噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或scFv,这些分子的群体称为抗体库。经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。经典的筛选方法为固相或液相抗原识别,前提条件是能得到抗原纯品,对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用,所以又出现全细胞筛选,直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选,无需纯抗原,但目标抗原一定要有较高的表达水平,对于表达较低的情况,一种策略是先利用正常细胞筛选,去掉无关抗原后,再利用肿瘤细胞筛选;另一种策略是细胞内化筛选,特异性抗体被内化入细胞,然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞,获得特异性抗体。其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等,适用面较窄,未获推广。筛选效率主要通过以下几项的检测:转化数,即被感染的噬菌体数,它随筛选轮数的增加而增加;抗体基因插入载体的频率,高比例的丢失意味着筛选的低效率;抗体亲和性。抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点,如细胞融合、动物免疫等,目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用。     

用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗体

目的:初步探索从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选肿瘤细胞抗体的技术策略.方法:通过两种方法,即2%多聚甲醛固定细胞筛选法(PF)及活细胞直接筛选法(NF),经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛过程,对食管癌KYSE-170细胞进行筛选,得到抗食管癌细胞的噬菌体抗体,完善了噬菌体抗体库筛选完整细胞的特异性抗体的技术策略.并且进一步制备了其可溶性抗体.结果:活细胞NF组的筛选阳性率高于2%多聚甲醛固定PF组,筛选特异性抗体的阳性率分别为25.00%和12.50%,两组的差异具有统计学意义.结论:利用单链大容量抗体库可以采用不同的筛选方法成功制备与肿瘤细胞结合的噬菌体抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

噬菌体抗体库的构建及抗肿瘤单抗的筛选

鼠源抗肿瘤单抗通常用杂交瘤技术制备。作者首次尝试以噬菌体抗体库技术替代杂交瘤方法制备抗肿瘤鼠单抗。以ＲＴ－ＰＣＲ方法直接从免疫Ｂａ１Ｂ／ｃ小鼠脾脏淋巴细胞扩增出全套免疫球蛋白重链Ｆｄ段及轻链基因，克隆到原核表达载体并将抗体片断Ｆａｂ表达于线状噬菌体表面，构建了噬菌体抗体库（１．０×１０￣７）。以人乳腺癌细胞系Ｂｃａｐ３７活细胞为靶抗原对噬菌体抗体库进行的４轮亲和筛选显示了噬菌体抗体的特异性富集。从第４轮筛选后选取１８２个克隆进行ＥＬＩＳＡ检测发现１７４个具有与肿瘤细胞结合活性。用１２种人肿瘤细胞系及人淋巴细胞和成纤维细胞对所获克隆进行了进一步鉴定。我们所应用的方法为抗肿瘤单抗的制备提供了一条更为有效的新途径。     

噬菌体随机肽库中与神经胶质瘤细胞系SWO-38特异性靶向结合短肽的筛选

背景与目的：神经胶质瘤的常规治疗尚难取得令人满意的效果，寻找高效和高特异性杀伤肿瘤细胞的药物已成为提高其治愈率的研究热点。本研究旨在利用噬菌体随机肽库找到与神经胶质瘤细胞系SWO-38特异性结合并内化人细胞的短肽序列。方法：利用噬菌体随机12肽库对肿瘤细胞进行5轮全细胞筛选，分析筛选后单克隆对神经胶质瘤细胞的特异性结合能力并进行免疫荧光分析。提取单克隆DNA，测序，得出短肽序列进行比对分析。结果：通过5轮筛选后的噬菌体库及所挑选的表面及内化部分各13个单克隆均显示对胶质瘤细胞有较高的特异性结合，并测序得到三条重复性高的多肽序列。免疫荧光分析显示噬菌体大量聚集在细胞表面并能够内化进入到细胞内。结论：通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞筛选得到的噬菌体多肽能高特异性与胶质瘤瘤细胞SWO-38结合，可作为肿瘤导向药物研究的载体。     

