抗菌药物治疗疾病的新靶位——丙氨酸消旋酶

丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶,催化L-丙氨酸与D-丙氨酸相互转化的一种酶,它广泛分布在低等生物,而不存在于人类等高等真核生物中.来自不同物种的丙氨酸消旋酶一级结构同源性较高,其大多功能单位为同源二聚体,拥有2个相同的活性中心,每个活性中心均是由来自不同亚基的2个保守残基共同组成.丙氨酸消旋酶催化生成的产物D-丙氨酸是合成细菌细胞壁肽聚糖的重要成分,也是调节细菌孢子萌芽的关键因子.因而丙氨酸消旋酶与由细菌引起的肺结核、炭疽热、中耳炎等疾病密切相关.近年来丙氨酸消旋酶已成为设计抗菌药物的又一理想靶位.本文从丙氨酸消旋酶的结构、功能、作用机理、抑制剂以及其与疾病的关系等方面进行了阐述.     

抗菌药物靶标丙氨酸消旋酶及其抑制剂研究进展

抗生素的滥用和人口的大量流动使得病原菌耐药性增强并与其他病原体产生共感染等问题,严重威胁人类的生命安全,因此,研发新型抗菌药物成为人类亟待解决的问题。丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶催化L-丙氨酸与D-丙氨酸旋光结构互换的一类异构酶,其消旋产物D-丙氨酸对细菌细胞壁的形成具有决定性作用,与细菌性疾病密切相关。抑制丙氨酸消旋酶的活性会影响细菌的生存,近年来成为设计抗菌药物的一个理想靶位,其抑制剂的开发已成为抗菌药物研发的热点。本文从丙氨酸消旋酶的来源、结构、功能、应用及抑制剂等方面进行系统阐述,并对丙氨酸消旋酶的研究提出新的策略,为进一步研究丙氨酸消旋酶与致病菌的关系及抗菌药物候选靶标的研究提供理论基础。     

西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组来源的丙氨酸消旋酶的异源表达及性质研究

丙氨酸消旋酶是异构酶家族中一类重要的酶,既能作为新型抗菌药物筛选的靶标,又是酶法合成D-氨基酸的关键酶之一,有巨大的研究价值.[目的]为挖掘动物胃肠道中未培养微生物的丙氨酸消旋酶基因资源,探究不同微生物来源丙氨酸消旋酶基因及其酶的功能和性质.[方法]本研究从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组出发,基于序列分析和基因功能注释...     

以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的抗结核药物筛选及其与D-环丝氨酸的共结晶

【目的】阐释结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶原有抑制剂D-环丝氨酸的作用机制,建立丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选模型,并用此模型筛选到新的抑制剂分子。【方法】将结核分枝杆菌中丙氨酸消旋酶基因克隆到pET-28a表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到可溶性的大量表达。表达后的蛋白质通过镍离子亲和层析和阴离子交换层析得到纯化,一方面将纯化后的蛋白和D-环丝氨酸共结晶以解析其抑制剂作用的分子机制。另一方面建立并优化丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选体系,用D-环丝氨酸验证体系的可行性并用该体系筛选本实验室药物库中的384种小分子片段、792种化合物及2 200种中药样品。【结果】得到的共晶晶体衍射能力2.50?,晶体空间群为P41212,晶胞参数a=b=163.92?,c=57.44?。结构分析表明,D-环丝氨酸进入活性位点之后与磷酸吡哆醛相互作用形成磷酸吡哆胺,使得磷酸吡哆醛的C4?原子与K42之间的相互作用被破坏,从而改变了结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性中心氢键网络。同时经D-环丝氨酸验证建立的抑制剂筛选体系可行,获得阳性化合物分子2个。【结论】依据我们所建立的高通量筛选体系可以有效地为结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶筛选到可信的抑制剂分子。     

