膜血管内皮细胞(bo-vine retinal vascular endothelial cells,BRVEC)表达趋化性细胞因子受体-4(chemotaxis cytokine receptor-4,CXCR-4)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响,探讨SDF-1α对BRVEC作用的机制.方法 取第3-7代选择性培养的BRVEC悬液接种于12孔培养板,常规培养条件下分别用不同浓度的糖和不同浓度的SDF-1α及糖+SDF-1α干预,收集上清液ELISA检测VEGF的表达,收集细胞Western blotting检测CXCR-4的表达.结果 正常浓度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)对BRVEC表达VEGF和CXCR-4均无影响,高糖(25.0 mmol·L-1)增强BRVEC表达CXCR-4和VEGF,并呈时间依赖性.SDF-1α促进BRVEC表达VEGF和CXCR-4,并呈剂量和时间依赖性,SDF-1α的作用在100 μg·L-1达高峰,CXCR-4表达增加水平较VEGF明显.高糖联合SDF-1α培养时VEGF和CXCR-4的表达在48 h达高峰,分别为(230.17±19.74)ng·L-1、(0.96±0.12)ng·L-1,均显著高于SDF-1α单独培养时,差异均有统计学意义(P均<0.05),高糖+SDF-1α干预时,二者协同促进BRVEC表达VEGF和CXCR-4,且CXCR-4表达增加水平较VEGF明显.结论 高糖和SDF-1α均能刺激BRVEC表达CXCR-4和VEGF,并且具有协同作用.     

白细胞介素-1β对视网膜色素上皮细胞产生白细胞介素-6的影响

目的观察重组人白细胞介素1β(interleukin1β,IL1β)对培养的视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelial,RPE)细胞产生白细胞介素6(interleukin6,IL6)的影响。方法在人RPE细胞的培养液中分别加入终浓度为0μg·L-1、10μg·L-1、50μg·L-1、100μg·L-1、200μg·L-1的重组人IL1β,作用12h、24h、48h后,用酶联免疫吸附实验测定细胞上清液中IL6的质量浓度。结果50μg·L-1IL1β作用于RPE细胞48h内,RPE细胞产生IL6的量随时间延长而增加;在同一作用时间点,RPE细胞产生IL6的量随IL1β浓度的增高而增高。与对照组相比,当IL1β浓度达10μg·L-1时,二者之间即出现显著性差异(P<0.05),当IL1β浓度达100μg·L-1时,RPE细胞产生IL6的量呈平台高峰,不再升高,24h和48h组均有相同趋势。结论重组人IL1β促人RPE细胞分泌IL6在48h内具有时间和浓度依赖性。     

金雀异黄素对高糖诱导的人RPE细胞损伤的保护作用

目的 探讨金雀异黄素(genistein,Gen)对高糖诱导的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的保护作用.方法 培养人RPE细胞,分别以Gen 0 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1的药物浓度作用高糖(33 mmol·L-1)培养的RPE细胞48 h,噻唑蓝比色法检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性.结果 高糖组细胞活力(0.308±0.022)明显低于正常对照组(0.424±0.014)(P＜0.01);高糖 Gen组细胞活力较高糖组升高(P＜0.05),且随Gen浓度增大,细胞活力增加更明显.与正常对照组比较,高糖组细胞增殖受到抑制,被阻滞于S期和G2期;与高糖组比较,Gen可减轻高糖对细胞增殖的抑制作用.与正常对照组比较,高糖组细胞内ROS的产生明显增多;Gen以浓度依赖方式抑制高糖组RPE细胞内ROS的产生.与正常对照组(31.04±0.02)比较,高糖组SOD活性(12.32±0.02)显著降低(P＜0.01);与高糖组比较,高糖 Gen组SOD活性随Gen浓度的增加而升高(均P＜0.05).结论 Gen可保护和修复高糖诱导的人RPE细胞的损伤,其作用可能与抗氧化、增强SOD活性有关.     

