H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。     

A型流感病毒NP基因的克隆表达与鉴定

目的 构建人A型流感病毒NP基因原核重组表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法 从流感患者咽分泌物中提取总RNA,设计特异性引物,经RT-PCR得到NP基因开放阅读框cDNA后定向克隆到原核表达载体pET28b(+),构建含目的 基因的pET28b(+)-NP重组质粒,经酶切、PCR和测序正确后转化E.coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 ①成功构建了pET28b(+)-NP重组质粒;②在E.coli BL21(DE3)中表达了一分子量约55 kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定正确.结论 重组质粒pET 28b(+)-NP构建成功并在E.coli BL21(DE3)中高效表达了人A型流感病毒NP蛋白,为后续该蛋白的功能研究奠定了基础.     

人感染禽流感病毒A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)株HA基因序列分析

目的测定本市首例人感染禽流感病毒A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)株HA基因序列,分析H7N9禽流感病毒HA基因特点。方法采用real-time PCR检测患者H7N9禽流感病毒核酸,RT-PCR扩增病毒HA基因后测定核苷酸序列。结果实验室确诊丽水首例人感染H7N9禽流感患者。测序得到H7N9禽流感病毒长度为1 683 bp的HA基因核苷酸全序。A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)与我国江浙沪分离株HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性都比较高,分别为98.8%~99.5%、98.9%~99.5%;与浙江鸡分离株A/chicken/Zhejiang/C483/2013(H7N9)序列相似性最高。A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)与我国江浙沪H7N9病毒株HA基因序列均处于同一进化分支;与浙江外环境分离株A/environment/Hangzhou/34/2013(H7N9)进化关系最近;与浙江鸡分离株A/chicken/Zhejiang/C483/2013(H7N9)进化关系次之;与韩国野鸟分离株A/wildbird/Korea/A3/2011(H7N9)处于同一进化分支。结论 A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)HA基因来源于浙江鸡携带的H7亚型流感病毒。HA基因具有低致病性禽流感病毒基因特征,但与人类呼吸道上皮细胞的亲和力增加,更容易感染到人。     

2013年崇左市流行性感冒实验室检测结果分析

目的对崇左市2013年流行性感冒(流感)实验室控检测结果进行分析,了解2013年崇左市流感病原学特征,为实验室诊断流感提供参考。方法采集2013年崇左市人民医院及各地送检的流感样病例咽拭子标本912份,应用实时反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)技术检测样本中的AM、BNS、H1HA、H3HA、SWH1 HA、H5HA、H9HA、H7HA、N9NA基因。结果 912份标本中,检测到乙型流感病毒核酸阳性19份,季节性流感病毒H1亚型核酸阳性0份,季节性流感病毒H3亚型阳性4份,甲型H1N1病毒特异性基因片段阳性58份,季性性H3和甲型H1N1流感病毒核酸同时阳性1份,均未检测到人感染高致病性禽流感中的H5HA、H9HA、H7HA、N9NA基因。甲型H1N1的检出率较高为6.36%(58/912),阳性构成比为70.73%。乙型流感病毒核酸阳性率为2.08%(19/912),季节性H1流感病毒阳性率为0.00%(0/912),季节性H3流感病毒阳性率为0.44%(4/912),季性性H3和甲型H1N1流感病毒核酸同时阳性率为0.11%(1/912)。均未检测出人感染H5,H9,H7N9禽流感病毒。结论甲型H1N1仍是2013年崇左市流感的主要毒株类型,流行趋势以散发为主,较2009年大暴发流行有所下降。     

