一起GⅠ型诺如病毒混合感染多克隆蜡样芽胞杆菌致急性胃肠炎暴发事件实验室分析

  目的  通过一起急性胃肠炎暴发事件的实验室检测,分析暴发相关病原特征。  方法  对患者粪便、呕吐物标本以及可疑污染食品样本进行相关病原及毒力基因的实时荧光PCR筛查以及阳性菌的培养检测,对分离菌株进一步进行毒力基因分布分析和脉冲肠凝胶电泳分型分析。  结果  25例患者的粪便标本诺如病毒荧光PCR阳性,检出率为71.43%（25/35）,均为GⅠ型;5例患者的6份标本中蜡样芽胞杆菌荧光PCR和病原培养均为阳性,1名厨师粪便标本蜡样芽胞杆菌荧光PCR和培养结果均为阳性。 7件可疑食品样本中4件检出蜡样芽胞杆菌,其中5份食品样本ces基因阳性。 19株蜡样芽胞杆菌分离株脉冲场凝胶电泳（PFGE）分为14种带型,5例患者分离株中有2株PFGE带型相同且与厨师来源菌株分型一致,相同食品来源分离株的PFGE带型不完全一致。 19株分离株均不携带ces基因。  结论  诺如病毒和蜡样芽胞杆菌可能是导致本次急性胃肠炎暴发事件重要病原,以多病原快速筛查为指导的实验室检测对于病原的识别具有重要意义。     

金氏金杆菌特异性靶基因的选择及健康人群带菌率调查

目的对现有金氏金杆菌特异性PCR检测的相关靶基因进行特异性分析,选择适宜检测方法进行国内健康人群带菌率调查。方法利用生物信息学技术比较美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中已公布的金氏金杆菌16S rDNA、groEL、rtxA基因以及其他近缘基因序列,探讨3种靶基因在金氏金杆菌中的保守性。 对所选择的金氏金杆菌采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法进行特异性、敏感性、稳定性等验证。 应用已建立的方法对513份咽拭子样品进行检测。结果金氏金杆菌rtxA仅与牛莫拉菌近缘基因有72%相似度,金氏金杆菌不同菌株间相似度均达99%以上,rtxA基因保守性和特异性均优于16S rDNA与groEL基因,理论上更适合金氏金杆菌检测。 基于rtxA基因的金氏金杆菌real-time PCR检测方法敏感性好,最低检测下限1 copies/μl,可用于金氏金杆菌检测。 513份咽拭子,共检出阳性标本107份,阳性率为20.86%。结论rtxA基因在金氏金杆菌中高度保守,可作为核酸检测的靶基因。 基于rtxA的real-time PCR检测显示金氏金杆菌在我国健康人群中存在较高携带率且具有一定的年龄分布趋势。     

空肠弯曲杆菌中喹诺酮类抗生素耐药基因检测与耐药性研究

目的 建立一种检测人粪便样本中,空肠弯曲杆菌含喹诺酮类抗生素耐药基因情况的实时荧光PCR方法,并对空肠弯曲杆菌对喹诺酮类抗生素耐药性与耐药基因的相关性进行初步研究。方法 根据空肠弯曲杆菌对喹诺酮类抗生素耐药基因gyrA和gyrB序列设计引物,建立对应的实时荧光PCR方法,对79例空肠弯曲杆菌进行检测,基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。以药敏试验结果作为参照标准,对两种检测方法的结果进行统计学分析,计算实时荧光PCR的主要技术指标。结果 22例(27.8%)空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR出现特异性扩增曲线,扩增产物电泳结果显示其中13例携带gyrA基因(59.1%),7例携带gyrB基因(31.8%),2例同时携带gyrA和gyrB基因(9.1%)。药敏试验显示26例空肠弯曲杆菌为环丙沙星耐药型(32.9%)。统计学分析显示,两种方法的检测结果差异无统计学意义(χ² =1.125,P>0.05),一致性较好。实时荧光PCR法的灵敏度和特异度分别为76.9%和96.2%,总符合率为89.9%。结论 实时荧光PCR法能够检测空肠弯曲杆菌耐药基因gyrA和gyrB。耐药基因与耐药型之间有所关联,需要进一步研究。     

