TGF-β1缓释载体体外构建组织工程软骨

目的制备负载TGF—β1壳聚糖缓释微球的三维多孔壳聚糖支架，检测TGF—β1缓释载体对软骨细胞功能的影响．方法乳化交联法制备TGF—β1壳聚糖缓释微球并将其与壳聚糖支架复合，检测其体外降解并通过ELISA法检测微球的载药、释药性能。将软骨细胞置于复合载体中立体培养，通过苏木素伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、扫描电镜观察复合载体对细胞的增殖、功能的影响。结果缓释微球的TGF—β1包封率达90．1％，并具有良好的药物缓释性能，软骨细胞在复合载体中增殖良好，并能够保持其表型及Ⅱ型胶原分泌功能。结论负载TGF—β1壳聚糖缓释微球的壳聚糖支架作为软骨细胞的载体在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用前景。     

诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的体外研究

目的 探讨转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor1，IGF-1）在诱导骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem ceils，MSCs）向软骨细胞分化过程中的相互作用，并研究细胞密度对MSCs向软骨细胞分化的影响。方法 取健康昆明种小白鼠骨髓，用全骨髓贴壁法筛选获得MSCs，体外培养传代。采用特定的诱导培养使MSCs向软骨细胞分化，按培养基内添加生长因子的不同分成3个实验组和对照组。实验组分别为：TGF—β1＋IGF-1联合应用组（TGF—β1 10ng／ml、IGF-1 50ng／m1）；TGF—β1单独应用组（TGF—β1 10ng／m1）；IGF-1单独应用组（IGF-1 50ng／m1）；对照组不添加任何生长因子。TGF—β1＋IGF-1联合应用组于诱导14d和21d，分别进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光双染法鉴定；于诱导7、14和21d各组分别提取诱导细胞总RNA，进行RT—PCR扩增，检测TGF—β1、IGF-1对诱导细胞Ⅱ型胶原表达量的影响；比较MSCs在平板培养及细胞团培养时，Ⅱ型胶原表达量的差异。结果TGF—β1＋IGF-1联合应用组诱导培养14d，诱导软骨细胞甲苯胺蓝染色呈阳性，免疫荧光染色可见诱导软骨细胞的细胞外基质含有Ⅱ型胶原。各组基因扩增产物的凝胶电泳可见，TGF—β1＋IGF-1联合应用组和TGF—β1单独应用组Ⅱ型胶原扩增片段呈阳性；IGF-1单独应用组和对照组，未见Ⅱ型胶原扩增条带；凝胶成像系统灰度扫描示Ⅱ型胶原表达量TGF—β1＋IGF-1联合应用组各时间点均比TGF—β1单独应用组明显增加（P〈0．05）。细胞团培养模式下，诱导细胞表达Ⅱ型胶原比平板培养模式更加显著。结论 MSCs向软骨细胞诱导分化时，IGF-1对TGF—β1有明显的促进作用；细胞培养密度提高有利于MSCs成软骨细胞表型。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的 体外诱导犬骨髓基质干细胞(BMSCs)定向分化为软骨细胞，探讨体外诱导成软骨的方法和条件。方法 自犬肋骨取骨髓2～3ml，体外行原代和传代培养扩增，顺序加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)，以培养瓶内较高细胞浓度培养，诱导BMSCs分化为软骨细胞。甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果 诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性；Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论 应用bFGF和TGF-β1体外可以诱导犬BMSCs分化为软骨细胞，诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞在β3转化生长因子联合胰岛素样生长因子-1定向诱导下的软骨组织工程

目的探讨β3转化生长因子（TGF-β3）在诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向软骨细胞分化中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的作用以及在软骨组织工程中的应用。方法在体外用TGF—β3或（和）IGF-1诱导藻酸钠微球中的MSCs向软骨细胞定向分化,免疫组织化学、逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达,Western印迹法检测Sox9蛋白的表达,激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察该软骨细胞在壳聚糖支架上的生长。结果TGF-β3。能诱导藻酸钠微球中的MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox9,IGF-1能显著性地增强这种作用（P〈0．05）。Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox9之间的相关系数分别为0．95和0．91。诱导的软骨细胞能在壳聚糖支架上黏附、迁徙、增殖。结论在TGF-β3诱导MSCs分化成软骨细胞地过程中,IGF-1可能通过促进Sox9的表达起到协同作用。诱导分化后的软骨细胞与壳聚糖复合支架表现出良好的组织相容性。     