浙江省人感染H7N9禽流感病毒的基因组序列分析

目的分析浙江省2013年4月初一例人感染甲型H7N9禽流感患者的病原学和基因组序列特征.方法提取患者标本的病毒RNA并用荧光定量RT-PCR方法检测,一步法RT-PCR扩增H7N9禽流感病毒基因组的8个片段,测序并拼接出基因组序列.下载目前已经公布的H7N9禽流感病毒和其他H7、N9亚型的病毒的HA和NA序列,采用Mega 5.1软件对其进行序列比对并构建进化树.根据测序的结果分析该例H7N9禽流感病毒的序列变异情况.结果该患者标本甲型流感、H7亚型和N9亚型均为阳性,通过扩增基因组各片段并进行测序.对血凝素和神经氨酸酶基因进行比对和进化树构建,结果显示该H7N9病毒HA基因与A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)的亲缘关系最近,NA基因与A/wild bird/Korea/A14/2011 (H7N9)的亲缘关系最近.编码内部蛋白的6个基因均与中国大陆近两年的H9N2毒株最为相似.该标本的病毒HA蛋白发生了Q226L突变,而与已经公布的人感染H7N9禽流感毒株均不一致的是PB2未发生E627K突变.结论从该份临床标本完成了检测和基因组各片段的扩增与测序.该病毒与已报道的人感染H7N9禽流感病毒同源性高,存在Q226L等重要位点的突变,但PB2未发生E627K突变.     

浙江省首例人感染H7N9禽流感病例的实验室检测与分析

目的 通过对杭州市萧山区1例疑似人感染禽流感病人咽拭子和鼻腔冲洗液样本进行检测和分析,加深对A型流感病毒抗原变异特性的认识,进一步提高实验室相应的检测能力.方法 以实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测流感病毒核酸,对未能分型的HA、NA和M基因通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增而后克隆测定;同时接种狗肾细胞(MDCK)进行病毒培养.结果 样本A型流感病毒核酸检测为阳性,但未能分型;HA、NA、M基因测序结果表明与禽源H7、N9、M基因相似性最高;同时A型流感病毒培养也呈阳性.结论 经过浙江省CDC与中国CDC证实,该患者感染H7N9禽流感病毒,为浙江省首个病例.     

北京市某区1例人感染H7N9禽流感病毒的HA和NA基因特征分析

目的 了解北京市某区1例人感染H7N9禽流感病毒基因特征,为禽流感病例的早期发现、疫情控制提供参考。方法 提取病例临床样本病毒核酸,反转录扩增后进行病毒血凝素基因(hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶基因(neuraminidase, NA)序列测定。获得的病毒序列与全球流感共享数据库中H7N9禽流感病毒株进行序列分析,比较该病毒与北京市既往发现株和其他省市毒株同源性,构建系统发育树,并对部分耐药位点和糖基化位点进行分析。 结果 北京市某区1例H7N9禽流感病毒为低致病性禽流感。HA、NA与北京既往发现的29株毒株氨基酸同源性为97.2%~100%和96.8%~100%,基于系统进化分析与之最为相近的疫苗株为A/Hunan/02650/2016。HA蛋白受体结合位点发生了G186V、Q226L突变,HA和NA的糖基化位点均未发生变化。 结论 该区出现的H7N9病毒与北京地区既往发现H7N9毒株具有高度同源性,部分氨基酸位点存在变异,但未发生耐药突变。     

2013-2017年苏州市H7N9禽流感病毒流行特征及耐药突变监测分析

目的 分析2013-2017年苏州市人感染H7N9亚型禽流感病毒疫情流行特征，获取神经氨酸酶基因数据进行耐药变异分析。方法 应用实时荧光定量-聚合酶链反应（real-time PCR）方法检测疑似病例咽拭子标本甲/乙型及H7N9亚型流感病毒核酸。H7N9阳性标本送中国疾病预防控制中心所属国家流感中心进行病毒分离和神经氨酸酶基因测序分析。结果 2013年4月~2017年5月间苏州市共报告82例人感染H7N9禽流感实验室确诊病例，苏州人感染H7N9病毒总体病死率为41.46%（34/82）。患者中位年龄为58岁，男女性别比例约为2.9:1（61/21）。85.37%（70/82）的确诊患者发病前有活禽暴露史。序列分析表明神经氨酸酶基因同源性为97.7%~100.0%。A/Suzhou/88/2016（H7N9）和A/Suzhou/54/2016（H7N9）分别发生H274Y及R292K耐药突变。A/Suzhou/63/2016（H7N9）等部分分离株NA蛋白出现42位潜在糖基化位点缺失。结论 H7N9病毒仍在不断进化，直接接触活禽或被病毒污染的环境是人感染H7N9病毒的主要途径；有必要密切监测可能出现的耐药突变及耐药毒株的扩散。     

