抗菌药物靶标丙氨酸消旋酶及其抑制剂研究进展

抗生素的滥用和人口的大量流动使得病原菌耐药性增强并与其他病原体产生共感染等问题,严重威胁人类的生命安全,因此,研发新型抗菌药物成为人类亟待解决的问题。丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶催化L-丙氨酸与D-丙氨酸旋光结构互换的一类异构酶,其消旋产物D-丙氨酸对细菌细胞壁的形成具有决定性作用,与细菌性疾病密切相关。抑制丙氨酸消旋酶的活性会影响细菌的生存,近年来成为设计抗菌药物的一个理想靶位,其抑制剂的开发已成为抗菌药物研发的热点。本文从丙氨酸消旋酶的来源、结构、功能、应用及抑制剂等方面进行系统阐述,并对丙氨酸消旋酶的研究提出新的策略,为进一步研究丙氨酸消旋酶与致病菌的关系及抗菌药物候选靶标的研究提供理论基础。     

3-(2-萘基)-D-丙氨酸的制备

<正> 在生物界已发现40多种D-氨基酸,其生理作用正为人们逐渐认识。例如D-A.1-a—D-A.1a二肽是各种致病菌细胞壁肽聚糖的组成部分,D-丙氨酸是由丙氨酸消旋酶对L-丙氨酸消旋而来。如果丙氨酸消旋酶的活性被仰制,断绝了D-丙氨酸的来源,细菌     

以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的抗结核药物筛选及其与D-环丝氨酸的共结晶

【目的】阐释结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶原有抑制剂D-环丝氨酸的作用机制,建立丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选模型,并用此模型筛选到新的抑制剂分子。【方法】将结核分枝杆菌中丙氨酸消旋酶基因克隆到pET-28a表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到可溶性的大量表达。表达后的蛋白质通过镍离子亲和层析和阴离子交换层析得到纯化,一方面将纯化后的蛋白和D-环丝氨酸共结晶以解析其抑制剂作用的分子机制。另一方面建立并优化丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选体系,用D-环丝氨酸验证体系的可行性并用该体系筛选本实验室药物库中的384种小分子片段、792种化合物及2 200种中药样品。【结果】得到的共晶晶体衍射能力2.50?,晶体空间群为P41212,晶胞参数a=b=163.92?,c=57.44?。结构分析表明,D-环丝氨酸进入活性位点之后与磷酸吡哆醛相互作用形成磷酸吡哆胺,使得磷酸吡哆醛的C4?原子与K42之间的相互作用被破坏,从而改变了结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性中心氢键网络。同时经D-环丝氨酸验证建立的抑制剂筛选体系可行,获得阳性化合物分子2个。【结论】依据我们所建立的高通量筛选体系可以有效地为结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶筛选到可信的抑制剂分子。     

丙氨酸消旋酶C-端结构域重组体的构建及其功能初探

【目的】将嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4DadX的N-端结构域分别与多个不同种属的丙氨酸消旋酶C-端结构域重组,探究丙氨酸消旋酶C-端结构域功能。【方法】利用基因拼接构建丙氨酸消旋酶重组基因,通过镍亲和层析纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测重组酶蛋白的酶学特性,借助分子筛和HPLC液相色谱分析其聚合状态及动力学参数。【结果】通过基因拼接构建了12个重组基因,经检测,表达、纯化获得的重组酶蛋白中只有OF4TtDadX240c具有催化活性,其活性仅为OF4DadX的60.54%,酶催化动力学结果显示OF4TtDadX240c催化反应速率Vmax/Km下降约10倍,但其稳定性大幅提高,半衰期比OF4DadX延长约5倍,耐热性提高较明显;聚合状态表明OF4DadX、OF4TMDadX226c和OF4TtDadX240c为二聚体结构,其他酶蛋白均为单体,但OF4TMDadX226c未检测到活性,推测可能是酶催化活性中心移位,未能形成质子转移而失去活性。【结论】丙氨酸消旋酶C-端折叠结构域对消旋酶低聚化、稳定性和酶催化功能具有重要作用。     

西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组来源的丙氨酸消旋酶的异源表达及性质研究

丙氨酸消旋酶是异构酶家族中一类重要的酶,既能作为新型抗菌药物筛选的靶标,又是酶法合成D-氨基酸的关键酶之一,有巨大的研究价值.[目的]为挖掘动物胃肠道中未培养微生物的丙氨酸消旋酶基因资源,探究不同微生物来源丙氨酸消旋酶基因及其酶的功能和性质.[方法]本研究从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组出发,基于序列分析和基因功能注释...     