丙氨酸消旋酶C-端结构域重组体的构建及其功能初探

【目的】将嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4DadX的N-端结构域分别与多个不同种属的丙氨酸消旋酶C-端结构域重组,探究丙氨酸消旋酶C-端结构域功能。【方法】利用基因拼接构建丙氨酸消旋酶重组基因,通过镍亲和层析纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测重组酶蛋白的酶学特性,借助分子筛和HPLC液相色谱分析其聚合状态及动力学参数。【结果】通过基因拼接构建了12个重组基因,经检测,表达、纯化获得的重组酶蛋白中只有OF4TtDadX240c具有催化活性,其活性仅为OF4DadX的60.54%,酶催化动力学结果显示OF4TtDadX240c催化反应速率Vmax/Km下降约10倍,但其稳定性大幅提高,半衰期比OF4DadX延长约5倍,耐热性提高较明显;聚合状态表明OF4DadX、OF4TMDadX226c和OF4TtDadX240c为二聚体结构,其他酶蛋白均为单体,但OF4TMDadX226c未检测到活性,推测可能是酶催化活性中心移位,未能形成质子转移而失去活性。【结论】丙氨酸消旋酶C-端折叠结构域对消旋酶低聚化、稳定性和酶催化功能具有重要作用。     

荧光假单胞菌TM5-2中D-型氨基酸脱氢酶的鉴定和表达

从荧光假单胞菌TM5-2中得到一个含丙氨酸消旋酶基因的DNA片段(8.8kb),相邻的一个开读框(ORF)与甘氨酸/D-型氨基酸氧化酶基因相似。该ORF经过克隆、表达,并没有检测到甘氨酸/D-型氨基酸氧化酶的活性,推导而得的氨基酸序列与D-型氨基酸脱氢酶序列比较发现,ORF含有D-型氨基酸脱氢酶的所有重要的保守序列。经TTC培养基鉴定,其具有D-型氨基酸脱氢酶的活性,并对一系列D-型氨基酸有作用,最佳作用底物是D-组氨酸。     

环孢菌素A的研究进展及应用

环孢菌素A是从真菌中提取的一种新型免疫抑制剂,可选择性作用于T细胞,抑制其活化,现主要应用于器官移植时的排斥反应。工业上多以真菌孢子为原料,发酵生产进而分离纯化的方法得到环孢菌素A,以D-丙氨酸作为底物,在丙氨酸消旋酶和环孢菌素合成酶的作用下,通过复杂的40步反应也可以合成环孢菌素A。     

腾冲嗜热厌氧菌丙氨酸消旋酶底物通道氨基酸位点的功能

【目的】通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能。【方法】利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性及其稳定性。【结果】通过定点突变PCR成功得到8个突变体,酶学特性分析发现,A172位点突变为丝氨酸(S)后酶蛋白的相对活性有所提升,但含有该位点突变的酶蛋白稳定性均大幅下降;S173位点突变为天门冬氨酸(D)后导致突变体蛋白的最适反应温度提升了15°C,半衰期大幅延长,但相对活性明显下降。【结论】丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内A172和S173位点均是影响酶蛋白催化活性和稳定性的关键位点。     

通过易错PCR提高鼠伤寒沙门氏菌丙氨酸消旋酶催化活性

[目的] 通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性。[方法] 利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因alr_St的突变体文库,采用缺陷菌株UT5028筛选突变体基因,以D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性,通过凝胶过滤层析法分析酶蛋白寡聚化状态,并采用HPLC检测酶蛋白的动力学参数。[结果] 经过易错PCR及定点突变技术最终获得了3个催化活性有所提高的突变体A3V、Y343H和A3VY343H,酶学特性分析发现,与野生型蛋白StAlr相比,突变体Y343H仅对底物L/D-丝氨酸的催化效率略有提高,k_cat/K_m值分别是StAlr的2.01和3.68倍;而突变体A3V则对底物L/D-丙氨酸或L/D-丝氨酸的K_m、k_cat和k_cat/K_m值均有较大幅度的改变,其k_cat/K_m值分别是StAlr的105.51、97.36、4.63和10.73倍。凝胶过滤层析结果显示,突变体A3V在蛋白含量极低时就呈现出单体和二聚体共存状态,且随着蛋白含量的增加,其向二聚体状态迁移的速率最为明显。[结论] 丙氨酸消旋酶StAlr的第3位点是影响其催化活性和低聚合状态的关键位点。     