江苏地区7株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

目的了解江苏地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传变异情况及分子生物学流行规律。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对7株从江苏淮安地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因进行扩增和测序,并对所获得的HA基因序列与该亚型的代表毒株进行同源性分析,构建系统进化树。结果 7个分离株核苷酸同源性达97%以上,与临近省份分离毒株同属国内常见的BJ94-like亚系。7株毒株HA裂解位点的氨基酸序列均为RSSR↓GLF,为低致病性禽流感病毒。结论 2014年江苏省H9N2禽流感病毒进化相对比较稳定,此7株毒株可能有着相同的起源。     

长沙市首例人感染H9N2禽流感病毒的分离及基因特征分析

2015年9月从来源于国家级流感样病例监测哨点医院的标本中分离出一株H9N2亚型禽流感病毒。为了了解病毒的来源、重组、变异及耐药等分子特征,本研究对这株病毒的神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)和基质蛋白(Matrix protein,M)基因进行测序及序列特征分析。结果显示长沙市人感染H9N2毒株的NA基因与A/duck/jiangxi/20147/2013(H9N2)禽源关系最近,遗传进化分支属于欧亚系中A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)分支。M基因与A/duck/wenzhou/YHQL64/2014 (H9N2)禽源关系最近,属于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分支。该病毒分离株的NA和M基因与2014年长沙市活禽环境中的H9N2病毒高度同源。影响NA蛋白功能的关键氨基酸位点相对保守,未产生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变;M2蛋白的第31位氨基酸由S突变为N导致病毒对金刚烷胺类药物耐药。因此,长沙市的人感染H9N2禽流感病毒有可能是来源于长沙市活禽环境中的H9N2病毒,它们是通过家禽贸易传播并发生病毒重配而产生。     

达安基因

<正>分享成长价值To share is to enjoy公司简介中山大学达安基因股份有限公司依托中山大学雄厚的科研平台,以分子诊断技术为主导,集临床检验试剂和仪器的研发、生产、销售以及全国连锁医学独立实验室临床检验服务为一体的生物医药高科技集团公司,拥有7家研究机构、40多家全资或合资的下属企业。由公司自主研发的荧光定量PCR检测(FQ-PCR)系列产品在国内的市场覆盖率稳居行业第一。     

达安基因

<正>分享成长价值To share is to enjoy公司简介中山大学达安基因股份有限公司依托中山大学雄厚的科研平台,以分子诊断技术为主导,集临床检验试剂和仪器的研发、生产、销售以及全国连锁医学独立实验室临床检验服务为一体的生物医药高科技集团公司,拥有7家研究机构、50多家全资或合资的下属企业。由公司自主研发的荧光定量PCR检测(FQ-PCR)系列产品在国内的市场覆盖率稳居行业第一。     

破解乳房的基因密码

理想的乳房美应该是乳房大小适度、均匀、丰满与健康的完美结合.然而许多女性朋友可能会发出这样的感叹:为什么别人的乳房看起来充实饱满,而自己却只能做"太平公主";为什么别人的乳房健健康康,而自己的乳房却不断受到疾病的骚扰;为什么别人的运气那么好,而自己偏偏就没有"福像",这些难道都是注定的吗?中国科学院北京基因组研究所甄二真博士告诉我们,实际上决定我们乳房命运的不是星象、更不是运气,而是我们的DNA,科学研究表明,哪怕是像感冒这种小毛病都与基因有关系.     

