建立实时荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因及其初步应用

目的建立FQ-PCR(real-time Fluorescent Quantitative PCR)系统定量检测新型隐球菌CAP10基因,为将其应用于新型隐球菌感染的诊断和疗效判断奠定基础。方法根据新型隐球菌5种血清型(A、B、C、D、AD)中同源序列设计引物和探针,PCR扩增CAP10基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;建立FQ-PCR体系,优化反应条件,建立标准曲线,进行特异性、敏感性、重复性实验。结果FQ-PCR系统用于检测CAP10基因片段,敏感性为1拷贝数/μl,重复性好,批内变异系数(CV)为1.36%,批间变异系数(CV)为1.86%,特异性好,对临床其他常见脑膜炎病原体不出现特异性扩增曲线。结论成功建立了新型隐球菌CAP10基因FQ-PCR检测方法,结果稳定、准确,有望为判断新型隐球菌性脑膜炎疗效、预后提供新的依据。     

建立实时荧光定量PCR检测新型隐球菌CAPIO基因及其初步应用

目的建立FQ-PCR（real-time Fluorescent Quantitative PCR）系统定量检测新型隐球菌CAP10基因，为将其应用于新型隐球菌感染的诊断和疗效判断奠定基础。方法根据新型隐球菌5种血清型（A、B、C、D、AD）中同源序列设计引物和探针，PCR扩增CAP10基因片段，并将其克隆到pGEM-T Easy载体上，构建质粒标准品；建立FQ—PCR体系，优化反应条件，建立标准曲线，进行特异性、敏感性、重复性实验。结果FQ-PCR系统用于检测CAP10基因片段，敏感性为1拷贝数／出，重复性好，批内变异系数（CV）为1．36％，批间变异系数（CV）为1．86％，特异性好，对临床其他常见脑膜炎病原体不出现特异性扩增曲线。结论成功建立了新型隐球菌CAP10基因FQ-PCR检测方法，结果稳定、准确，有望为判断新型隐球菌性脑膜炎疗效、预后提供新的依据。     

荧光定量聚合酶链反应检测常见致病真菌方法的建立

目的建立快速的检测临床致病真菌的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法使用真菌的通用引物ITS86和ITS4,检测临床常见的致病性真菌,并观察检测方法的敏感性和特异性。结果建立的荧光定量PCR可以准确地检测念珠菌属、曲霉菌属和新型隐球菌等常见的致病真菌,白色念珠菌的敏感性为0.87fg,光滑念珠菌的敏感性为4.2fg,与细菌和人类基因组DNA以及病毒DNA均无交叉反应,根据融解曲线的Tm值可以进行菌种的初步鉴定。结论荧光定量PCR方法检测真菌的敏感性和特异性好,可以应用于临床进行快速检测。     

人微小病毒B19荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

目的建立可同时检测各型人微小病毒B19(HPV B19)的荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法。方法运用在线工具MAFFT比对分析3种基因型的HPV B19代表病毒株NS1区域序列,针对保守区序列设计特异性的引物和探针。建立检测HPV B19实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性和特异性进行评估。结果 1×107～1×102拷贝/μL以及20拷贝/μL质粒DNA模板绘制的标准曲线,反应效率E为0.946,R2值为0.996 6;本方法的检测下限为10拷贝/μL,定量下限为20拷贝/μL。单纯疱疹病毒(HSV) 2型、巨细胞病毒(CMV)、B族链球菌(GBS)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)的阳性DNA病毒检测结果均为阴性,参考质粒及HPV B19阳性样本正常扩增。结论建立的荧光定量PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性,可运用于HPV B19感染的筛查和诊断。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR检测人载脂蛋白A5基因方法的建立及评价

