谷氨酸棒杆菌人工核糖体结合位点(RBS)文库的建立与应用

核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)是一种重要的生物控制元件，是实现基因表达精细调控的重要工具，在微生物代谢工程和合成生物学中具有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物，被广泛应用于多种氨基酸和有机酸的工业化发酵生产。然而目前，关于谷氨酸棒杆菌RBS元件文库的报道仍然较少。该研究基于谷氨酸棒杆菌RBS序列基本特征，设计构建了一个随机RBS文库。利用流式细胞分选技术和96孔板筛选技术，建立了RBS文库高通量筛选方法。通过2步筛选，构建了一个调控范围广，覆盖范围均匀的人工RBS元件文库，调控范围达到29.04倍。利用α-淀粉酶表达系统对构建的人工RBS文库进行测试和表征，结果表明人工RBS文库具有较高的稳定性和通用性。随后该研究将人工RBS文库应用于L-高丝氨酸生物合成途径的调控优化。利用不同强度RBS元件对L-高丝氨酸合成途径关键酶LysC^r和Hom^r进行精细表达调控，获得了具有高效L-高丝氨酸合成能力的最佳组合，L-高丝氨酸产量到达12.7 g/...     

链霉菌S-pMS02发酵制备磷脂酶D的关键技术研究

实验室前期构建了重组链霉菌菌株S-pMS02用于高效分泌表达磷脂酶D（phospholipase D, PLD）,但是其PLD产量依然难以满足大规模生产需求。为了进一步提高PLD产量,该研究对S-pMS02的最佳产酶条件进行了探索,并改进了制备工艺。结果显示,该菌株最适发酵产酶碳源为可溶性淀粉、氮源为硫酸铵酪蛋白氨基酸复合物,此外1.5 g/L的Mg²⁺能显著提高PLD的产量。在接种孢子浓度为1×10⁵个/mL,发酵温度为32℃,发酵6 d时PLD酶活力达到最高,为25.56 U/mL。通过在发酵制备过程中使用剪切搅散和保温装置,进一步将PLD产量提升至33 U/mL,为最初的2倍。该研究的结果为促进PLD的生产以及工业化应用奠定了基础。     

牛凝乳酶原基因在食品级乳酸乳球菌中的重组表达

将牛凝乳酶原基因连接pNZ8149载体,并转化乳酸乳球菌NZ3900,经乳酸链球菌素Nisin诱导,测得重组菌株胞内凝乳酶活力达到0.7 SU/mL,培养基中检测不到凝乳酶活力,实现了牛凝乳酶原基因在乳酸链球菌Nisin诱导基因表达系统（nisin controlled gene expression system,NICE）中活性表达。在此基础上,将分泌信号肽SPusp45连接于pNZ8149,构建了分泌型表达载体pNZ8149s,并实现牛凝乳酶原基因在NICE系统中分泌表达。当使用1 ng/mLNisin诱导5 h后,重组菌株胞内检测不到凝乳酶活力,培养基中凝乳酶活力为1.2 SU/mL,说明pNZ8149s能够促使凝乳酶原从乳酸乳球菌中分泌。该方法为重组牛凝乳酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案。     

基于基因转录和代谢物分析的异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌YILW的理性改造

为获得异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）YILW的理性改造策略,考察该菌株与出发菌株C. glutamicum ATCC 13032异亮氨酸合成途径中关键酶及代谢产物的差异。结果表明,C. glutamicumYILW丙酮酸羧化酶编码基因pyc的下调表达使得其胞内草酰乙酸含量降低,过表达该基因显著增加胞内草酰乙酸含量及异亮氨酸产量（分别从1.32 μmol/g（细胞干质量,下同）和5.18 g/L提高至3.32 μmol/g和5.81 g/L）,但副产物赖氨酸及胞内2-酮丁酸积累量提高。针对该问题采用强启动子替换手段过表达ilvBNC操纵子,使得其异亮氨酸产量提高至6.63 g/L。为进一步增加异亮氨酸合成,过表达输出载体编码基因brnE和brnF,其产量提高至7.31 g/L,较出发菌株C. glutamicum YILW提高41.1%,转化率提高40.0%。由此可见,在基因转录及代谢物分析结果指导下理性过表达pyc、ilvBNC操纵子及brnE和brnF能够显著提高异亮氨酸产量并降低副产物浓度。     