D-氨基酰化酶拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸

进行了以D,L-苯丙氨酸为原料经D-氨基酰化酶制备D-苯丙氨酸的研究。乙酰-D,L-苯丙氨酸浓度为0.5mol.L-1,给酶量为3×104U.L-1时,24 h拆分率可达到97%。采用阳离子交换树脂进行了拆分液中的D-苯丙氨酸的分离,D-苯丙氨酸的收率为95.4%。采用醋酸酐作为催化剂,在145℃的条件下,乙酰-L-苯丙氨酸可以消旋成乙酰-D,L-苯丙氨酸继续拆分。     

D-丝氨酸在神经元-胶质细胞间通讯的新进展

D-丝氨酸(D-Ser)是一种重要的胶质细胞递质,也是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR1亚基上"甘氨酸位点"的主要内源性配体,具有比甘氨酸更高的结合效能.D-Ser在体内主要由丝氨酸消旋酶将L-丝氨酸消旋而来,受多种因素调控,在中枢神经系统参与调节突触可塑性、感觉信息传递、神经发育及神经兴奋性毒性等生理及病理过程,并成为阿尔采末病(AD)等神经系统疾病新的治疗靶点.本文对D-Ser在中枢神经系统的产生、代谢、生理及病理作用的研究予以综述.     

Mn2+浓度对地衣芽孢杆菌产不同构型聚-γ-谷氨酸机理分析

【目的】分析Mn~(2+)对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)WBL-3产不同比例聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)的机理。【方法】以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)KH-2为对照菌株,克隆表达L-谷氨酸和D-谷氨酸代谢关键酶,分别为谷氨酸消旋酶(GR)、D-丙氨酸转氨酶(D-DDT)和谷氨酰胺合成酶(GS)。通过体外酶活实验与体内转录水平分析,初步探讨Mn~(2+)浓度对不同比例γ-PGA的生成机理。【结果】当Mn~(2+)浓度为0与0.6 mmol/L时,γ-D-PGA所占的比例分别为22%和67%。在0.6 mmol/L Mn~(2+)浓度下,B.licheniformis WBL-3中GR的催化活性(k_(cat)/K_m值)比未添加Mn~(2+)时高,GS只有在Mn~(2+)存在下才具有催化活性。实时荧光定量PCR结果表明,Mn~(2+)提高了GR、D-DDT和GS的转录水平,提高倍数分别为2.16、4.44和1.84倍。【结论】Mn~(2+)激活了GR、D-DDT与GS的表达,促进L-谷氨酸的代谢,使得菌体内D-谷氨酸比例升高,从而提高了γ-D-PGA的比例。     

酶法合成D-氨基酸的动向

<正> D-氨基酸近年来作为医药,农药,食品等的组成部分已在积极的开发。据载,山田,高桥等用酶法生产对羟基D-苯甘氨酸的工业研究是划时代的。最近,关于D-丙氨酸等各种D-型氨基酸酶法合成的报导已相继出现。这些方法大部分都是将现有的酶     

内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶不对称合成非天然手性D-氨基酸的研究进展

内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶不对称合成非天然的手性D-氨基酸是目前生物催化领域的研究热点。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶具有优良的立体选择性,利用其进行酶催化不对称合成光学纯的手性D-氨基酸,被广泛用于医药、食品、化妆品、精细化学品等领域。为了促进生物催化法在合成手性D-氨基酸方向的进一步发展,本文对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶催化合成D-氨基酸的现状进行了综述。重点介绍了Corynebacterium glutamicum、Ureibacillus thermosphaericus、Symbiobacterium thermophilum来源的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶在新酶的挖掘、催化性能、晶体结构解析、分子改造、功能与催化机制、合成D-氨基酸新途径等方面的研究进展,并对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的未来研究方向及策略进行了展望。本综述将进一步加深人们对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的认识,也为具有挑战性的生物合成任务提供信息借鉴。     