用噬菌体抗体库技术筛选单克隆抗体

用噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体是近年来抗体技术中的革命性进展，本文简要介绍了我们在这方面所进行的研究工作：从乳癌细胞免疫后的小鼠脾脏细胞和接种过HBsAg疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞扩增出k链和Fd段基因，组装到Fab段噬菌体抗体表达载体pCOMB3中,分别建立了鼠源性和人源性噬菌体抗体库，以固相化的HBsAg和乳癌细胞为抗原．通过“吸附-洗脱-扩增”富集性筛选过程获得了鼠抗人乳癌细胞和人抗HBsAg的噬菌体抗体，并通过对表达载体的改造，在大肠杆菌表达出了可溶性的Fab段,对所获得的抗体Fab段进行了特异性、亲和力以及DNA序列的分析，显示噬菌体抗体库技术是一个行之有效的抗体制备手段。     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。     

人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定

目的构建人源抗肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库。方法利用噬菌体表面呈现技术,构建基因文库,经过panning筛选富集后,用ELISA方法检验抗原结合活性。结果从30个噬菌体克隆中筛选到8个具有肝癌细胞株SMMC7721结合活性的阳性克隆。结论从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗肝癌单链抗体的策略是可行的。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的：对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定，筛选肝癌抗体，同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法：PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定；通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果：ScFv基因插入率为70％。在亲和筛选过程中，肝癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定，均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC-7721呈阳性反应，阳性率为90％，15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明，以正常胎肝细胞L-02为对照，ScFv与肝癌结合比率为41．3％。特异性鉴定表明，其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论：利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因，且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

SEREX方法在筛选和鉴定骨肉瘤抗原中的应用

引言肿瘤抗原及其编码基因的理论研究和实验技术使肿瘤抗原的筛选和肿瘤免疫的研究进入一个新阶段[1]。肿瘤抗原的筛选与鉴定是临床特异性免疫治疗的前提和关键,随着对肿瘤生物学和肿瘤免疫学的深入认识,设计了基于体液免疫的重组cDNA文库的血清学分析(serological analysis of recombi-nant cDNAexpressionlibraries,SEREX)方法,简便易行[2]。本文对SEREX方法的原理、技术步骤、及其在骨肉瘤肿瘤基因筛选的应用及研究现状作一简要介绍。1SEREX方法原理重组cDNA表达文库的血清学分析最早由Pfreundsch小组建立[2]。SEREX方法将分子克隆技术和利用患者自体血清对肿瘤细胞的自体分型技术融为一体,不仅可检测抗体反应,而且能在抗原与患者自体血清反应的基础上,直接从分子水平确定具有免疫原性的肿瘤蛋白质(抗原)。此方法的流程主要是以新鲜瘤组织或细胞样本构建cDNA文库并连接入噬菌体表达载体,以重组的噬菌体转染E.coli大肠杆菌,将细菌表达的重组蛋白转移至NC膜上,与稀释后的病人自体血清共孵育,用酶联特异性抗人IgG二抗识别与高滴度血清抗体反应的克隆,阳...     

树突状细胞与肿瘤疫苗治疗

树突状细胞(dendritic cells，DC)是人体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，是肿瘤免疫反应中不可缺少的辅助细胞。未成熟DC可摄取抗原，当有危险信号刺激时可迁徙至淋巴器官，并递呈抗原给T细胞进而激发免疫应答。目前普遍采用的获取DC的方法是对外周血单核细胞(PBMC)进行体外诱导和培养。证据显示DC浸润与许多恶性肿瘤的预后有关。DC数量减少和功能缺陷，也是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的机制之一。用于装载DC的抗原包括肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物、肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原肽、肿瘤抗原DNA／RNA等。肿瘤抗原经脂质体介导在体内转染DC，也可激发特异性免疫应答。     