白细胞介素-1β促人视网膜色素上皮细胞分泌血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的研究

目的 观察炎前因子白细胞介素-1β(IL-1β)对培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响.方法 采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定IL-β浓度为0、1、10、20 ng/ml和时间为24、36、48 h作用下RPE细胞的VEGF和bFGF分泌量变化;采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定10 ng/ml IL-1β作用48 h后RPE细胞的VEGF和bFGFmRNA变化;噻唑蓝(MTT)比色法测定IL-1β刺激后RPE细胞的增生状态.结果 相同刺激时间即36 h作用下,终浓度为1、10 ng/ml的IL-1β促进RPE细胞VEGF的分泌(q=32.79,42.56;P<0.01);10 ng/ml的IL-1β促进bFGF的分泌(q=7.514,P<0.01);与浓度为10 ng/ml的IL-1β刺激相比,增加IL-1β刺激浓度至20 ng/ml使RPE细胞VEGF和bFGF分泌量下降(q=9.35,6.92;P<0.01).相同浓度即10 ng/ml的IL-1β作用下,IL-1β作用时间与RPE细胞VEGF和bFGF分泌量具有正性时间-效应关系;浓度为10 ng/ml的IL-1β作用48 h可促进RPE细胞的VEGF和bFGF mRNA水平;MTT结果 证明IL-1β未明显影响RPE细胞的增生状态(F=0.317,P>0.05).结论炎前因子IL-1β可影响人RPE细胞VEGF和bFGF的分泌量,在一定的作用浓度和作用时间范围内具有显著的促进效应.     

整合素β1介导的ERK/MAPK通道在人晶状体上皮细胞转分化中的作用

目的研究转化生长因子-β2(transforming growth factor β2,TGF-β2)对培养的人氉晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)整合素β1、磷酸化ERK(pERK)及F-actin表达的影响,探讨整合素β1介导的ERK/MAPK通路在HLEC转分化中的作用。方法体外培养的HLEC,加入不同浓度(0ng·L-1和10ng·L-1、33ng·L-1、100ng·L-1、333ng·L-1、1000ng·L-1)的TGF-β2处理不同时间(12h、24h、48h、72h),采用MTT法测定TGF-β2对HLEC增殖的影响,并确定最佳干涉浓度和时间用于后续实验。实验分2组,实验组用含最佳干涉浓度TGF-β2的培养基培养HLEC,对照组使用无血清培养基培养,于最佳干涉时间对2组细胞行免疫细胞化学染色检测HLEC中整合素β1、pERK及F-actin的表达,RT-PCR检测整合素β1、pERK及F-actin mRNA的表达。结果 TGF-β2抑制HLEC的增殖,呈浓度和时间依赖性,TGF-β2的最佳干涉终浓度为100ng·L-1,作用48h后达到最大抑制效果。TGF-β2增加HLEC整合素β1、pERK及F-actin的表达,相对表达量分别为0.116±0.031、0.123±0.028、0.140±0.033,均较对照组(0.045±0.011、0.025±0.009、0.079±0.024)明显升高(均为P<0.01)。RT-PCR结果显示,TGF-β2明显促进整合素β1mR-NA、pERK mRNA及F-actin mRNA的表达,相对表达量分别为0.658±0.146、0.582±0.171、0.760±0.193,较对照组(0.246±0.051、0.338±0.092、0.138±0.027)明显升高(均为P<0.01)。结论 TGF-β2抑制了HLEC的增殖,促进整合素β1、pERK及F-actin的表达,整合素β1介导的ERK/MAPK信号通路可能参与了HLEC转分化过程,导致后囊膜混浊。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

环孢霉素A抑制人视网膜色素上皮细胞增生的体外研究

目的 观察环孢霉素A(cyclosporine,CsA)对体外培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增生的影响作用.方法 取体外培养人RPE细胞进行分组实验,实验分对照组和实验组:对照组用DMEM培养液继续培养;实验组按所加CsA浓度的不同分为0.20 mg·L-1、0.40 mg·L-1、0.80 mg·L-1、1.60 mg·L-1、3.20 mg·L-1、6.40 mg·L-1.时间效应关系分别于CsA作用24 h、48 h、72 h后测定.对照组和实验组均用MTT比色法测吸光度A值.结果 CsA浓度为0.20 mg·L-1时,作用72 h后差异有统计学意义(P＜0.05);CsA浓度≥0.40 mg·L-1时,作用24 h即差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CsA能够抑制体外培养的RPE细胞的生长,这种抑制作用在一定浓度范围内有剂量时间效应.     