代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶

为了获得四氢嘧啶生产菌株并利用此菌株提高四氢嘧啶产量,以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）野生菌株ATCC13032为研究对象,以赖氨酸积累量为评价指标,强化了天冬氨酸-β-半醛合成代谢流;通过阻断赖氨酸输出通道LysE,表达不同来源的四氢嘧啶操纵子ectABC,获得了四氢嘧啶生产菌株;通过强化天冬氨酸转氨酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生途径,进一步提高四氢嘧啶产量。结果表明,构建了一株高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株LYS-3,赖氨酸积累量为28.48 g/L;表达操纵子HEectABC的谷氨酸棒杆菌ECT-3四氢嘧啶产量达到17.21 g/L;过表达基因aspC和ECpntAB谷氨酸棒杆菌ECT-6,摇瓶发酵四氢嘧啶产量达到21.85 g/L。研究结果可为天冬氨酸-β-半醛衍生物的生物合成提供参考。     

谷氨酸棒杆菌3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶基因的克隆与过量表达

本实验对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) AS10111及其亚硝基胍诱变获得的丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型、抗3- 甲基色氨酸突变菌株JLC1 中3- 脱氧- α- 阿拉伯庚酮糖酸-7 磷酸合成酶(DS)基因进行克隆和序列分析,将突变体来源DS 基因构建pZ8-1-DSM 重组质粒,在谷氨酸棒杆菌突变株JLC1 中进行表达,重组菌株JLC1(pZ8-1-DSM)DS 酶活力分别是宿主菌和野生型菌株DS 酶活力的5.9 和7.3 倍,色氨酸产量达到14.90g/L,较宿主菌提高了65%。这表明通过在谷氨酸棒杆菌中过量表达3- 脱氧- α- 阿拉伯庚酮糖酸-7 磷酸合成酶基因可以有效提高该酶活力和色氨酸的产量。     

菊糖果糖转移酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

将PCR获得的不包含信号肽序列的菊糖果糖转移酶基因(ift)与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建重组载体pPIC9 K-IFTase.重组载体经线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性梯度筛选及PCR鉴定,获得一株高拷贝菊糖果糖转移酶重组毕赤酵母菌株.该重组菌株经甲醇诱导,能够分泌具有活性的菊糖果糖转移酶,且60h时酶活为10.3U/mL.结果表明,菊糖果糖转移酶可以实现在毕赤酵母的分泌表达.     

信号肽编码序列库的构建及耐热乳糖酶的分泌

为了实现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,建立一种较简便的方法筛选能够分泌该酶的信号肽,即针对11种信号肤构建信号肽编码序列库,采用随机筛选方法得到合适的信号肽,构建相应的分泌表达载体和重组表达菌株.结果表明,通过信号肽随机筛选方法获得的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE信号肽能够有效引导该酶的细胞外分泌,重组菌株摇瓶培养16h后,上清液中积累的耐热β-半乳糖苷酶活力达到64.02 U/mL,占该酶所表达的总酶活力的29.6％.该信号肽筛选方法可以为微生物蛋白质分泌过程中的信号肽快速选择和优化提供参考.     

信号肽对Bacillus subtilis表达环糊精葡萄糖基转移酶的影响

将来源于作者所在实验室构建保存E.coli p ET-20b(+)/CGT△E-CBMAmy的CGT△ECBMAmy基因插入6种含有不同信号肽(est A、bpr、vpr、ync M、yvg O和ywb N)的穿梭质粒p MA0911-SPs中,构建了6种重组表达载体并将其转入表达宿主B.subtilis WB600中,获得了6株重组菌。在相同的发酵条件下,est A信号肽介导的分泌效果最好,L-抗坏血酸2-葡萄苷产量达到0.81 g/L,明显高于其他5株重组菌。选取WBp MB/CGT△E-CBMAmy作为出发菌株,进行了摇瓶发酵条件优化,实现了CGT△E-CBMAmy酶的高效表达,最终使AA-2G产量提高了2.16倍,VC转化率达到21.9%。     

代谢工程改造Corynebacterium glutamicum生产L-苹果酸

以提高L-苹果酸的产量为目标,采用一次交换两次同源重组的方法,利用反向筛选标记,在敲除了丙酮酸醌氧化还原酶编码基因(pqo),丙酮酸脱氢酶编码基因(pdh)和乳酸脱氢酶编码基因(lldh)的C.glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C.glutamicumΔPPL)基础上,无痕敲除了L-苹果酸积累支流代谢途径的2个关键酶基因:苹果酸醌氧化还原酶编码基因(mqo)和苹果酸酶编码基因(male),同时敲入了苹果酸分泌转运蛋白基因(transb),获得了产L-苹果酸的工程菌株;采用高效液相色谱法检测了工程菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的发酵产物。实验结果表明:C.glutamicum ATCC 13032发酵后不积累L-苹果酸,而工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale发酵48 h,积累了12.8 g/L的L-苹果酸,工程菌的糖酸转化率为33.18%,为利用C.glutamicum ATCC 13032发酵生产L-苹果酸提供了基础遗传资源。     