新城疫病毒Ⅳ系活疫苗辅助治疗鼻咽癌患者的临床效果观察研究

目的:考察鸡新城疫病毒Ⅳ系(NewcastlediseasevirusⅣ,NDVⅣ)活疫苗作为辅助治疗手段用于人类鼻咽癌患者的安全性、免疫学效应和临床效果。方法:以NDVLaSota株制备活疫苗,以喷雾吸入途径接种于家兔,得到了安全、有效的结果之后,再以相同途径接种于放射治疗后的鼻咽癌患者,观察其安全性、免疫学效果和辅助治疗的临床效果。结果:该疫苗接种于实验动物和肿瘤患者的近期毒副发应都属轻微,未见严重肝肾功能损害;血清均可测出相应的抗体,其几何平均滴度随接种程序的推进而相应升高;鼻咽癌患者接种该疫苗之后,3年复发率低于对照组(4·00%vs26·00%),差异有统计学意义;5年复发率亦低于对照组(14·00%vs28·00%),但差异无统计学意义。结论:鸡新城疫病毒Ⅳ系活疫苗接种于实验动物(家兔)和人,都具有良好的安全性;都能产生明显的免疫学效应;用于放射治疗后的鼻咽癌患者,能明显减少其治疗后3年复发率;因而,适宜作为一种辅助治疗手段,在临床上推广应用。5年或更长期的效果,尚待研究。     

围冷冻手术期施行免疫疗法的抗肿瘤作用

目的 通过动物实验总结冷冻外科联合生物免疫治疗恶性肿瘤的经验，为临床应用提供依据。方法 将接种黑色素瘤Ｂ１６的荷瘤小鼠Ｃ５７ＢＬ／６随机分为冷冻免疫治疗组，冷冻对照组，免疫对照组，盐水对照组。实验组在围冷冻手术期，去除免疫抑制，配合生物免疫治疗，强化抗肿瘤免疫作用；其他３个对照组分别进行冷冻治疗，免疫治疗，注射生理盐水。     

肿瘤患者红细胞免疫功能和sIL-2R检测的意义

目的 :探讨肿瘤患者红细胞 (RBC)免疫功能与白细胞介素 2受体 (sIL 2R)变化的意义。方法 :采用免疫黏附酵母菌花环法 ,检测 116例恶性肿瘤患者的RBCC3b受体花环率 (RBC C3bRR)、RBC免疫复合物花环率 (RBC ICR) ,用双抗体夹心ELISA法测患者血清sIL 2R ,并与 5 0例健康对照相比较。结果 :消化道肿瘤组、胸腺瘤组RBC C3bRR与正常对照组相比较 ,显著降低 ,差异有极显著性 (P <0 0 1) ;肺癌组、淋巴瘤组RBC C3bRR与对照组相比 ,显著降低 ,差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;而各肿瘤组RBC ICR与正常对照组相比 ,显著增多 ,差异有极显著性 (P <0 0 1)。各肿瘤组间RBC C3bRR、RBC ICR差异均无显著性 (P >0 0 5 )。各肿瘤组与正常对照组相比 ,sIL 2R水平明显增高 (P <0 0 1) ,各肿瘤组间差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论 :测定RBC免疫功能和sIL 2R ,可了解肿瘤患者的免疫状态 ,在一定程度上对疾病的严重程度、肿瘤分期、疗效及预后作出正确的评估     

黑色素瘤抗原基因在胃癌组织中表达的研究

目的 :探讨黑色素瘤抗原 (MAGE)基因在胃癌组织中的表达 ,为应用MAGE基因产物对胃癌患者进行特异性抗肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法 :用逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测 30例胃癌组织及相应癌旁组织中MAGE 1、MAGE 2和MAGE 3基因的表达。结果 :30例胃癌组织标本MAGE 1、MAGE 2和MAGE 3基因的表达率分别为 4 6 7%、30 0 %和 36 7% ,有 2 0例至少表达其中 1种基因 ,而相应的癌旁组织均不表达MAGE。结论 :MAGE基因在胃癌组织中有较高的表达率 ,其编码蛋白有望作为疫苗用于胃癌患者的免疫治疗     

The Fas/Fas‐ligand system: a mechanism for immune evasion in human breast carcinomas