破解乳房的基因密码

理想的乳房美应该是乳房大小适度．均匀、丰满与健康的完美结合。然而许多女性朋友可能会发出这样的感叹为什么别人的乳房看起来充实饱满，而自己却只能做“太平公主”；为什么别人的乳房健健康康，而自己的乳房却不断受到疾病的骚扰；为什么别人的运气那么好．而自己偏偏就没有“福像”，这些难道都是注定的吗？中国科学院北京基因组研究所甄二真博士告诉我们。实际上决定我们乳房命运的不是星象．更不是运气．而是我们的DNA，科学研究表明．哪怕是像感冒这种小毛病都与基因有关系。[编按]     

婴幼儿轮状病毒VP7基因cDNA文库构建

[目的]分离与培养婴幼儿轮状病毒,并克隆婴幼儿轮状病毒外壳蛋白VP7基因,导入pMD18-T载体,成功构建VP7基因cDNA文库,为构建轮状病毒基因工程疫苗奠定基础. [方法]提取婴幼儿轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化与回收,最后纯化的VP7基因与pMD18-T载体进行连接,进行质粒抽提与鉴定. [结果]提取的婴幼儿轮状病毒总RNA比较完整,28S、18S,5S条带清晰可见,成功扩增VP7基固,连接pMD18-T载体,转化感受态菌(DH5α),通过蓝白斑筛选得到DNA阳性重组子(载体+VP7基因片段).[结论]通过对婴幼儿轮状病毒培养、VP7基因扩增、基因片段回收、连接、转化、鉴定等一系列技术,初步确定婴幼儿轮状病毒外过壳蛋白VP7基因已导入pMD18-T载体,成功构建VP7基因cDNA文库,为进一步研制轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

RETINOIC ACID AND THYROID HORMONE REGULATE GENE EXPRESSION THROUGH A COMMON GENE ELEMENT

Retinoic acid and thyroid hormone share a common hormone-responsive gene element whereby they can regulate gene expression.     

多重实时荧光PCR检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌

[目的]建立多重实时荧光PCR方法以检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌.[方法]通过设计引物和探针,优化反应条件,建立多重实时PCR,检测金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽胞杆菌16S rRNA保守区基因及其ces基因(编码致呕毒素cereulide).该多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,比较其与菌株鉴定结果及ces基因普通PCR检测结果.[结果]多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,与菌株鉴定结果的符合率为100%.蜡样芽胞杆菌的ces基因检测结果也与普通PCR结果相符.[结论]建立了同时检测金黄色葡萄球菌nuc、蜡样芽胞杆菌168保守区基因及ces基因多重实时PCR方法,可应用于金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌在种水平上的菌株鉴定、以及蜡样芽胞杆菌cereulide毒力菌株的鉴定.     

某地区麻疹病毒核蛋白及血凝素基因序列分析

目的：探讨深圳市麻疹病毒的基因型别和特征。方法：采用B95a细胞分离培养麻疹病毒，通过PT-PCR方法扩增麻疹病毒核蛋白N末端450bp片段和H基因合序列并测序、分析和基因库Genebank中麻疹的各代表株基因序列的同源性进行比较。结果：分离到1株麻疹病毒，N基因与H1基因型代表株相比同源性为98．4％，H基因与H1基因代表株同源性达99．5％。结论：深圳市麻疹流行株属于H1基因型。     

肾病易感基因的研究进展

肾病易感基因是国内外研究的热门,目前认为肾病是一个多基因遗传性疾病,遗传因素与环境因素共同作用,决定肾病的发生和发展。近年来,国内外学者应用多种分子生物学方法,对肾病的候选基因进行了大量研究,结果发现与人类肾病有关的候选基因有几十多种,本文就近年来这一领域的研究现状做一综述。     

硒对糖尿病大鼠肝脏磷脂酶D基因表达的影响

目的:研究硒对糖尿病大鼠代谢相关基因表达的调控作用。方法:对前期研究分离到的与补硒50μg/kgbwd有关的糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序及同源性分析,选择目的基因进行RT-PCR验证,以观察各组大鼠之间肝脏中基因表达的变化。结果:差异显示基因片段Se-4的碱基序列与磷脂酶D(PLD)基因片段的同源性为100%。RT-PCR验证结果显示:PLDmRNA在糖尿病对照组、糖尿病补硒组大鼠肝脏中的表达水平较正常对照组明显增高,但糖尿病补硒组PLDmRNA的表达较糖尿病对照组有所降低(P<0.05)。结论:硒可抑制糖尿病大鼠肝脏中PLDmRMA的表达,这可能是硒改善糖尿病糖、脂代谢紊乱的分子机制之一。