E型肉毒神经毒素(BoNT)基因序列分析及其B细胞表位预测

目的：分析不同E型肉毒梭菌的肉毒神经毒素（BoNT）基因序列的同源性，预测E型BoNT的B细胞表位。方法：用LaserGene软件中的MegAlign程序比对GenBank中5株不同E型肉毒梭菌的BoNT基因序列；分别利用BioSun和LaserGene软件分析E型BoNT的表位参数、蛋白质二级结构及氨基酸序列保守性，利用三维结构显示软件Cn3D，分析E型BoNT可能的B细胞表位的空间定位，进而预测E型BoNT的B细胞表位。结果：5个E型BoNT基因核酸序列同源性为97．2％-100％，氨基酸序列同源性为95％-100％；E型BoNT轻链中的62-78，111-127区段，重链中443-465，661-677，693～709，727-743，853-869，1093-1109，1128-1144，1163-1179区段最有可能是其B细胞优势表位。结论：我们利用不同分析软件，结合多参数综合预测出了E型BoNT的多个B细胞表位，为进一步鉴定E型BoNer的B细胞表位及其多表位疫苗的研究奠定了基础。     

重组肉毒毒素B重链结合区片段的表达、纯化及其抗原性分析

目的：克隆、表达并纯化肉毒毒素B重链结合区C端（BoNT/B Hc）保护性抗原片段.方法：采用PCR扩增BoNT/B Hc基因,插入表达载体pET-His,转化E.coli BL21（pLys）细胞获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化.利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT/B Hc的抗原性.结果：表达工程菌BL21/pETHis-BHc于37℃经0.2 mmol/L IPTG诱导6 h后,目的蛋白获得高表达,约占菌体总蛋白的24%.经过Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,rBoNT/B Hc的纯度可达96%以上.Western印迹和间接ELISA均显示其具有良好的抗原性.结论：成功克隆、表达并纯化了BoNT/B Hc片段,并可被抗天然BoNT/B马血清所识别,为建立快速检测方法和制备相应的抗体及亚单位疫苗奠定了基础.     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

重组肉毒神经毒素A轻链(BoNT/A LC)蛋白的表达、纯化与鉴定

目的：克隆、表达并纯化肉毒神经毒素A轻链(BoNT／ALC)片段，为BoNT／A的抗体制备和检测方法的建立奠定基础。方法：以PCR方法自肉毒梭菌中扩增BoNT／A轻链基因，直接插入pGEM—T载体，测序正确后再与表达载体pET21a构建重组表达栽体pET21a-轻链，转化E.coli BL21(pLys)感受态细胞获得表达工程菌株并进行诱导表达，用Western印迹鉴定重组：BoNT／A轻链。结果：经PCR获得的：BoNT／A轻链序列与GenBank中的BoNT／A轻链基因序列的一致性达99．9％以上。表达工程菌BL21／pET21a—A LC于37℃：经0.7mmol／LIPm诱导6h，目的蛋白获得高表达，约占菌体总蛋白的23％。经过镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析一步纯化，重组BoNT／A轻链的纯度可达97％以上。Western印迹结果表明，重组BoNT／A轻链与抗天然：BoNT／A的马血清发生特异性的抗原抗体结合反应。结论：成功克隆、表达并纯化了：BoNT／A轻链片段，其抗原性良好。     

A型肉毒毒素轻链多步纯化及其金属蛋白酶活性研究

目的：利用基因工程方法原核表达N－His标签的A型肉毒毒素轻链（ BoNT－ALC）蛋白,多步纯化获得高纯度蛋白,并对其金属蛋白酶活性进行鉴定。方法以A型肉毒毒素为模板,构建重组表达载体pET22b－ALC,转化BL21（DE3）,诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化、阴离子交换以及分子筛纯化获取高纯度目的蛋白;通过体外切割特异性底物SNAP－25实验进行酶活性研究。结果与结论获得高纯度的BoNT－ALC蛋白,对金属蛋白酶活性进行了验证。该纯化方法获得的蛋白纯度高、均一性好,且具有很好的酶活性,为后续研究奠定了基础。     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的 从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(BoNT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成BoNT/A LC序列,克隆至pTIG质粒,转化BL21(DE3) plysS感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经“吸附-洗脱-扩增”程序淘选富集抗体并进行特异性筛选.PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性.结果 可溶性表达的BoNT/A LC占全菌蛋白的36.8％,纯化后蛋白纯度达99％.从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合BoNT/A LC蛋白.结论 该研究得到了两株特异性的BoNT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗.     