内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶不对称合成非天然手性D-氨基酸的研究进展

内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶不对称合成非天然的手性D-氨基酸是目前生物催化领域的研究热点。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶具有优良的立体选择性,利用其进行酶催化不对称合成光学纯的手性D-氨基酸,被广泛用于医药、食品、化妆品、精细化学品等领域。为了促进生物催化法在合成手性D-氨基酸方向的进一步发展,本文对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶催化合成D-氨基酸的现状进行了综述。重点介绍了Corynebacterium glutamicum、Ureibacillus thermosphaericus、Symbiobacterium thermophilum来源的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶在新酶的挖掘、催化性能、晶体结构解析、分子改造、功能与催化机制、合成D-氨基酸新途径等方面的研究进展,并对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的未来研究方向及策略进行了展望。本综述将进一步加深人们对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的认识,也为具有挑战性的生物合成任务提供信息借鉴。     

不同D/L单体比γ-聚谷氨酸的合成与调控

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由L-谷氨酸和/或D-谷氨酸聚合而成的一种聚氨基酸,广泛应用于化妆品、医药等领域。高聚物单体的立体构型会影响产品性质和应用,因此调控γ-PGA中D-谷氨酸/L-谷氨酸单体比(D/L单体比)具有重要意义。前期以谷氨酸棒杆菌为底盘,表达来自于地衣芽孢杆菌的γ-PGA合成酶,合成以L-Glu(97.10%)为主的γ-PGA。通过外源添加不同浓度D-谷氨酸,合成了D-谷氨酸占比为15.71%~33.52%的γ-PGA。然后,在重组菌中表达来自于枯草芽孢杆菌的谷氨酸消旋酶,并使用三个不同强度RBS调控其表达水平,合成D-谷氨酸占比30.82%~34.59%的γ-PGA,但调控范围较窄。利用四个不同强度启动子调控谷氨酸消旋酶表达水平,扩大D/L单体比可调范围,合成D-Glu占比32.71%~52.53%的γ-PGA。提供一种理性调控γ-PGA的D/L单体比策略,实现了D-谷氨酸占比为2.90%~52.53%的γ-PGA的合成,为高效合成不同D/L单体比γ-PGA提供了基础。     

脂肪酶活性和选择性受溶剂不同物化参数控制

采用假单胞菌脂肪酶在不同溶剂中催化辛酸与外消旋２－辛醇间的不对称酯合成反应时发现,酶的催化活性和对映选择性分别受溶剂不同物化参数的影响。前乾与溶剂疏水性有较发孤相关关系;而后者与介电常数和偶极矩关联较好。通过反动力学研究和由此提出孤脂麦活性中心结构模型对上述现象作了合理的解释。     

嗜热丁烷氧化古菌Candidatus Syntrophoarchaeum烷基转移酶MtaA催化丁基辅酶M的分子机制研究

【背景】嗜热古菌Candidatus Syntrophoarchaeum可以与硫酸盐还原细菌共生,通过逆转产甲烷途径进行正丁烷的氧化,但在该过程中负责催化丁基辅酶M氧化的酶尚未确定。【目的】利用分子动力学模拟证明Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白可以特异性催化丁基辅酶M中丁基的转移,并非转移甲基。【方法】使用Methanosarcina mazei辅酶M甲基转移酶Mta A的晶体结构(PDB ID:4ay8)作为模板,对Mta A_1 (Gen Bank登录号OFV65993.1)和Mta A_2 (Gen Bank登录号OFV65678.1)进行同源建模。使用分子对接得到两者分别结合CH_3-Co M和C_4H_9-Co M时的结构,并用AMBER18进行分子动力学模拟。【结果】当Mta A_1和Mta A_2分别结合C_4H_9-Co M时,表现出与4ay8晶体结构类似的TIM-Barrel折叠三维结构,但在活性中心形状、Zn~(2+)与底物距离以及活性位点附近氨基酸配位方式等方面存在差异,这可能是导致Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白催化丁基辅酶M氧化的原因。其中Mta A_2与4ay8结构更相似,活性中心氨基酸配位更完整,暗示其更可能具备催化活性。然而当Mta A_1和Mta A_2分别结合CH_3-Co M时,整体结构不合实际,活性中心Zn~(2+)与底物距离过远,表明底物几乎不可能与酶结合。【结论】Ca.Syntrophoarchaeum中的Mta A_1和Mta A_2很可能是特异性的丁基转移酶,而非催化甲基的转移,其中Mta A_2具备活性的可能性更高。     