转化生长因子β1对培养的人RPE细胞MMP和TIMP-1 mRNA表达的影响

目的研究转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)对培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞MMP-2、MMP-9和TI MP-1表达的影响。方法采用半定量RT-PCR检测hRPE细胞中MMP-2、MMP-9和TI MP-1的表达,及不同浓度TGF-β1(0.01μg·L-1、0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1)对hRPE细胞表达MMP-2、MMP-9和TI MP-1的影响。结果培养的人RPE细胞中MMP-2,MMP-9和TI MP-1的mRNA均有表达。TGF-β1能上调MMP-2mRNA的表达,并呈剂量依赖性。低浓度(0·01μg·L-1、0.1μg·L-1)TGF-β1处理RPE细胞后,可下调TI MP-1mRNA的表达,随着TGF-β1浓度的增加(1μg·L-1、10μg·L-1),TI MP-1mRNA的表达可轻微上调,但与对照组相比没有显著性差异。结论TGF-β1能上调培养的hRPE细胞中MMP-2mRNA的表达,引起MMP-TI MP平衡的直接改变,可能在玻璃体视网膜病理机制中有利于RPE细胞的迁移。     

高糖条件下人视网膜色素上皮细胞的上皮-间质转化

背景 研究证实,有多种细胞参与增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发生和发展过程,其中RPE细胞的上皮-间质转化(EMT)可能与PVR有关,其主要生物学行为是RPE细胞的增生和迁移.已证实高血糖是糖尿病视网膜病变(DR)发病的主要原因,而高糖条件下RPE细胞是否发生EMT鲜有报道. 目的 建立体外高糖细胞培养模型,探讨高糖对人RPE的迁移能力及EMT的影响.方法 用含质量分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基对人RPE细胞D407细胞株进行体外培养和传代,取6～8代细胞用于实验.依据培养液中血糖浓度的不同将细胞分为3个组,正常对照组培养基中葡萄糖终浓度为5.5 mmol/L,高糖培养组葡萄糖终浓度为60.0 mmol/L,用含5.5 mmol/L葡萄糖和甘露醇的DMEM培养基培养细胞作为高渗对照组.采用细胞划痕试验法检测划痕后0、24、48和72 h时3个组RPE细胞的迁移率,用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测高糖培养组在培养不同时间点RPE细胞间质化标志物闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA在细胞中的相对表达水平.结果 正常对照组培养的RPE细胞呈多角形,核仁清晰,排列致密;高糖培养组随着培养时间的延长,RPE细胞逐渐变大、变长,细胞结构不清,排列紊乱;高渗对照组细胞结构接近正常对照组.划痕试验显示,高糖培养组在划痕后48 h可见细胞迁移,划痕后72 h划痕基本消失,而正常对照组和高渗对照组划痕仍然存在.划痕后各时间点高糖培养组细胞迁移率明显高于正常对照组和高渗对照组,组间和各时间点的差异均有统计学意义(F分组=328.600,P=0.000;F时间=773.270,P=0.000).RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,高糖培养后48 h、72 h组细胞中ZO-1 mRNA的表达水平明显低于正常对照组,而α-SMA mRNA的表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 高糖条件下RPE细胞的迁移能力增强,发生EMT改变,可能参与增生性糖尿病视网膜病变(PDR)的发生.     

薯蓣皂苷对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨薯蓣皂苷(Dio)对高糖(HG)诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤的保护作用,并分析其机制.方法 用细胞计数试剂8(CCK-8)法筛选葡萄糖浓度和无细胞毒性的Dio剂量范围.将ARPE-19细胞分为对照组(5 mmol·L-1葡萄糖处理48 h)、模型组(50 mmol·L-1葡萄糖处理48 h)和低、中...     

Peroxiredoxin6在氧化损伤人视网膜色素上皮细胞中的表达

目的 探讨Peroxiredoxin 6(Prx6)在体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中的表达情况,以及在人RPE细胞受到不同浓度的H2O2攻击时Prx6表达量的变化.方法 复苏培养人RPE细胞传至第3代,实验分为正常对照组和不同浓度H2O2攻击组(0.125 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1),加入H2O2,后24 h收集细胞.通过免疫组织化学和RT-PCR法检测各组细胞Prx6的表达情况,同时应用MTT法检测各组细胞的存活率.结果 免疫组织化学和RT-PCR结果显示培养的正常RPE细胞中即有Prx6的表达.0.125 mmol·L-1.H2O2攻击组Prx6阳性表达量较正常组增多(4倍),0.25 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1H2O2,攻击组Prx6阳性表达量逐渐减少,1 mmol·L-1H2O2攻击组Prx6表达为阴性.MTT结果显示在H2O2浓度为0.125 mmol·L-1时,细胞的存活率仅轻微下降(91%),与正常组相比无统计学意义(P=0.086);在浓度为0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1时,细胞的存活率明显下降,分别为83%、74%和52%,与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 适量的氧化攻击可以诱导RPE细胞Prx6表达增高,进而保护细胞免受氧化损伤.     