重组肉毒毒素E(BoNT/E)重链C端的表达、纯化及其抗原性分析

目的：克隆、表达并纯化肉毒毒素E重链C端(BoNT／EHC2)保护性抗原片段，为BoNT／E的抗体制备和检测方法的建立奠定基础。方法：采用PCR扩增BoNT／EHc2基因，插入表达载体pET28a，转化E．coli BL2l(DE3)pLysS获得表达工程菌株，并对诱导表达条件和纯化条件进行优化。利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT／EHc2的抗原性。结果：表达工程菌pEq28a-EHC2／BL21(DE3)pLysS于37℃用0．2mmol／L IPTG诱导6h，表达的目的蛋白可以达到全茵蛋白的37．9％。经过固定化金属螯合亲和层析一步纯化，rBoNT／EHC2的纯度可达95％以上。Western印迹和间接ELISA显示其具有良好的抗原性。结论：首次克隆、表达并纯化了BoNT／EHC2片段，并可被抗天然BoNT／E马血清所识别，为制备相应的抗体及建立快速检测方法做好了准备。     

SNAP-25基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：构建SNAP-25基因的原核表达载体pET22b—SNAP-25,对表达产物活性进行初步鉴定。方法：根据GenBank中已报道的SNAP-25基因序列,设计特异引物,通过RT—PCR从小鼠全脑组织总RNA中得到基因。将全长基因克隆至原核表达载体pET22b中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli如BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物经Ni—NTA亲和层析进行纯化。通过SDS-PAGE和免疫印迹对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析。结果与结论：成功构建了原核表达载体pET22b—SNAP-25,Western印迹证实重组蛋白获得表达。表达的重组蛋白与A型肉毒毒素混合反应,经SDS—PAGE验证,重组蛋白具有被毒素特异性切割的活性。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

重组梅毒螺旋体表位抗原及多表位嵌合抗原研究

目的 :为梅毒检测试剂提供抗原性强、特异性高的重组表位抗原和多表位嵌合抗原。方法 :对梅毒螺旋体的主要抗原蛋白TpN15 ,TpN17,TpN44 .5和TpN47的优势抗原表位进行计算机分析 ,从中选取具有强抗原性的表位。根据大肠杆菌的偏性密码子 ,推断出这些抗原表位的基因序列 ,采用化学合成法合成表位抗原基因并克隆表达。结果 :获得了梅毒各抗原蛋白的优势抗原表位 ,构建了各表位基因及多表位嵌合基因的表达质粒 ,在E .coli中获得了高效表达。用获得的重组蛋白质纯品 ,对 12 2份心磷脂测定阳性血清样品进行测定 ,证明重组梅毒表位抗原和多表位嵌合抗原具有预期的抗原活性。结论 :重组梅毒表位抗原及多表位嵌合抗原具有较好的抗原活性 ,可用于研究不同类型的梅毒检测试剂     

乙型肝炎病毒多表位嵌合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的：构建含乙肝病毒表达抗原前S1，S2（HBV preS1,preS2)优势B细胞表位与乙肝病毒核心抗原（HBcAg)的嵌合蛋白，探索其作为兼具预防和治疗HBV感染作用的新型疫苗的可能性。方法：利用分子克隆技术先后将HBV preS1(21-47AA.),preS2(133-145AA.)表位基因插入HBcAg基因中，得到HBV C144，CS1，CS1S2融合基因，分别克隆到原核表达载体pQE-30中，大肠杆菌（E.coli)M15中进行表达，用Ni^2 固相化的螯合Sepharose Fast Flow亲和层析纯化重组蛋白，最后进行抗原性的鉴定。结果：构建了HBV嵌合型颗粒蛋白表达载体，并在E.coli中高效表达出可溶性病毒样颗粒蛋白C144,CS1,CS1S2，经Ni-NTA亲和层析 化后，蛋白纯度达80％,Western印迹及ELISA证明蛋白各表位都具有抗原性。结论：本研究为进一步深入研究新型HBV治疗性疫苗的功能和应用奠定了基础。     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反     

纤连蛋白的分段表达及与乙肝表面抗原相互作用研究

目的:克隆纤连蛋白(fibronectin)各功能区域基因,在大肠杆菌中表达以筛选与HBsAg相互作用的区域.方法:将纤连蛋白分成7个片段,设计引物,利用RT-PCR从HepG2.2.15中扩增出相应的PCR产物,连接到表达载体pGEX4T-1中,用IPTG诱导目的蛋白在E.coli中表达,通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定.融合蛋白纯化后制备蛋白芯片,与HBsAg杂交,筛选纤连蛋白中与HBsAg相互作用的区域.结果:经RT-PCR从HepG2.2.15中扩增到各结构域片段的cDNA,序列分析均正确;SDS-PAGE分析表明,各结构域片段的可溶性表达产物均占细菌可溶性蛋白的10%以上;Western印迹分析提示,诱导表达产物可与GST单抗发生特异性反应.经制备蛋白芯片并杂交,发现片段FN1、FN2信号最强.结论:成功地表达了纤连蛋白各片段,蛋白芯片杂交结果显示纤连蛋白可能是通过Ⅱ型肝素结合区及其羰基端(c端)与HBsAg相互作用.     

抗结肠癌抗体Fab片段在大肠杆菌中的表达

目的：大肠杆菌中表达抗结肠癌抗体Ｆａｂ片段,比较表达产物和原杂交瘤单克隆抗体的抗原结合特性,方法：以ＤＮＡ重组法的构建重组表达质粒,在大肠杆菌中进行表达,对表达产物包涵体进行复性,用ＥＬＩＳＡ法和ＳＡＢＣ法测定复性产物的抗原结合特性。结果：构建了抗结肠癌相关抗原抗体Ｆａｂ片段的重组表达质粒ｐＧＬ４,在大肠杆菌ＪＭ８３中获得表达,表达Ｆａｂ片段占全菌蛋白的２１％,主要以包涵体形式存在,对包涵体进行分