[VEGF]hTERT复合调控序列介导HSV-tk自杀基因诱导肿瘤细胞的凋亡

目的构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)核心启动子及血管内皮生长因子(VEGF)增强子复合调控序列的真核表达载体,并检测在复合调控序列调控下HSV-tk自杀基因对肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。方法构建复合调控序列[VEGF]hTERT和胸苷激酶(tk)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-[VEGF]hTERT-tk和PCMV启动子的真核对照表达载体pcDNA3.1(+)-tk,转染肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721,G418筛选抗性克隆,给入前药丙氧鸟苷(GCV),MTT比色法测定细胞生长抑制率,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果质粒pcDNA3.1(+)-[VEGF]hTERT-tk和pcDNA3.1(+)-tk经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确。转染了带有不同启动子的真核表达载体的肿瘤细胞,在给入前药GCV后均能表现出对细胞生长的抑制作用,GCV对A549细胞的抑制率大于SMMC-7721细胞,并能引起肿瘤细胞凋亡。[VEGF]hTERT在A549细胞中的活性较在SMMC-7721中高。结论HSV-tk自杀基因在肿瘤细胞内瞬时表达即能引起靶细胞凋亡,且复合调控序列在肿瘤细胞中的活性较通用真核细胞转录启动子PCMV高,为深入进行自杀基因治疗的研究提供了一定理论依据。     

重组腺病毒Ad-CMV-TK的构建及其对Lewis细胞的抑制作用

目的构建重组腺病毒Ad-CMV-TK,并检测Ad-CMV-TK/GCV系统对小鼠Lewis肺癌细胞的抑制作用。方法PCR扩增HSV-TK基因,以复制缺陷型腺病毒为载体构建重组腺病毒Ad-CMV-TK,在HEK293细胞中包装,CsCl2梯度离心法纯化后,感染Lewis肺癌细胞,Western blot检测HSV-TK蛋白的表达;MTT法检测Ad-CMV-TK/GCV系统对Lewis细胞的体外抑制作用;同时检测Ad-CMV-TK/GCV系统对C57荷瘤小鼠的抑瘤作用。结果重组腺病毒Ad-CMV-TK感染的Lewis细胞可特异地表达HSV-TK蛋白,Ad-CMV-TK/GCV系统在体外能明显抑制Lewis细胞的生长,当GCV浓度为100μmol/L时,Lewis细胞的存活率仅为16%;在体内能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,与Ad-Blank/GCV对照组和PBS对照组相比,差异具有统计学意义。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-CMV-TK,Ad-CMV-TK/GCV系统在体内及体外对小鼠Lewis肺癌细胞均有明显的抑制作用,为进一步研究其抗肿瘤机制及应用奠定了基础。     

蚓激酶在牛乳腺中的稳定表达

目的构建蚓激酶重组逆转录病毒载体,并在牛乳腺中稳定表达蚓激酶。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中,获得蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418筛选阳性细胞克隆,克隆扩大培养后,病毒上清转染妊娠7个月奶牛乳腺小叶组织。产犊后采奶样,FAPA法检测蚓激酶活性,并进行凝胶薄层扫描分析。结果蚓激酶重组逆转录病毒最高滴度约为1×104CFU/ml。奶牛产后奶样中蚓激酶基因在牛乳腺中可连续表达112d,活性相当于30000英国单位/L牛奶,在牛奶中表达量可达180mg/L牛奶。结论已成功构建蚓激酶重组逆转录病毒载体,蚓激酶可在牛乳腺中相对稳定地表达。     

HSV-tk基因/GCV系统治疗肿瘤的旁观者效应与缝隙连接关系的研究

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因／丙氧鸟苷（GCV）系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接的关系。方法 用PA317细胞包装STK质粒（逆转录病毒载体介导的HSV-tk基因），形成假逆转录病毒颗粒，转染有缝隙连接的大鼠胶质瘤细胞C6和无缝隙连接的入宫颈癌细胞 Hela，制成 C6 tk+和 Helatk+细胞，将不同比例的C6和 C6 tk+、Hela和 Hela tk+细胞混合，每种比例8孔，培养 24h后 4孔加入含0．5μg/mlGCV的培养基，4孔作对照，6d后用MTT法测量细胞存活率。在两个培养皿中放入周围粘有33mm高滤纸的载玻片，分别接种 C6、C6 tk+细胞。细胞 80%汇合后将载玻片互换，并加入含0．5μg/ml GCV的培养基，6d后观察细胞形态。结果C6细胞组存在旁观者效应，Heal细胞组不存在旁观者效应。培养皿中tk+细胞大部分被杀死,tk-细胞无变化。结论HSV-tk基因/GCV系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关。     