以甘油为碳源发酵高产反式-4-羟脯氨酸菌株的选育及营养优化

以低品级甘油为碳源进行微生物发酵合成反式-4-羟脯氨酸(Trans-4-hydroxy proline,Hyp)的探索。从实验室构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/p UC19-ptrp2-Hyp出发,通过易错PCR随机突变和常压室温等离子体复合诱变处理,利用单菌落琼脂块和氨基酸显色相结合高通量筛选出1株以甘油为唯一碳源的Hyp高产菌P71。与葡萄糖培养基相比,该菌株更适合在甘油上生长并转化L-脯氨酸合成Hyp,发酵20 h产Hyp高达1.20g/L,比生长在葡萄糖培养基上高70%以上;比其出发菌株在葡萄糖培养基上产量提高了1倍以上。通过培养基成分系统优化,发现胰蛋白胨、Fe SO4和L-脯氨酸是3大主要影响因素,最适加量分别为7.01 g/L、11.51 g/L和1.41 mmol/L;在该条件下突变菌株摇瓶发酵12 h产Hyp达1.61 g/L,比优化前提高了50%。     

调控NADH/NAD~+对重组谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌中,L-丝氨酸由糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸经过3步反应生成,这个过程产生2个NADH,而L-丝氨酸的合成过程并不涉及NAD~+的生成,多余的NADH是否会影响菌株的生长及产L-丝氨酸?该研究通过外源添加NAD~+的前体物质烟酸,内源表达NADH氧化酶编码基因nox A,考察调控NADH/NAD~+对Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI生长和产L-丝氨酸的影响。结果表明,添加不同浓度烟酸,菌株的L-丝氨酸产量、生物量及糖耗较未添加时略有提高。而通过加强表达NADH氧化酶编码基因nox A,构建重组菌Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI-nox A,重组菌中NADH氧化酶比酶活是出发菌的11.6倍,L-丝氨酸产量达到28.93 g/L,较出发菌提高9.0%,糖酸转化率达到0.29 g/g蔗糖,较出发菌提高7.4%,OD562最大值为51.38,较出发菌提高6.6%,说明NADH氧化酶的过表达能够促进重组菌株的生长及碳源利用,提高菌株的L-丝氨酸产量。     

L-亮氨酸生物合成关键酶基因的克隆和表达

通过PCR获得黄色短杆菌ATCC14067基因组上编码L-亮氨酸合成途径中关键酶的基因.连接大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达质粒pDXW-8构建多种重组质粒,分别转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032考察对其发酵生产L-亮氨酸的影响.经摇瓶发酵实验显示:C.glutamicum ATCC13032发酵液中没有L-亮氨酸的积累而基因工程菌ATCC13032/pDXW-8-leuA-ilvBNC中L-亮氨酸的产量达4.75g/L.     

嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ的高效分泌表达及其酶学性质

本文探索了嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中的高效分泌表达条件,并对重组Tk-PUL的酶学性质进行了初步研究。通过构建Tk-PUL分泌表达信号肽筛选库,并结合高通量筛选方法,确定引导Tk-PUL在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达的信号肽。结果表明,在信号肽AmyE的引导下,重组Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中高效分泌表达。Tk-PUL属于单结构域双功能酶,同时具有α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性。重组Tk-PUL的α-淀粉酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为54.08 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。重组Tk-PUL的普鲁兰酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为110.39 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。本研究为Tk-PUL在淀粉酶法制糖工业中的应用奠定了基础。     

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶北大核心CSCD

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。     

一株清酒乳杆菌的分离、鉴定及培养基优化

从传统食品谷物发酵液中筛选出1株乳杆菌,通过生理生化试验与菌落和菌株形态观察以及16S rRNA测序鉴定为清酒乳杆菌。以MRS培养基为基础培养基,活菌数为指标,改变基础培养基组成的成分及添加量,在此基础上,通过响应面优化培养基组成。结果表明最优培养基组成为鱼蛋白胨14.50 g/L、酵母浸粉6.50 g/L、葡萄糖28.00 g/L、柠檬酸三铵1.50 g/L、磷酸二氢钾2.00 g/L、硫酸镁0.20 g/L、硫酸锰0.12 g/L、吐温-80 1.20 mL/L,此条件下,活菌数达到3.125×10⁹ CFU/mL,相比MRS发酵培养基活菌数(1.980×10⁸ CFU/mL)提高了1 478.28%。该优化培养基具有活菌数高和经济方便的特点,为清酒乳杆菌的工业化生产提供借鉴。     