产甲烷古菌铁氢酶研究进展

根据活性中心金属原子的不同,氢酶主要分为镍铁、铁铁、铁氢酶三大类。铁氢酶是发现较晚、存在物种单一且结构较为特殊的一类氢酶。目前,铁氢酶仅发现于氢营养型产甲烷古菌中。该酶直接催化氢气异裂,还原产甲烷代谢途径中一碳载体四氢蝶呤的次甲基转化为亚甲基。与其他两类氢酶相比,铁氢酶不含传递电子的铁硫簇和双金属活性中心,在结构组成上有较大的差异。此外,铁氢酶活性中心的吡啶环被高度取代,活性中心铁原子直接与酰基碳成键,这些奇特的活性分子结构预示着氢酶全新的催化机制,以及古菌细胞在合成特殊结构大分子方面的特殊功能。本文总结了从1990年发现这类新型氢酶以来的相关研究,分别从氢酶的生理功能、结构特征、催化机制、成熟过程及应用研究等方面阐述铁氢酶的研究进展。     

环孢菌素A的研究进展及应用

环孢菌素A是从真菌中提取的一种新型免疫抑制剂,可选择性作用于T细胞,抑制其活化,现主要应用于器官移植时的排斥反应。工业上多以真菌孢子为原料,发酵生产进而分离纯化的方法得到环孢菌素A,以D-丙氨酸作为底物,在丙氨酸消旋酶和环孢菌素合成酶的作用下,通过复杂的40步反应也可以合成环孢菌素A。     

小鼠丝氨酸消旋酶的克隆、表达与纯化

丝氨酸消旋酶(Serine Racemase,SR)是一种磷酸吡多醛依赖酶,在ATP和Mg2+的辅助下,催化L型丝氨酸转变为D型丝氨酸,D-丝氨酸通过结合在NMDA受体的Gly结合位点,调节其生理功能。本文将小鼠来源的丝氨酸消旋酶基因克隆至原核表达载体pMAL-C2上,构建重组质粒pMAL-C2-SR。将重组质粒转入E.coil BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导,获得重组表达。重组蛋白带有MBP标签,经Amylose亲合柱和Sephacryl S-200纯化,获得电泳纯的目的蛋白。     

荧光假单胞菌TM5-2中D-型氨基酸脱氢酶的鉴定和表达

从荧光假单胞菌TM5-2中得到一个含丙氨酸消旋酶基因的DNA片段(8.8kb),相邻的一个开读框(ORF)与甘氨酸/D-型氨基酸氧化酶基因相似。该ORF经过克隆、表达,并没有检测到甘氨酸/D-型氨基酸氧化酶的活性,推导而得的氨基酸序列与D-型氨基酸脱氢酶序列比较发现,ORF含有D-型氨基酸脱氢酶的所有重要的保守序列。经TTC培养基鉴定,其具有D-型氨基酸脱氢酶的活性,并对一系列D-型氨基酸有作用,最佳作用底物是D-组氨酸。     

恶臭假单胞菌丙氨酸消旋酶基因的克隆、序列分析及表达

从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)200的基因组出发,用PCR方法克隆到两个独立作用的丙氨酸消旋酶基因,称之为dadX和alr。DadX编码357个氨基酸长的多肽,计算分子量为38.82kDa,alr编码409个氨基酸长的多肽,计算分子量为44.182kDa。序列分析显示,DadX的氨基酸序列与Pseudomonas putidaKT2440,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)的DadX比较,相似性分别为96.64%、71.99%、44.88%和47.37%。Alr的氨基酸序列与Pseudomonas putidaKT2440比较,同源性为94.38%,而与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)的Alr比较,同源性均较低,分别为22.89%、25.72%和26.44%。在P.putida200的DadX和Alr氨基酸序列中部发现有对于酶活性至关重要的保守区域,如磷酸吡哆醛(PLP)结合位点。DadX和alr在大肠杆菌中得到表达,DadX丙氨酸消旋酶只对丙氨酸有消旋作用,而Alr丙氨酸消旋酶可以作用于丙氨酸和丝氨酸两种底物,且对丝氨酸特异性更高。Alr的表达不依赖于外源启动子,说明在其结构基因上游存在启动子结构。     