HSV—th基因／GCV系统治疗肿瘤的旁观者效应与缝隙连接关系的研究

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk)基因/丙氧鸟苷（GCV）系统杀伤肿瘤细胞时旁观者铲应与细胞间缝隙连接的关系，方法 用PA317细胞包装STK质粒（逆转录病毒载体介导的HSV-tk基因），形成假逆转录病毒颗粒，转染有缝隙连接的大鼠胶质瘤细胞C6和无缝隙连接的人宫颈癌细胞Hela,制成C6tk^ 和Helatk^ 细胞，将不同比例的C6和C6tk^ ,Hela和Helatk^ 细胞混合，每种比例8孔，培养24h后4孔加入含0.5μg/mlGCV的培养基，4孔作对照，6d后用MTT法测量细胞存活率，在两个培养皿中放入周围2粘有33mm高滤纸的载玻片，分别接种C6、C6tk^ 细胞。细胞80%汇合后将载玻片互换，并加入含0.5μg/mlGCV的培养基，6d后观察细胞形态。结果 C6细胞存在旁观者效应，Hela细胞组不存在旁观者效应，培养皿中tk^ 细胞大竞争被杀死，tk^-细胞无变化。结论 HSV-tk基因/GCV系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关。     

稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系的建立

目的建立稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系,并观察shRNA对Caski细胞中MCPH1基因表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSUPERRetro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生重组逆转录病毒,感染宫颈癌细胞株Caski,经puromycin筛选稳定的细胞克隆,实时荧光定量PCR和Westernblot法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染Caski细胞后可筛选出稳定的细胞克隆;pSUPER-shRNA-MCPH1组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组及正常对照组。结论已成功建立了稳定表达人MCPH1基因shRNA的Caski细胞系,shRNA能明显抑制MCPH1基因的表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

小鼠Hes1基因过表达逆转录病毒载体的构建及其在小鼠Lin~-造血细胞中的表达

目的构建过表达Hes1基因的逆转录病毒载体,并通过感染相对原始的小鼠Lin-造血细胞检测其感染效率。方法通过RT-PCR法从B6小鼠骨髓细胞中扩增Hes1基因功能区,将扩增产物连接入逆转录病毒载体MSCV-ICN1-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP,瞬时转染293T细胞,设转染空载体的细胞为对照组,流式细胞仪检测转染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达;将重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP及空载体与Lipofectamine 2000混合后,转染293T细胞,包装重组逆转录病毒,稳定感染小鼠Lin-细胞,设感染空载体病毒的细胞为对照组,流式细胞仪检测感染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达。结果测序证实重组逆转录病毒载体构建正确;转染293T细胞后第3天,重组逆转录病毒的转染效率约为95%,Hes1基因表达量约为对照组的5倍;病毒上清感染Lin-细胞后第4、5天,重组逆转录病毒的感染效率约为7%,Hes1基因的表达量约为对照组的6倍。结论已成功构建了过表达Hes1基因的重组逆转录病毒载体,并在小鼠Lin-细胞中稳定表达,为研究白血病环境下Hes1对造血干祖细胞的作用奠定了基础。     