胰岛素样生长因子结合蛋白-6对RPE细胞增殖和迁移的影响

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-6(insulin-like growth factor binding protein-6,IGFBP-6)对视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium,RPE)细胞增殖和迁移的影响。方法用IGF-Ⅱ(50mg·L-1)、PDGF(20mg·L-1)、VEGF(40mg·L-1)和TGF-β(4mg·L-1)干预ARPE-19细胞6h,以诱导细胞增殖,再加入不同浓度IGFBP-6(1mg·L-1、10mg·L-1、100mg·L-1、500mg·L-1、1000mg·L-1)作用24h、48h后,通过MTS实验观察OD值的变化,研究IGFBP-6对细胞增殖的影响。细胞划痕实验分为IGF-Ⅱ组(50mg·L-1)、IGF-Ⅱ+IGFBP-6组(含IGF-Ⅱ50mg·L-1和IGFBP-6500mg·L-1)、无血清培养液组的实验,细胞划痕24h、48h后,计算各组细胞移行愈合率的变化,从而研究IGFBP-6对细胞迁移的影响。结果 MTS比色法显示一定浓度的IGFBP-6(100mg·L-1、500mg·L-1、1000mg·L-1)可以抑制IGF-Ⅱ诱导的ARPE-19细胞增殖(P<0.05),各浓度IGFBP-6对PDGF、VEGF、TGF-β诱导的细胞增殖均无明显影响(均为P>0.05);细胞划痕实验显示,IGF-Ⅱ组、IGF-Ⅱ+IGFBP-6组、无血清培养液组的细胞移行愈合率[分别为(24h:43.91%±3.85%、29.76%±2.49%、26.12%±2.33%;48h:66.09%±1.67%、59.88%±3.43%、57.05%±2.49%)]差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 IGFBP-6能够抑制IGF-Ⅱ诱导的RPE细胞增殖和迁移。     

缺氧对视网膜色素上皮细胞基质细胞衍生因子-1和整合素连接激酶表达的影响

背景 缺氧是诱导新生血管形成的主要因素,近年来越来越多的研究证实基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和整合素连接激酶(ILK)在新生血管性疾病中发挥着重要作用,而缺氧对视网膜色素上皮(RPE)细胞SDF-1和ILK表达的影响尚未阐明. 目的 探讨缺氧对体外培养RPE细胞中SDF-1和ILK表达的影响.方法 从4周龄SPF级健康C57BL/6小鼠眼球中获取RPE组织并进行消化和培养,将达到80％融合的细胞进行传代.取第3代细胞制作细胞爬片后用细胞角蛋白18(CK18)抗体进行免疫组织化学检测和鉴定,以5×104个/ml密度将RPE细胞接种于含胎牛血清的DMEM/F12培养液的培养瓶中,无血清饥饿培养24 h后常氧组在常规培养基中进行培养,缺氧组在CoCl2浓度为200 μmol/L的含胎牛血清的DMEM/F12培养液中进行培养,2个组根据培养时间的不同再亚分为1、3、6、12、24、48、72h组.采用逆转录PCR(RT-PCR)检测RPE细胞中SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达,采用Western blot检测RPE细胞中SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达,均以目的基因A值/β-actin A值表示.结果 培养的RPE细胞呈不规则多边形,细胞质内布满黑色素颗粒,90％以上的细胞对CK18呈阳性反应.随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量逐渐增加,总体比较差异均有统计学意义(SDF-1 mRNA:F=281.875,P=0.000;ILK mRNA:F=187.566,P=0.000),12h达高峰,之后略有降低,但仍高于常氧组,缺氧1h组SDF-1 mRNA及蛋白表达无明显变化;缺氧培养3、6、12、24、48、72 h组SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量均明显高于常氧培养组,差异均有统计学意义(P＜0.01).随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(SDF-1:F=44.719,P=0.000; ILK:F=144.481,P=0.000).缺氧1h组SDF-1及ILK蛋白表达无明显变化;缺氧3、6、12、24、48、72 h组SDF-1蛋白、ILK蛋白表达明显升高,与常氧组比较差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 SDF-1和ILK参与了RPE细胞的缺氧反应,并且在缺血缺氧性视网膜病变的发生发展过程中可能发挥一定的作用.     