蜡样芽胞杆菌群分类学研究进展

蜡样芽胞杆菌群由蜡样芽胞杆菌及其近缘菌组成,该群内菌种由于在表型特征和基因特征上高度相似,使该群菌分类和鉴定复杂且难以统一。随着分子生物学和基因组学的发展,该群分类学研究发展迅速,目前已形成了表型、基因组以及将表型和基因组特征相结合的基因种/亚种/生物变种方法等几种分类框架。本研究就近年来蜡样芽胞杆菌群分类学研究进展进行综述。     

1例阿萨姆类芽胞杆菌感染病例调查分析

目的对贵州省黔西南州兴义市患者关节液中分离的疑似土拉弗朗西斯菌（土拉菌）进行鉴定。方法将患者关节液中分离的1株革兰阴性菌（经全自动细菌鉴定及药敏分析系统检测，此菌株为土拉菌），接种到土拉菌选择性培养基上进行初步筛选。 对新鲜培养的菌株进行土拉菌特异抗原乳胶凝集检测；并用16S rRNA的两对引物27f和1492r、8-27f和1500r对菌株进行菌种鉴定。 采集患者血清，分别采用玻片法和试管法进行土拉菌特异抗体乳胶凝集检测。结果该菌在土拉菌选择性培养基上不生长。 土拉菌特异抗原乳胶凝集检测为阴性，采用玻片法和试管法进行土拉菌特异抗体乳胶凝集检测，均为阴性。 用两对引物扩增分别得到1 379 nt和1 429 nt的片段，经测序和比对分析，该菌株与阿萨姆类芽胞杆菌GPTSA 11的16S rRNA基因具有高度一致性，覆盖率为100%，E值为0。 两个片段均含有类芽胞杆菌属特有的保守信号序列PAEN 515F和PAEN 862F。结论该病例排除土拉菌感染，为阿萨姆类芽胞杆菌引起感染，是首例阿萨姆类芽胞杆菌感染的临床病例。     

炭疽高发地区土壤样本中常见芽胞杆菌的分离及鉴定

目的 通过分离鉴定炭疽可疑污染土壤样本的芽胞杆菌,评价消毒效果和了解监测地区土壤中的芽胞杆菌分布情况。 方法 采集炭疽监测点土壤样本60份,对炭疽芽胞杆菌和其他芽胞杆菌进行分离培养和聚合酶链反应扩增鉴定。 结果 在可疑污染土壤样本中未分离到炭疽芽胞杆菌;从分离到的48个单克隆菌落中扩增到33个目的片段,经测序和blast比对,确定得到地衣芽胞杆菌13株,枯草芽胞杆菌8株,短小芽胞杆菌扩增11株,蜡样芽胞杆菌扩增到1株,巨大芽胞杆菌引物和环状芽胞杆菌引物特异性不好。 结论 本研究提示该监测点炭疽疫情消毒效果可信,但需要进一步研究验证;几种芽胞杆菌在土壤中广泛存在,在炭疽监测工作中进行病原体分离时需要加以鉴别,可通过特异基因扩增来辅助检验。     

一起疑似食物中毒暴发事件的病原学分析

目的 阐明一起疑似由蜡样芽胞杆菌污染奶源引起的食物中毒暴发事件的病原学特征,为查明暴发源头和临床治疗提供依据.方法 对198例患儿进行流行病学调查,采集可疑奶制品和病例标本,进行菌株分离和鉴定.分离到的蜡样芽胞杆菌菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型、全基因组测序以及毒力基因分析.采用微量肉汤稀释法进行药物敏感性...     