重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD的构建及其对胃癌细胞的杀伤作用

目的构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,并探讨其对胃癌细胞的杀伤作用及可能的机制。方法利用同源重组的方法在痘苗病毒VG9的TK区插入锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因,构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,经筛选及纯化后,测定病毒滴度。将重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD及痘苗病毒VG9分别按不同的MOI(0.01、0.1、1、10)及转染时间(12、24、36、48 h)转染至人胃癌细胞株7901,MTT法检测病毒对胃癌细胞的杀伤作用。按MOI=1将重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD及VG9分别转染人胃癌细胞株7901 48 h,同时以PBS作为对照,Western blot法检测胃癌细胞中Mn SOD的表达,流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡情况。结果经筛选及纯化后,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD滴度为2×108 pfu/m L。MOI为1和10时,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD对胃癌细胞的杀伤作用明显优于VG9(P0.05);转染24和36 h,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD对胃癌细胞的杀伤效果明显强于VG9(P0.05)。转染后,Mn SOD蛋白可在胃癌细胞中呈高表达,且VG9-Mn SOD组胃癌细胞的凋亡率明显高于VG9组及对照组(P0.05)。结论成功构建了重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,其对胃癌细胞具有明显的杀伤作用,该作用可能是通过促进胃癌细胞凋亡产生的。     

靶向高迁移率族蛋白A1基因RNA干扰真核表达载体的构建

目的构建针对人高迁移率族蛋白A1(HMGA1)基因的RNA干扰真核表达载体,为研究HMGA1基因在肿瘤细胞中的作用奠定实验基础。方法设计合成特异性针对人HMGA1基因的寡核苷酸序列,梯度退火后,与pU6mRFP载体连接,构建重组载体,转染人肝癌细胞SMMC-7721。通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光,估测转染效率,RT-PCR法检测转染细胞HMGA1mRNA水平,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果DNA测序证实,成功构建了特异性HMGA1siRNA真核表达载体,转染后72h,转染效率为40%左右。所构建的载体能够特异性沉默转染细胞HMGA1基因的表达。转染细胞HMGA1基因沉默后,细胞凋亡率(27·86%±2·44%)明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为2·82%±2·39%和2·04%±0·70%),G0-G1期细胞百分数(77·73%±1·78%)明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为42·19%±3·28%和39·23%±3·63%),G2-S期细胞百分数(22·27%±1·78%)明显低于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为57·81%±3·28%和60·77%±3·63%)。结论成功构建了HMGA1的RNA干扰真核表达载体。     

Mutation of herpesvirus thymidine kinase to generate ganciclovir-specific kinases for use in cancer gene therapies

Understanding the functional and mechanistic properties of themulti-substrate herpes simplex virus type-1 thymidine kinase(HSV-1 TK) remains critical to defining its role as a majorpharmacological target in herpesvirus and gene therapies forcancer. An inherent limitation of the activity of HSV-TK isthe >70-fold difference in the K_ms for phosphorylation ofthymidine over the pro-drug ganciclovir (GCV). To engineer anHSV-1 TK isoform that is specific for GCV as the preferred substrate,16 site-specific mutants were generated. The mutations wereconcentrated at conserved residues involved in nucleoside basebinding, Gln125 and near sites 3 and 4 involved in catalysisand substrate binding. The substrate preferences of each mutantenzyme were compared with wild-type HSV-1 TK. One mutant, termedQ7530 TK, had a lower K_m for GCV than thymidine. Expressionof the Q7530 TK in tumor cells indicated comparable metabolismto and improved sensitivity to GCV over wild-type HSV-1 TK,with minimal thymidine phosphorylation activity. A molecularmodeling simulation of the different HSV-1 TK active-sites wasdone for GCV and thymidine binding. It was concluded that mutationsat Gln125 and near site 4, especially at Ala168, were responsiblefor loss of deoxypyrimidine substrate binding.     

Ganciclovir and Its Hemocompatible More Lipophilic Derivative Can Enhance the Apoptotic Effects of Methotrexate by Inhibiting Breast Cancer Resistance Protein (BCRP)