β-1,3-葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达与性质

藤黄节杆菌（Athrobacter luteu）β-1,3-葡聚糖酶（βglⅠ）能够特异性的作用于β-葡聚糖中的β-1,3-糖苷键,在酵母裂解活性上具有突出优势,但是βglⅠ在生产上存在表达低、生产成本高的问题。作者利用无缝克隆技术构建表达载体,实现了βglⅠ在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,并通过比较不同Tat类型和Sec类型信号肽、RBS、5′UTR等表达元件来提高βglⅠ的胞外产量。结果表明,信号肽SPLipA使得βglⅠ表达水平提高了0.4倍,在此信号肽基础上继续比较各RBS和5′UTR序列,其中cry3A 5′UTR使βglⅠ产量高出出发菌株1.2倍。此外,利用Ni2+亲和层析柱纯化βglⅠ并对其酶学性质进行研究,结果表明该酶的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH为6.0,在0～45 ℃、pH 4.0～9.0的范围内稳定性较好,比活为973 U/mg。     

乳杆菌对肠内分泌细胞胰高血糖素样肽1分泌的影响

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是一种由肠道内分泌细胞产生的具有血糖调节作用的肠促胰岛素激素,肠道内乳杆菌(Lactobacillus)可能影响其分泌。该研究采用简单易操作的体细胞(有氧)-黏液层-细菌(微需氧)共培养体系分析3种乳杆菌[鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)和约翰氏乳杆菌(L.johnsonii)]对肠道内分泌细胞GLP-1分泌的影响。同时研究了菌株的剂量效应以及O₂和黏液层对共培养系统的影响。结果显示,1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷ CFU/1 000 mL的L.rhamnosus可增加细胞GLP-1的分泌。低浓度的L.plantarum和L.johnsonii(<1×10⁷ CFU/1 000 mL)不影响细胞GLP-1产生,但在浓度高于1×10⁸ CFU/1 000 mL时则会显著降低(P<0.05)GLP-1的分泌。黏液层是存在于...     

ARO10基因在Saccharomyces cerevisiae中的克隆表达及其对3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

研究了脱羧酶ARO10基因克隆与过量表达对酿酒酵母INVSc1 3-甲硫基丙醇合成途径的代谢流量影响。将脱羧酶基因ARO10与穿梭质粒pYES2连接,构建其酿酒酵母表达质粒(载体)pYES2-ARO10,LiAc/SSD-NA/PEG方法转化酿酒酵母菌株INVSc1中进行表达,验证ARO10基因过量表达对发酵产物3-甲硫基丙醇影响。结果表明,构建的酿酒酵母转化子SC10-1发酵120 h时,3-甲硫基丙醇生成量达到0.90 g/L,与未导入脱羧酶ARO10基因的对照菌株相比,3-甲硫基丙醇产量提高55.2%。因此,S.cerevisiae s288c中脱羧酶(EC 4.1.1.72)是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶,其增强脱羧酶基因ARO10的克隆及基因表达,有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。     

红色邻米草菌S2-4-1HT产六氢环庚基灵菌红素摇瓶发酵条件的优化

产自红色邻米草菌株S2-4-1H^T的六氢环庚基灵菌红素(six hydrogen cycloheptane prodigiosin, ShcPG)具有极高的抗肿瘤新药开发潜力。为提高摇瓶发酵产ShcPG的产量,试验的菌株为红色邻米草菌S2-4-1H^T,基础培养基为MB,以庚基灵菌红素(heptylprodigiosin, hPG)和ShcPG质量浓度为响应值,在单因素试验基础上采用Box-Behnken中心组合试验设计进行响应面试验,优化S2-4-1H^T菌株发酵条件,并构建二次回归方程。结果表明,发酵优化条件为温度28℃、pH 7.73和总盐度2.85%。在最佳发酵条件工艺下发酵48 h, hPG和ShcPG的总产量为5.71±0.12 mg/L,是用MB培养基培养产量的22.84倍,且预测值和测定值的绝对差值<5%,表明回归模型均可靠。该结果对红色邻米草菌S2-4-1H^T发酵开发生产Shc PG具有实际应用价值。