基于16S rRNA和gyrB基因的施万菌种水平鉴定分析

  目的   构建基于16S rRNA和gyrB基因对施万菌(Shewanella)进行种水平鉴定的方法,比较2个基因的鉴定能力差异。   方法   利用DnaSP 6.0软件对施万菌16S rRNA 和gyrB 基因的信息位点数及其百分比、核苷酸多态性值、平均G＋C含量、非同义突变率与同义突变率的比值（Ka/Ks）、Tajima检验进行基因多态性分析。 用MEGA 6.06软件的邻接距离矩阵法对90株测试菌株和54株模式菌株构建16S rRNA 和gyrB 基因的进化树。 用MEGA 6.06软件的Kimura’s 2-parameter模型,确定90株测试菌株的菌种后,计算16S rRNA 和gyrB 基因的遗传距离和序列相似性。 比较两者对施万菌种水平鉴定能力差异。   结果   16S rRNA和gyrB基因序列相似性平均值分别为95.0%、80.8%。 在16S rRNA基因进化树中,S. marinintestina和S. sairae、S. livingstonensis和S. vesiculosa的进化分支几乎完全相同,gyrB基因则能在种水平将所有菌株区分开。 16S rRNA基因的种内和种间相似性范围小。   结论   与16S rRNA基因相比,gyrB基因能够更准确的用于施万菌的种水平鉴定。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定溶藻弧菌方法的建立

目的建立一种基于DNA回旋酶B亚单位基因(gyrB)基因的Taqman-探针荧光定量聚合酶链式反应(PCR)鉴定溶藻弧菌的方法。方法以溶藻弧菌标准株(ATCC)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过软件设计溶藻弧菌gyrB基因的特异性PCR引物及Taqman-探针,采用荧光定量PCR仪进行检测,评价该检测方法的特异性和灵敏度。结果 Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对溶藻弧菌gyrB基因的检测灵敏度为10~(-3)mg/L;在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌6种其他常见致病菌时未出现阳性扩增,特异性均为100%。结论成功建立Taqman-探针荧光定量PCR是一种特异性、灵敏度均较好的鉴定溶藻弧菌的方法,该方法适用于溶藻弧菌的快速检测,具有应用价值。     

采用gyrB基因扩增快速鉴定结核分枝杆菌复合群的初步研究

目的:初步分析gyrB基因扩增用于结核分枝杆菌复合群(MTC)快速鉴定的可行性.方法:采用特异性引物进行分枝杆菌标准株和临床株的gyrB基因扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳观察聚合酶链反应(PCR)结果.结果:15株各种分枝杆菌标准株中,结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌均扩增出1 184bp目的片段,而其余分枝杆菌PCR结果为阴性;94株分枝杆菌临床株中,60株MTB和10株牛分枝杆菌扩增阳性.而其他分枝杆菌(包括6株脓肿分枝杆菌、5株偶发分枝杆菌、4株龟分枝杆菌、3株鸟分枝杆菌、3株胞内分枝杆菌、2株耻垢分枝杆菌、1株堪萨斯分枝杆菌)均扩增阴性.结论:采用针对MTC的特异性引物进行gyrB基因扩增能快速、准确地鉴别MTC和非结核分枝杆菌.     

Incidence and characterization of diarrheal enterotoxins of fecal Bacillus cereus isolates associated with diarrhea

A total of 490 stool specimens were collected from patients with diarrhea and healthy controls without diarrhea to investigate the incidence of Bacillus cereus and its enterotoxins. B. cereus was found more significant in stools of persons with diarrhea than without diarrhea (9.5% versus 1.8%, P < 0.05), and was also detected more frequent but not significant in individuals aged > or =1 year and in adults than in children aged <1 year (11% and 8% versus 7.8%, P > 0.05). The hemolytic enterotoxin HBL genes of B. cereus isolates (hblA, hblC, hblD) were detected in 58%, 58%, and 68%, respectively, whereas the nonhemolytic enterotoxin NHE genes (nheA, nheB, nheC) were detected more frequent in 71.%, 84%, and 90% of the isolates, respectively. This study suggests that B. cereus isolates harboring 1 or more enterotoxin gene(s) can be a potential cause of diarrhea in Jordanian population.     

DNA microarray for detection of antibiotic resistance determinants in Bacillus anthracis and closely related Bacillus cereus

We developed a multiplex PCR for amplification of ten genes involved in resistance to ciprofloxacin, doxycycline, rifampin, and vancomycin in Bacillus anthracis and closely related Bacillus cereus. Enzymatic labelling of PCR products followed by hybridization to oligonucleotide probes on a DNA microarray enabled simultaneous detection of resistance genes tetK, tetL, tetM, tetO, vanA, and vanB and resistance-mediating point mutations in genes gyrA, gyrB, parC, and rpoB. The presented assay allows detection of clinically relevant antibiotic resistance determinants within 4h and can be used as a time-saving tool supporting conventional culture-based diagnostics.     