骨髓基质干细胞修复软骨缺损的实验研究

[目的]探寻体外诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，寻求体内修复家兔软骨缺损的最为有效方案。[方法]rhFGF1、rhTGF-β1、rhIGF-1单独或联合应用对骨髓基质干细胞进行体外诱导培养，应用常规染色、MTT、免疫组织化学染色的方法筛选诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，并将其与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物，直接种植到兔膝关节实验性关节软骨缺损处，并与对照组相比较，观察软骨修复效果。[结果]常规形态学观察，rhTGF-β1和rhIGF-1联合应用诱导的细胞在形态上类似于软骨细胞，免疫组化染色提示诱导细胞具有软骨细胞表型。凝胶复合物直接种植在体内能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，修复缺损的软骨，缺少细胞因子的对照组软骨缺损修复效果差。[结论]rhTGF-β1和rhIGF-1联合应用可作为诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的最佳组合，骨髓基质干细胞凝胶复合物能修复软骨缺损。     

地塞米松与TGF β1对骨髓基质细胞增殖、分化及代谢的影响

目的明确地塞米松与转化生长因子β1对骨髓基质细胞增殖代谢及向软骨细胞分化的影响,为应用骨髓基质细胞构建组织工程化软骨提供技术参数.方法抽取猪股骨骨髓,分离有核细胞,体外培养扩增并分别加入地塞米松(40 ng/ml)或地塞米松(40 ng/ml)与转化生长因子β1 (10 ng/ml)联合诱导.通过细胞计数及MTT法检测不同诱导因子对骨髓基质细胞增殖的影响,透射电镜观察不同诱导组细胞代谢功能的变化,免疫组化、原位杂交、RT-PCR及Northern blott等检测Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达量的差异.结果加入地塞米松后细胞增殖能力受到轻度抑制,而同时加入地塞米松与转化生长因子β1后,细胞生长明显受抑制.电镜下可见随诱导因子的增加,细胞变得肥大,细胞器丰富,功能活跃.Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达在联合诱导组明显增强,且随诱导时间的延长,Ⅱ型胶原mRNA表达量也显著增加(P＜0.01).结论地塞米松与转化生长因子β1能有效地诱导骨髓基质细胞表达软骨细胞特征性蛋白,但对细胞的增殖及代谢也产生明显的影响,在骨髓基质细胞构建组织工程化软骨时,应充分调整好诱导与增殖的关系.     

诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型

目的：诱免骨髓间充质干细胞达软骨细胞表型，方法：抽取兔骨髓，经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs，用生长因子诱导，考察细胞软骨骨特异性基质的表达水平，结果：TGF－β1，IGF－I和维生素C结合可促进MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA，但并未促进成骨特异性的碱生磷酸酶合成和钙盐沉积。结论：TGF－β1，IGF－I和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖，表达软骨细胞表型，而不产生诱导成骨效应。     

兔骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原表达的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原的实验研究方法。方法利用β1转化生长因子腺病毒表达载体（Ad—TGFβ1）转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），观察转染后的Ⅱ型胶原表达。结果细胞转染后Ⅱ型胶原在免疫印记和免疫组化检测下均呈强阳性表达。结论Ad—TGFβI转染兔骨髓MSCs可使其细胞内Ⅱ型胶原表达阳性。     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

地塞米松与TGFβ1对骨髓基质细胞增殖、分化及代谢的影响

目的　明确地塞米松与转化生长因子 β1对骨髓基质细胞增殖代谢及向软骨细胞分化的影响 ,为应用骨髓基质细胞构建组织工程化软骨提供技术参数。方法　抽取猪股骨骨髓 ,分离有核细胞 ,体外培养扩增并分别加入地塞米松 (40ng/ml)或地塞米松 (40ng/ml)与转化生长因子β1(10ng/ml)联合诱导。通过细胞计数及MTT法检测不同诱导因子对骨髓基质细胞增殖的影响 ,透射电镜观察不同诱导组细胞代谢功能的变化 ,免疫组化、原位杂交、RT -PCR及Northernblott等检测Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达量的差异。结果　加入地塞米松后细胞增殖能力受到轻度抑制 ,而同时加入地塞米松与转化生长因子 β1后 ,细胞生长明显受抑制。电镜下可见随诱导因子的增加 ,细胞变得肥大 ,细胞器丰富 ,功能活跃。Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达在联合诱导组明显增强 ,且随诱导时间的延长 ,Ⅱ型胶原mRNA表达量也显著增加 (P <0 .0 1)。结论　地塞米松与转化生长因子β1能有效地诱导骨髓基质细胞表达软骨细胞特征性蛋白 ,但对细胞的增殖及代谢也产生明显的影响 ,在骨髓基质细胞构建组织工程化软骨时 ,应充分调整好诱导与增殖的关系     