氯化钴对体外培养的视网膜色素上皮细胞VEGF表达的影响

目的探讨人视网膜色素上皮（RPE）细胞体外纯化培养方法和观察氯化钴（CoCl2）对RPE细胞VEGF表达的影响。方法采用酶辅助的显微分离法分离培养人RPE细胞并用细胞角蛋白和S-100免疫组织化学鉴定，用100μmol／L CoCl2 10％胎牛血清的DMEM培养RPE 30h，用免疫印迹方法测量其VEGF蛋白表达水平。结果酶辅助的显微分离法可体外纯化培养RPE细胞，用细胞角蛋白和S-100免疫组织化学染色均呈阳性。100μmol／L CoCl2作用30h后RPE细胞VEGF表达水平可提高2倍。结论通过Hu氏酶辅助的显微分离法，获得了RPE细胞的纯化培养；CoCl2可明显诱导RPE细胞VEGF表达上调。     

HSP90抑制剂对缺氧诱导的RPE细胞SDF-1表达的影响

目的 研究热休克蛋白(heat shock protein 90,HSP90)抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG)对缺氧诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)表达的影响.方法 将培养的第3代RPE细胞分为缺氧对照组、DMSO对照组和17-AAG预处理组.其中17-AAG预处理组根据浓度不同又分为6组:0.01 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、0.50 μmol·L-1、1.0 μmol·L-1、5.0 μmol·L-1、10.0μmol·L-1.利用氯化钴建立体外RPE细胞的化学缺氧模型,不同浓度的HSP90抑制剂17-AAG预处理RPE细胞1 h后给予12 h缺氧处理,RT-PCR和Western blotting方法检测SDF-1表达变化情况.结果 缺氧对照组、DMSO对照组和不同浓度17-AAG预处理组SDF-1 mRNA与内参B-actin mRNA光密度比值分别为0.89±0.04、0.93±0.07、0.62±0.06、0.52±0.06、0.43±0.06、0.28±0.04、0.21±0.04、0.17±0.03;SDF-1蛋白与内参B-actin蛋白光密度比值分别为0.76±0.04、0.80±0.06、0.65±0.04、0.34±0.03、0.20±0.02、0.16±0.02、0.07±0.02、0.05±0.01.与缺氧对照组比较,DMSO对照组SDF-1 mRNA和蛋白的表达无明显变化,而不同浓度17-AAG预处理组SDF-1 mRNA和蛋白的表达明显降低(p均<0.05),呈浓度依赖性.结论 HSP90的特异抑制剂17-AAG能有效抑制缺氧条件下RPE细胞SDF-1表达.     

转化生长因子-β1对人Tenon囊成纤维细胞表型转化的作用

目的探讨转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)对人Tenon囊成纤维细胞(humansubconjunctivalTenon’scapsulefibroblast,HTCF)表型转化的作用。方法人白内障手术中取结膜下Tenon囊组织块培养成纤维细胞。用第5~9代细胞,以不同浓度TGF-β1(0μg·L-1,2μg·L-1,5μg·L-1,10μg·L-1,20μg·L-1)、不同时间(24h、48h、72h)诱导成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型。结果体外用TGF-β1诱导HTCF,在0~10μg·L-1内,TGF-β1呈剂量依赖性增加平滑肌肌动蛋白在蛋白水平的表达,至20μg·L-1时表达迅速下降;10μg·L-1TGF-β1诱导48h后其平滑肌肌动蛋白的表达与24h、72h相比,差异有显著性(P<0.01,n=6)。结论一定浓度和剂量的TGF-β1能显著诱导HTCF表型转化为肌成纤维细胞,在人Tenon囊组织局部组织损伤修复及瘢痕形成中具有重要作用。     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)合成的影响.方法 研究人RPE细胞分别在150 μmol/L CoCl2 0 μh/mL TA(0μg/mL TA组)、150μmol/L CoCl2 50 μg/mL TA(50μg/mL TA组)和150 μmol/L CoCl2 200斗g/mL TA(200μg/mL TA组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组相比,50μg/mL TA组及200μg/mL TA组中VEGF mRNA及蛋白的表达明显下降,差异均具有统计学意义(P＜005),但HIF-1α mRNA及蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TA对缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α表达无影响,但能有效地抑制VEGF的表达,对缺血性视网膜病变新生血管形成具有防治作用.