Efflux transporters, namely ATP-binding cassette (ABC), are one of the primary reasons for cancer chemoresistance and the clinical failure of chemotherapy. Ganciclovir (GCV) is an antiviral agent used in herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gene therapy. In this therapy, HSV-TK gene is delivered together with GCV into cancer cells to activate the phosphorylation process of GCV to active GCV-triphosphate, a DNA polymerase inhibitor. However, GCV interacts with efflux transporters that are responsible for the resistance of HSV-TK/GCV therapy. In the present study, it was explored whether GCV and its more lipophilic derivative (1) could inhibit effluxing of another chemotherapeutic, methotrexate (MTX), out of the human breast cancer cells. Firstly, it was found that the combination of GCV and MTX was more hemocompatible than the corresponding combination with compound 1. Secondly, both GCV and compound 1 enhanced the cellular accumulation of MTX in MCF-7 cells, the MTX exposure being 13–21 times greater compared to the MTX uptake alone. Subsequently, this also reduced the number of viable cells (41–56%) and increased the number of late apoptotic cells (46–55%). Moreover, both GCV and compound 1 were found to interact with breast cancer resistant protein (BCRP) more effectively than multidrug-resistant proteins (MRPs) in these cells. Since the expression of BCRP was higher in MCF-7 cells than in MDA-MB-231 cells, and the cellular uptake of GCV and compound 1 was smaller but increased in the presence of BCRP-selective inhibitor (Fumitremorgin C) in MCF-7 cells, we concluded that the improved apoptotic effects of higher MTX exposure were raised mainly from the inhibition of BCRP-mediated efflux of MTX. However, the effects of GCV and its derivatives on MTX metabolism and the quantitative expression of MTX metabolizing enzymes in various cancer cells need to be studied more thoroughly in the future.     

高表达ABCG2基因对人原发性肝癌细胞SP表型的影响

目的研究高表达ABCG2基因对人原发性肝癌细胞SP表型的影响。方法构建pMSCVpuro-ABCG2逆转录病毒质粒,并转染至病毒包装细胞PT67中,将获得的病毒上清液感染人原发性肝癌non-SP(Side population)细胞,筛选稳定感染的细胞系non-SP-ABCG2和non-SP-puro,RT-PCR法检测细胞中ABCG2基因的转录水平,Western blot法检测细胞中ABCG2蛋白的表达水平,显微镜观察细胞形态的变化,Hoechst33342染色分析细胞的SP表型。结果逆转录病毒质粒pMSCVpuro-ABCG2经双酶切及测序证实构建正确;non-SP-ABCG2细胞中ABCG2基因的转录和蛋白表达水平均较空载体pMSCVpuro转染的细胞non-SP-puro明显提高;non-SP-ABCG2细胞的形态发生改变,成梭形生长,偶见小三角样细胞,细胞生长缓慢,细胞间排列不紧密,并出现了SP表型。结论 ABCG2基因的高表达与细胞SP表型的形成具有一定的相关性,并能影响细胞的基本形态。     

表达HIV-1 gp160膜蛋白靶细胞的制备及鉴定

目的获得表达INV-1 gp160膜蛋白的靶细胞,用于HIV-1特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)和抗HIV-1重组毒素细胞杀伤活性检测。方法采用PCR方法,从质粒pJen 10中扩增HIV-1 gp160基因,插入pGEM-T载体,测序后克隆入pIRESl neo载体中构建成重组质粒pIRE160,酶切鉴定正确后,转染人肝癌细胞(SMMG-7721),CA18加压筛选至细胞不再死亡为止,并采用Western blot和间接免疫荧光法对制备的靶细胞进行检测。结果HIV-1 gp160在SMMC7721表面表达,并裂解为gp120和gp41蛋白。结论已成功得到稳定表达HIV-1 gp160的靶细胞,且表达的蛋白具有良好的特异性。     

稳定表达绿色荧光蛋白标记的人单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体ORF2融合蛋白的Vero细胞株的建立

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框2(ORF2)融合蛋白的Vero细胞株。方法构建重组真核表达质粒pEGFP-ORF2,经酶切及测序鉴定正确后,体外转染Vero细胞,经G418筛选稳定表达融合蛋白的克隆,扩大培养后,荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR检测目的基因的转录。结果重组真核表达质粒pEGFP-ORF2经酶切及测序鉴定构建正确,经G418培养20d筛选出的Vero细胞株荧光显微镜下可见融合蛋白表达,RT-PCR检测显示,转染了重组表达质粒的Vero细胞内有目的基因的表达。结论已成功建立了稳定表达EGFP-ORF2的Vero细胞株,为进一步研究HSV-2LATORF2的功能奠定了基础。