骨髓间充质干细胞体外定向软骨细胞分化的研究

目的　研究体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养条件下定向软骨细胞分化的情况。方法　取兔髂骨骨髓 ,分离培养骨髓间充质干细胞 ,传代后以高糖DMEM无血清特定培养诱导 (转化生长因子 β1 2 0ug L ,地塞米松10 7mmol L ,维生素C 5 0ug L) ,细胞 爬片甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖 ,免疫细胞化学染色法检测Ⅱ胶原 ,S 10 0蛋白分泌 ,常规培养的细胞作为对照组。结果　骨髓间充质干细胞经特定培养条件诱导第 14 ,2 1,2 8天甲苯胺蓝染色呈明显异染 ,Ⅱ胶原 ,S 10 0蛋白免疫细胞化学染色阳性 ,第 7天及对照组阴性。结论　骨髓间充质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞 ,在体外培养可定向分化为软骨细胞 ,并能分泌软骨特异性基质。     

转化生长因子明胶微球制备及体外缓释研究

目的: 研制转化生长因子β1 (TGFβ1 ) 缓释明胶微球, 探索将微球药物控释系统引入组织工程学领域的可行性。方法: 采用改良的双相乳化冷凝聚合法制备明胶微球, 将其与TGFβ1 复合, 观察微球分散度、粒径及外观形态; 计算微球包封率、载药率及体外释药特性;分别使用缓释微球、诱导液 (含TGFβ1 4. 5ng/ml) 诱导兔骨髓间充质干细胞 (MSCs) 6d, 免疫组化检测Ⅱ型胶原、S 100蛋白表达。结果: 微球大小均匀, 平均直径 ( 15. 1±3. 4 )μ, 载药量为 900ng/g, 包封率为90. 0%, 体外 7d内药物缓释 92%; 缓释微球可持续释放具有生物活性的TGFβ1 诱导MSCs, 6d后细胞Ⅱ型胶原、S 100蛋白免疫组化染色阳性, 而诱导液组Ⅱ型胶原、S 100蛋白免疫组化染色阴性。结论: TGFβ1 明胶微球具有良好的药物缓释功能, 体外可持续诱导MSCs向软骨细胞分化, 维持细胞表型。为软骨组织工程中生长因子能够持续高效发挥作用提供一种新途径。     

软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨

[目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察.[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架.通过扣描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性.将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况.[结果]软骨细胞外基质/壳聚精复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性.诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好.[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体.     

RhoA/ROCK通路在转化生长因子-β1诱导骨髓基质干细胞向软骨分化中的作用

目的 探讨RhoA／ROCK信号通路在转化生长因子-β1（TGF-β1）体外诱导骨髓基质干细胞（BMSCs）向成软骨细胞表型分化过程中的表达及作用。方法 由小鼠骨髓中分离出BMSCs，体外传代培养，取第3代细胞通过TGF-β1诱导向软骨细胞分化。采用Western-blot和RT-PCR方法分别检测RhoA和ROCK1／2、Ⅱ型胶原在细胞分化过程中的表达及应用Rho激酶抑制剂Y27632后的表达。结果 RhoA和ROCK1／2在分化过程中均有表达。Rho激酶抑制剂Y27632导致诱导后成软骨细胞相关的Ⅱ型胶原表达减少。结论 RhoA／ROCK信号通路可能在BMSCs分化为软骨细胞过程中起着重要调控作用。     