丙氨酸脱氢酶研究概况

丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase,ALD,EC 1.4.1.1)是一种以烟酰胺腺嘌呤(NAD)为辅酶的氨基酸脱氢酶.丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸、氨及NADH.丙氨酸脱氢酶也是调节氨基酸代谢和糖代谢的重要酶类,其催化反应的产物丙酮酸广泛应用于医药、农药和食品等领域,具有良好的发展前景.主要介绍丙氨酸脱氢酶的纯化及活力检测、酶空间结构(底物结合住点),以及催化反应机理等方面的研究.     

酶和发酵工程

871532酶[专,英]//Taylor,S.C.//Eu-ropean Patont Appl.EP 879603.Pub。30.04.86.Appl.GBs427032,filed 25.10.54[译自CBA,1986,(7),2557] 描述了含有D-2-卤烷酸脱卤酶的细菌及其制剂。这种酶可用于提高2-卤烷酸外消旋混合物,例如2-澳或2-氯丙酸中L-对映体的浓度。     

酶法拆分手性化合物HPBE

R-HPBE(2-羟基4苯基丁酸乙酯)是一种重要的医药中间体,可以通过脂肪酶催化水解外消旋体得到。介绍了此催化过程的机理、工艺、产物检测等,并通过酶在疏水载体上的界面吸附对酶进行固定化,以提高酶活及对映选择性。     

通过易错PCR提高鼠伤寒沙门氏菌丙氨酸消旋酶催化活性

[目的] 通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性。[方法] 利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因alr_St的突变体文库,采用缺陷菌株UT5028筛选突变体基因,以D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性,通过凝胶过滤层析法分析酶蛋白寡聚化状态,并采用HPLC检测酶蛋白的动力学参数。[结果] 经过易错PCR及定点突变技术最终获得了3个催化活性有所提高的突变体A3V、Y343H和A3VY343H,酶学特性分析发现,与野生型蛋白StAlr相比,突变体Y343H仅对底物L/D-丝氨酸的催化效率略有提高,k_cat/K_m值分别是StAlr的2.01和3.68倍;而突变体A3V则对底物L/D-丙氨酸或L/D-丝氨酸的K_m、k_cat和k_cat/K_m值均有较大幅度的改变,其k_cat/K_m值分别是StAlr的105.51、97.36、4.63和10.73倍。凝胶过滤层析结果显示,突变体A3V在蛋白含量极低时就呈现出单体和二聚体共存状态,且随着蛋白含量的增加,其向二聚体状态迁移的速率最为明显。[结论] 丙氨酸消旋酶StAlr的第3位点是影响其催化活性和低聚合状态的关键位点。     

乙内酰脲酶及其在氨基酸手性合成中的应用

乙内酰脲水解酶、氨甲酰化酶和乙内酰脲消旋酶构成的酶系能够以5-取代乙内酰脲类化合物为原料合成天然和非天然D-或L-氨基酸,用于各种手性氧基酸的生产。近来的研究重点在分离新酶或提高原酶的活性,包括定向突变、三维结构解析与结构功能关系研究、酶固定化、蛋白融合和构建完整细胞生物催化剂等。     

单功能过氧化氢酶的高级结构

单功能过氧化氢酶是在生物界广泛分布的抗氧化酶.近年来,人们在对单功能过氧化氢酶一级结构与生化性质深入研究的基础上,针对十几种单功能过氧化氢酶的高度保守的空间结构开展了研究.认识了其活性中心的血红素及周围保守残基,发现了酶的许多特殊结构,如方向不同的血红素,增强酶抗氧化性的侧链残基的共价键和保证酶高效催化的分子内通道等.本文综述了单功能过氧化氢酶空间结构研究现状,概括了酶构象的基本特点,分析了关注和争议较多的酶血红素、肽链侧链共价键及酶分子内通道等重点问题.深入研究单功能过氧化氢酶空间结构是一挑战性的课题,它将推动酶蛋白高级结构形成和酶催化模式等基础理论研究.