目的建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量聚合酶链反应(PCR),用于检测人载脂蛋白A5(apo A5)基因。方法针对人apo A5基因设计特异性引物和TaqMan-MGB荧光探针,以重组克隆质粒pPCR-Script-apo A5为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行灵敏度、重复性、特异性实验。结果建立的定量标准曲线阈值循环数(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为103拷贝/μL;扩增效率(E)为110.2%,且重复性好。结论成功建立检测人apo A5基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR。该法具有较好的灵敏度、特异性及重复性。     

鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价

  目的  建立一种鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法,并进行应用效果评价。  方法  选择鼠疫菌染色体YPO0393基因与pMT1质粒caf1基因为靶基因,设计合成YPO0393-内标模板、特异性引物和TaqMan荧光探针,构建鼠疫多重荧光定量PCR内标检测体系;对非鼠疫菌DNA、不同稀释浓度鼠疫菌DNA、野外监测样本进行检测,评价该方法的特异性、灵敏性、重复性和应用效果。  结果  采用多重荧光定量PCR内标方法,8株鼠疫菌DNA均出现明显的扩增曲线,12株非鼠疫菌DNA未显示扩增曲线,提示该方法特异性良好。 不同浓度的鼠疫EV76疫苗株DNA,检测最低限为22.5×10?4 ng/μL,变异系数为0.99～3.42,提示灵敏性、重复性较好。 105份野外监测样本中,荧光定量PCR内标方法检测阳性的6份,与普通PCR方法检测结果一致,4份样本分离培养出鼠疫菌且采用PCR方法检测阳性。  结论  通过设置双靶基因与内标对照,本研究建立的鼠疫多重荧光定量PCR内标方法可降低检测假阳性率,特异性、灵敏性和重复性理想,可用于鼠疫快速检测。     

DD3基因实时荧光定量RT—PCR检测前列腺癌特异性方法的建立

目的 建立DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法,为前列腺癌的快速诊断提供分子诊断依据.方法 根据Genebank中的 DD3 mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,采用基因重组技术构建用于DD3基因检测的定量标准品;建立DD3基因的实时荧光定量方法.结果 成功构建了用于DD3基因荧光定量PCR检测的标准重组质粒和DD3基因实时荧光定量PCR方法;经稳定性、特异度、重复性和敏感度实验方法学评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1.64 copy/ml,线性范围为1.64～1.64×1012copy/ml.结论 DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法的建立,将为前列腺癌特异性诊断及其临床应用奠定方法学基础.     

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的 建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。 方法 以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物, 以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。 结果 建立的定量标准曲线阈值循环数（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为10^{2 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。 结论 实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。}     

荧光定量PCR法检测烟曲霉DNA

目的 建立检测烟曲霉DNA的荧光定量PCR方法,评价其在小鼠侵袭性烟曲霉肺部感染诊断中的意义.方法 根据烟曲霉ITSI区域基因组序列,设计合成引物和荧光标记探针,优化荧光定量PCR条件,从特异性、扩增效率、灵敏度及重复性方面进行评价.建立小鼠烟曲霉肺部感染模型,用荧光定量PCR对36只实验小鼠肺组织及支气管肺泡灌洗液(...     

利用实时荧光定量PCR技术检测毒素基因快速鉴定A/B型肉毒梭菌方法的建立

目的建立针对A/B型肉毒梭菌毒素基因的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法,构建标准曲线,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高肉毒梭菌检测的快速性、准确性。方法根据肉毒梭菌A/B型毒素基因设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立real-time PCR反应体系。 用25种细菌评价该方法的特异性,使用含有A/B型毒素基因特异性序列的重组质粒标准品构建标准曲线,模拟粪便标本,评价建立方法的灵敏度。结果建立的real-time PCR检测方法特异性好,携带A/B型毒素基因的重组质粒均出现相应特异性扩增曲线,对其他25种细菌进行试验扩增时,均未见出现特异性扩增曲线。 根据重组质粒标准品构建的标准曲线可确定其对肉毒梭菌A/B型毒素基因检测灵敏度分别为5.04×102拷贝/μl和6.91×102拷贝/μl。 模拟粪便标本中含有目的基因重组质粒的检测下限为A型1.71×103拷贝/μl,B型2.14×103拷贝/μl。结论本研究设计了适合检测国内肉毒梭菌 A/B 型的引物和探针,建立 real-time?PCR 快速检测体系,为我国肉毒梭菌 A/B 型菌株的快速鉴定提供一种新的技术手段。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术检测解脲脲原体生物群的研究