尼古丁对兔骨髓基质干细胞增殖及向软骨细胞方向分化的影响

目的：探讨不同浓度尼古丁对单层培养的骨髓基质干细胞及向软骨方向分化的影响。方法：获取兔骨髓基质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞,加入不同浓度（0、1×10。、l×10。、1X10。M）的尼古丁,分别于1、4、7、14d用MTT法检测其对骨髓基质干细胞增殖的影响。取第3代细胞进行诱导分化,用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）法检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达。结果：镜下见细胞形态由圆形向梭形转化;1x100、1×10M尼古丁浓度能够促进骨髓基质干细胞的增殖,1×10。M尼古丁则会抑制骨髓基质干细胞的增殖活性。1×10^-7、1×10^-6M（特别是1×10。M）的尼古丁能够增加诱导后Ⅱ型胶原的表达,并随时间延长而增加。而1×10。M尼古丁在第7天时能促进诱导后蛋白聚糖的表达,1X10。M尼古丁则能抑制Ⅱ型胶原及蛋白聚糖mRNA表达。结论：低浓度的尼古丁能够促进骨髓基质干细胞的增殖及向软骨细胞方向分化,高浓度的尼古丁则对其有抑制作用,由此推测在软骨组织工程中,局部话时i舌号柏府厍I．f芦．士丁暑一种能白骞俚{井骨唇莆篡席干细胎．向款骨细日白．方向奔让．的有前导曲治疗方法．     

TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导兔脂肪基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

[目的]分离培养兔脂肪基质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),观察在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导下其生物学特性及向软骨细胞定向分化的能力.[方法]取4个月龄新西兰大白兔颈背部脂肪组织,分离、培养ADSCs.选取第3代,分为两组,实验组用软骨诱导液(含TGF-β1、bFGF、IGF)对细胞进行培养,对照组用普通高糖培养液培养,倒置显微镜观察两组细胞形态,MTT测定其增殖情况;14 d后行组织学观察(包括甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化),并实时荧光定量PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9基因的表达情况.[结果]实验组细胞逐渐变为软骨样细胞形态,增殖速度明显加快,14 d后实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化阳性,对照组为阴性,荧光定量PCR结果显示实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9的基因转录水平明显高于对照组.[结论]在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导条件下ADSCs增殖迅速,可高表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9,向软骨细胞定向分化.     

脂肪基质干细胞培养及其定向分化为成骨细胞、软骨细胞特性的研究

目的研究脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠ADSCs在体外向成骨细胞、软骨细胞分化的能力。方法从成年SD大鼠腹股沟处无菌获取脂肪组织，胶原酶消化分离，培养出ADSCs。基础培养基传至第二代时改换诱导培养基，分别诱导向成骨、软骨细胞分化，培养2～4周，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Vonkossa染色鉴定向成骨细胞分化能力；阿新蓝染色鉴定向软骨细胞分化能力。RT—PCR检测成骨细胞、软骨细胞标志基因。结果大鼠脂肪能够分离培养出生长旺盛的ADSCs；向成骨细胞诱导，ALP、Vonkossa染色阳性，RT—PCR检测有ALP、Osteocalcin及Osteopontin表达；向软骨细胞诱导，阿新蓝染色阳性，RT—PCR检测有Ⅱ型胶原、X型胶原和Aggreean表达。结论大鼠脂肪组织可以分离培养出ADSCs，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）相似，能够向成骨细胞、软骨细胞分化，有希望成为组织工程理想的种子细胞来源。     

体外诱导骨髓间质干细胞向软骨方向分化的研究

目的　探讨体外诱导骨髓间充质干细胞 (BMSCs)向软骨方向分化的条件和方法。方法　抽取兔股骨骨髓 ,用密度梯度离心和贴壁分离法分离BMSCs ,分别在高密度 (1× 10 6/ml)和低密度 (1× 10 4/ml)培养条件下用转化生长因子 β1(TGF β1)诱导BMSCs向软骨方向分化。倒置显微镜、透射及扫描电子显微镜观察细胞 ,用免疫组织化学、原位杂交、特殊染色方法检测Ⅱ型胶原及软骨基质成分的表达。结果　高密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阳性率为 89.2 %,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 82 .6%,黏多糖特殊染色阳性 ,低密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阴性 ,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 3 .8%,黏多糖特殊染色阴性。结论　TGF β1可以诱导BMSCs向软骨方向分化 ,细胞密度是BMSCs分化的重要影响因素。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

转化生长因子-β1基因修饰对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

目的观察骨髓间充质干细胞经转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor,TGF-β1)基因修饰后增殖能力和向软骨细胞分化能力的变化。方法利用脂质体将pcDNA3-TGF-β1基因导入骨髓间充质干细胞,通过大体形态观察、CCK-8测定转染前后骨髓间充质干细胞的增殖代谢能力,同时RT-PCR和Westernblot法检测软骨特异性细胞外基质蛋白Ⅱ型胶原的表达。结果基因修饰后骨髓间充质干细胞倍增能力明显增强,并且Ⅱ型胶原蛋白表达增加。结论经TGF-β1基因修饰的MSCs向软骨细胞分化能力增强,是优秀的软骨组织工程种子细胞。