恶臭假单胞菌丙氨酸消旋酶基因的克隆、序列分析及表达

从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)200的基因组出发,用PCR方法克隆到两个独立作用的丙氨酸消旋酶基因,称之为dadX和alr。DadX编码357个氨基酸长的多肽,计算分子量为38.82kDa,alr编码409个氨基酸长的多肽,计算分子量为44.182kDa。序列分析显示,DadX的氨基酸序列与Pseudomonas putidaKT2440,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)的DadX比较,相似性分别为96.64%、71.99%、44.88%和47.37%。Alr的氨基酸序列与Pseudomonas putidaKT2440比较,同源性为94.38%,而与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)的Alr比较,同源性均较低,分别为22.89%、25.72%和26.44%。在P.putida200的DadX和Alr氨基酸序列中部发现有对于酶活性至关重要的保守区域,如磷酸吡哆醛(PLP)结合位点。DadX和alr在大肠杆菌中得到表达,DadX丙氨酸消旋酶只对丙氨酸有消旋作用,而Alr丙氨酸消旋酶可以作用于丙氨酸和丝氨酸两种底物,且对丝氨酸特异性更高。Alr的表达不依赖于外源启动子,说明在其结构基因上游存在启动子结构。     

黄曲酰化酶拆分酰化-DL-氨基酸及D型氨基酸的制备

<正> 酶是生物细胞合成的具有高效专一催化活力的一类特殊蛋白质。利用酶族中酰化酶拆分化学法合成或消旋的D L-氨基酸。可以得到纯的L型和D型的氨基酸。通常用于工业生产的酰化酶有猪肾酰化酶。淀粉酰化酶、黄曲酰化酶等。在拆分D L型甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、色氨酸、苄基丝氨酸等几十种氨基酸中,L型氨基酸产率为50～     

小鼠丝氨酸消旋酶的克隆、表达与纯化

丝氨酸消旋酶(Serine Racemase,SR)是一种磷酸吡多醛依赖酶,在ATP和Mg2+的辅助下,催化L型丝氨酸转变为D型丝氨酸,D-丝氨酸通过结合在NMDA受体的Gly结合位点,调节其生理功能。本文将小鼠来源的丝氨酸消旋酶基因克隆至原核表达载体pMAL-C2上,构建重组质粒pMAL-C2-SR。将重组质粒转入E.coil BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导,获得重组表达。重组蛋白带有MBP标签,经Amylose亲合柱和Sephacryl S-200纯化,获得电泳纯的目的蛋白。     

D-(-)-苯甘氨酸酶法制造工艺研究

<正> D-(-)-苯甘氨酸为半合成抗生素中用量最大的侧链化合物,其制造工艺有化学法和酶法两种。酶法工艺是八十年代新工艺,具有工艺简便、收率较高、生产周期短、原材料成本低等特点,尤为重要的是一酶多用,开发了制造中性D-氮基酸的工艺路线。为了研究酶法制造D-(-)-苯甘氨酸工艺,我们在筛选获得了D-乙内酰脲酶产生菌巨大芽孢杆菌SIPI-     

丙氨酸胁迫对拟南芥和烟草离体培养的影响

目的:筛选拟南芥和烟草种子离体培养的最佳培养基,并在最佳培养基下研究丙氨酸胁迫对其生长的影响.方法:在MS和1/2MS基本培养基中添加不同激素,筛选拟南芥和烟草种子的最适培养基配方,在最适培养基上加入不同浓度的D-和L-丙氨酸.结果与讨论:1/2NS不附加任何激素的基本培养基植株生长最好;D-丙氨酸对拟南芥生长有强烈抑制作用,L-丙氨酸则对生长无显著影响;D-型和L-型丙氨酸均对烟草有强烈抑制作用,这与经典的反馈抑制机理不很一致.     

酶和发酵工程

871532酶[专,英]//Taylor,S.C.//Eu-ropean Patont Appl.EP 879603.Pub。30.04.86.Appl.GBs427032,filed 25.10.54[译自CBA,1986,(7),2557] 描述了含有D-2-卤烷酸脱卤酶的细菌及其制剂。这种酶可用于提高2-卤烷酸外消旋混合物,例如2-澳或2-氯丙酸中L-对映体的浓度。