目的建立解脲脲原体生物群Taqman荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法根据解脲脲原体生物群MBA基因差异,分别设计并合成引物和探针。优化引物和探针浓度及试验条件,并进行试验的灵敏度、特异性和重复性评价。结果生物1群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5U Taq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.1pmol/L,TaqMan探针0.2pmol/L,模板DNA 2μL。生物2群最适缓冲体系:25μL反应体系中包含2.5UTaq酶,Mg2+2.5mmol/L,上、下游引物0.2pmol/L,TaqMan探针0.3pmol/L,模板DNA2μL。PCR反应条件:95℃2min;95℃10s;55℃(检测荧光信号)20s,循环40次。该方法线性范围在1.0×102～8 copy/mL之间,检测限达到100～200copy/mL,特异性达到100%,CV值为2.5%。结论 本研究建立的TaqMan荧光PCR检测解脲脲原体生物群线性范围宽、灵敏度高、特异性及重复性好,能够快速进行解脲脲原体生物群检测。     

基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨基于TaqMan探针的幽门螺杆菌23SrDNA基因片段的实时荧光定量PCR检测的有效方法。方法根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价,并对2012年5月至10月收集的100份临床样本进行检测同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析。结果建立了检测23SrDNA的实时荧光定量PCR方法：107-102copies/ul范围内均有＂S＂型扩增曲线,最低检测浓度为102copies/ul,标准曲线相关系数为1。对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线。对100份样本进行检测,实时荧光定量PCR能检出31份阳性,而免疫组化方法能检出25份阳性,银染方法能检出28份阳性。结论实时荧光定量PCR方法可成功检测幽门螺杆菌,且该方法具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。     

建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法

目的 建立敏感、特异的普通聚合酶链反应(PCR)方法和TaqMan 荧光定量PCR方法对产气肠杆菌进行快速检测。方法 以产气肠杆菌组氨酸脱氢酶基因(hdc)为靶基因设计引物以及TaqMan FAM探针,建立对产气肠杆菌进行检测的普通PCR方法和TaqMan 荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性。结果 普通PCR和TaqMan 荧光定量PCR方法均能对产气肠杆菌进行特异检测;普通PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为 100 copies/l和1.0105 cfu/g,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为33 copies/l和1.0104 cfu/g;TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;在稳定性评价试验中,普通PCR方法的重复性良好,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品检测Ct值的组内差异为0.15%~0.98%,组间差异为0.55%~1.63%。结论 本研究建立的检测产气肠杆菌的普通PCR方法和TaqMan 荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于产气肠杆菌的快速检测。     

建立RT-ARMS-qPCR系统定量测定含A1555G突变的线粒体DNA拷贝数

目的建立RT-ARMS-qPCR（real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR）系统定量测定含线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）A1555G位点突变的片段的拷贝数,为阐明线粒体耳聋临床表型多样性的分子生物学基础奠定基础。方法根据ARMS的基本原理设计引物,在引物3’端插入错配碱基AC建立RT-ARMS-qPCR系统,优化定量PCR体系,并进行方法学评价。经PCR分别扩增相应突变型和野生型的片段,将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;同时对含突变型和/或野生型mtDNA 1555位点的片段的拷贝数进行定量检测。结果RT-ARMS-qPCR系统用于检测含mtDNA 1555位点的片段,线性检测范围为102-108拷贝数/μl,检测灵敏度为1×102拷贝数/μl,其批内变异系数（CV）为1.34%,批间CV为1.96%,重复性好;突变型和野生型引物分别只扩增相应片段,特异性好。结论RT-ARMS-qPCR系统适合于定量检测含mtDNA A1555G点突变的线粒体DNA片段,结果稳定、准确,有助于阐明线粒体耳聋严重程度的分子基础。     

乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原在隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎中的早期诊断价值

目的 研究乳胶凝集试验在隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎中的早期诊断价值.方法 选取2005年1月至2006年4月广州市3家医院确诊的隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎患者24例作为新生隐球菌组;选取念珠菌感染患者50例,细菌感染患者31例,怀疑隐球菌感染患者62例,正常者30名作为非新生隐球菌组,采用乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原,并与培养和直接镜检方法相比较,评价其诊断的灵敏度和特异度.结果 乳胶凝集试验、培养和直接镜检3种方法诊断的灵敏度分别为96.2%、70.8%和83.3%,而特异度分别为99.4%、100.0%和100.0%.结论 乳胶凝集试验具有准确率高、快速简便的特点,可作为隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎的早期诊断方法.     

病原治疗前脑脊液隐球菌负荷量在新生隐球菌性脑膜炎临床转归中的意义

目的:探讨新生隐球菌性脑膜炎患者病原治疗前脑脊液隐球菌负荷量与治疗效果及临床转归的关系.方法:收集52例新生隐球菌性脑膜炎患者的临床资料,以治疗前脑脊液隐球菌计数与临床转归关系的特异度及灵敏度之和的最大值所对应的脑脊液隐球菌计数2 125个/ml为分界点,分为脑脊液隐球菌计数＜2 125个/ml(低量)组31例和脑脊液隐球菌计数≥2 125个/ml(高量)组21例,比较抗真菌治疗后两组患者的阴转率和临床疗效.结果:抗真菌治疗后低量组的脑脊液隐球菌阴转率为52％,高量组的脑脊液隐球菌阴转率为14％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01);低量组治愈率48％,好转率23％,总有效率71％:高量组治愈率14％,好转率14％,总有效率29％,两组的治愈率及总有效率比较差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:在新生隐球菌性脑膜炎患者中,病原治疗前脑脊液隐球菌计数＜2 125个/ml者相比于≥2125个/ml者,抗真菌治疗后脑脊液隐球菌阴转率高,临床转归好,脑脊液隐球菌负荷量是评估治疗效果和临床转归的一个实用、便捷的参数.     

实时荧光定量聚合酶链反应检测血清2型猪链球菌的研究

目的 基于TaqMan-MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应(Real.time PCR)技术,建立针对血清2型猪链球菌的快速检测方法.方法 针对血清2型猪链球菌的csp2J基因序列,应用Beacon Designer 7.0,设计了引物和TaqMan-MGB探针,建立Real-time PCR检测方法;把目的 片段克隆...     

TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

血清曲霉菌游离DNA定量PCR检测方法的建立及应用初探

目的 建立并评价从血清中检测曲霉游离DNA的定量PCR方法.方法 合成曲霉28s rDNA基因特异广谱引物和Taqman探针,建立定量PCR检测方法,并进行方法学评价.用建立的方法检测33例患者的GM阳性血清标本.结果 定量PCR方法灵敏度为2拷贝/反应,标准曲线Y=-3.629X+40.187,相关系数R2为0.997 6.定量PCR方法检测33例患者的首次GM阳性血清标本,对诊断侵袭性曲霉感染的敏感性84％(21/25)、特异性87.5％(7/8)、阳性预测值95.5％(21/22)、阴性预测值63.6％(7/11).PCR阳性与PCR阴性病例组间侵袭性曲霉感染诊断率有统计学差异(95.5％ vs 36.4％),PCR阳性与侵袭性曲霉感染诊断有相关性(RR=2.625).结论 血清曲霉游离DNA定量PCR检测有助于侵袭性曲霉感染的早期诊断.