Real-time PCR system targeting a chromosomal marker specific for Bacillus anthracis

Specific identification of Bacillus anthracis and differentiation from closely related Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains is still a major diagnostic problem. Commercially available diagnostic kits targeting plasmid-markers cannot differentiate between B. anthracis, non-anthracis Bacillus species harbouring anthrax-specific virulence plasmids, and plasmidless B. anthracis strains. A TaqMan PCR assay was designed targeting sequences of gene locus BA_5345 of the B. anthracis strain Ames. Specificity was determined by using a panel of 328 Bacillus strains; sensitivity was determined by probit analysis. All B. anthracis isolates (n=92) were specifically detected by using the genomic TaqMan PCR assay whereas 236 strains belonging to 19 Bacillus species other than B. anthracis were PCR negative. The detection limit was determined to be 12.7 copies per reaction (95% confidence interval 10.2-17.5 copies). Here we present an extensively evaluated and - to our current knowledge - specific TaqMan PCR assay for the detection of B. anthracis based on a chromosomal marker.     

多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

Identification of Bacillus anthracis by multiprobe microarray hybridization

We have developed a rapid assay based on microarray analysis of amplified genetic markers for reliable identification of Bacillus anthracis and its discrimination from other closely related bacterial species of the Bacillus cereus group. By combining polymerase chain reaction (PCR) amplification of six B. anthracis-specific genes (plasmid-associated genes encoding virulence factors (cyaA, pagA, lef, and capA, capB, capC) and one chromosomal marker BA-5449) with analysis of amplicons by microarray hybridization, we were able to unambiguously identify and discriminate B. anthracis among other closely related species. Bacillus identification relied on hybridization with multiple individual microarray oligonucleotide probes (oligoprobes) specific to each target B. anthracis gene. Evaluation of the assay was conducted using several B. anthracis strains (with or without pXO1 and pXO2 plasmids) as well as over 50 other species phylogenetically related to B. anthracis, including B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, and B. subtilis. The developed microarray analysis of amplified genetic markers protocol provides an efficient method for (i) unambiguous identification and discrimination of B. anthracis from other Bacillus species and (ii) distinguishing between plasmid-containing and plasmid-free Bacillus anthracis strains.     

Detection of Bacillus cereus with enteropathogenic potential by multiplex real-time PCR based on SYBR green I

In order to meet the growing demand for fast and reliable detection of potentially toxinogenic Bacillus cereus, we developed a multiplex real-time PCR assay based on SYBR Green I with subsequent melting curve analysis. We designed and selected primers specific for genes of toxins responsible for diarrhoea (nheA, hblD and cytK1) and emesis (ces). A panel of 337 Bacillus strains was applied to the novel method on Light Cycler 2.0 with average melting temperature (T_m) values of 73.85 °C (nheA), 87.01 °C (hblD), 78.66 °C (ces) and 82.19 °C (cytK1). An adapted version of the assay was also successfully run on Light Cycler 480 using one third (113 strains) of the total test panel. Verification of PCR results by conventional PCR as well as immunoassays and cytotoxicity tests gave an overall excellent correlation. Distinct melting peaks were only observed in B. cereus and B. cereus group strains but not in other Bacilli and Gram-positive or Gram-negative bacteria. Artificial contamination of three different food matrices with distinct bacterial counts revealed a detection limit of 10¹ CFU/g B. cereus cells after overnight enrichment. Thus, the novel multiplex real-time PCR turned out to be a reliable method for identification of B. cereus with enteropathogenic potential.     

多重PCR结合基因芯片技术检测11种致病菌方法的建立

目的建立一种运用多重PCR方法结合基因芯片技术快速、准确检测11种常见致病菌的方法。方法筛选志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌的特异基因作为目的基因。设计相应的引物及探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有11种特异探针的基因芯片杂交。用扫描仪扫描,判定细菌种类。结果该基因芯片可特异性地检测11种致病菌,具有良好的特异性,基因组DNA检测灵敏度可达2×10-3ng。结论多重PCR结合基因芯片技术检测11种不同致病菌的方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。