Breast tumors are frequently associated with a predominantly lymphocytic infiltrate, which constitutes an immune response against the tumor. In spite of this massive infiltrate, the immune response appears to be inefficient and the tumor is able to evade it. We propose that in breast cancer, tumor escape from immunological surveillance results from the induction of apoptosis of Fas-bearing activated lymphocytes by FasL-bearing breast cancer cells. To test this proposal we studied the expression of FasL by human breast carcinomas and the MCF-7 breast cancer cell line by RT-PCR, immunohistochemistry, and Western Blot. Moreover, we describe the presence of apoptosis and Fas expression in the lymphocytic population surrounding the tumor. Strong membranous and cytoplasmic staining was detected in ductal carcinomas and hyperplastic breast tissue, but it was absent from normal breast tissue. No staining was found in normal glands in the non-tumor quadrants; however, the normal appearing ducts surrounding the carcinoma (tumor quadrant) showed intense immunoreactivity. Apoptosis was found predominantly among the lymphocytic population, as well as in the blood vessels and fibro-fatty tissue close to the tumor. Further characterization of apoptotic cells demonstrated that they were CD3+ cells. Our results suggest the breast tumors may elude immunological surveillance by inducing, via the Fas/FasL system, the apoptosis of activated lymphocytes. Recent data have demonstrated FasL RNA in other tumor types. Upregulation of FasL expression in hyperplastic and normal breast ducts close to the tumor also suggests a possible role in early neoplastic transformation and proliferation.     

流式细胞术分析肿瘤患者免疫功能变化

探讨恶性肿瘤患者免疫功能变化及其与肿瘤的发生部和发展阶段的关系，方法应用直接免疫荧光标流式细胞术分析正常成人，非霍奇淋巴瘤乳腺癌和癌患者外周血Ｔ淋巴细胞亚群、ＮＫ细胞、ＣＤ１９Ｂ淋巴细胞含量变化。     

异种黑色素细胞疫苗诱导小鼠抗恶性黑色素瘤免疫反应

目的：研究异种黑色素细胞疫苗对小鼠恶性黑色素瘤生长的抑制新作用。方法制轩异种黑色素细胞疫苗,皮皮预防免疫小鼠后再接种恶性黑色素瘤,并以该疫苗皮下注射治疗恶性黑色素瘤鼠,随后测量肿瘤大小,采用^51Cr释放法,体外分析小鼠脾细胞的细胞毒性T细胞（CTL）活性,以间接ELISA法检测小鼠血清抗肿瘤抗 。结果预防免疫使90％小鼠恶性黑色素瘤生长受到抑制,疫苗治疗使50％小鼠肿瘤生长受到抑制,免疫组鼠较对照组CTL杀伤活性在20：1、10：1、5：1不同效靶比时,分别增高34．0％、24．1％及13．9％（P＜0．05）,体内出现抗恶性黑色素瘤抗体。结论：异种黑色素细胞疫羁可诱导小鼠抗恶性黑色素瘤特异性免疫反,抑制肿瘤生长。     

p57kip2蛋白和增殖细胞核抗原在喉鳞癌组织中的表达及其临床意义探讨

目的探讨细胞周期调控抑制因子蛋白p57kip2和增殖细胞核抗原PCNA在喉鳞癌(LSCC)中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学技术SP法,检测p57kip2和PCNA在40例喉鳞癌组织和癌旁组织的表达情况。结果在喉鳞癌组织中p57kip2阳性率(42.5%)低于癌旁组织(72.5%),并与TNM分期、癌组织分化程度、淋巴结转移呈负相关;PCNA阳性率(55.0%)明显高于癌旁组织(30.0%),并与TNM分期、癌组织分化程度、淋巴结转移呈正相关;p57kip2 与p57kip2-患者生存期≥5年的比率分别为76.5%和19.1%;PCNA 与PCNA-患者生存期≥5年的比率分别为40.1%和72.2%。结论p57kip2和PCNA分别是喉鳞状细胞癌进展及预后判断的独立指标;p57kip2在喉鳞癌中的不同表达水平可能与不同的调控方向有关。     

DC-CIK治疗晚期非小细胞肺癌的近期临床疗效观察

目的 评价树突状细胞(dendritic cell,DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)治疗晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的临床疗效及安全性.方法 收集34例采用DC-CIK细胞治疗可评价的晚期NSCLC患者,评价其近期疗效及安全性.结果 DC-CIK细胞治疗晚期NSCLC 1-3月后的客观缓解率(objective response rate,ORR)为20.6％,疾病控制率(disease control rate,DCR)为67.6％.近期疗效与远处转移无关(P＞0.05).患者细胞治疗的ORR与治疗次数无关(P＞0.05),DCR与治疗次数有关(P＜0.05).无明显的不良反应.结论 DC-CIK治疗晚期NSCLC安全、有效,可减缓病情进展,为晚期NSCLC患者提供了一条新的治疗途径.