树突状细胞负载MAGE-n表位肽的体外免疫学效应研究

目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC)负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV体外诱导特异性CTL的能力及其抗肿瘤效应。方法:MAGE-n表位肽以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2+人外周血PBMC,连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞,用成熟的DC负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,用51Cr释放法检测CTL的杀伤活性,并用抗HLA-A2分子单抗进行杀伤抑制实验。结果:用DC负载MAGE-n表位肽QLVF-GIEVV可诱导特异性CTL反应,对MAGE-n阳性表达细胞有较强的杀伤作用。结论:DC负载抗原肽QLVF-GIEVV在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

联合表位肽诱导HLA-A2+人PBMC产生抗原特异性CTL及杀伤活性研究

目的:探讨MAGE-3,MAGE-n抗原表位体外联合诱导的CTL,并研究其特异性杀伤活性。方法:候选抗原表位以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2 人外周血PBMC,T2细胞负载抗原肽反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,LDH检测其杀伤活性。结果:联合表位肽体外刺激人PBMC,能够较强地诱导抗原特异性CTL并产生特异性杀伤。结论:MAGE-3与MAGE-n的HLA-A2限制性CTL表位肽的联合应用能够产生较强的体外抗肿瘤免疫反应。     

hMAM-A源性HLA-A2限制表位肽诱导CTL对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的:探讨hMAM-A源性HLA-A2限制性候选表位(KLLMVLMLAA)负载外周血树突状细胞(dendritic cells,DCs)诱导产生的细胞毒性杀伤细胞(CTL)对乳腺癌细胞的杀伤作用.方法:取HLA-A2+健康志愿者外周血,用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),体外用合成的肽段负载DC,不加肽的DC作为对照,采用流式细胞术测定DC的表型变化,ELISA测定IL-10、IL-12、IFN-γ分泌水平.CCK8法测定两种情况下DC诱导的自体CTL对(HLA-A2+/hMAM-A+)AU-565、(HLA-A2-/hMAM-A+)MDA-MB-415、(HLA-A2+/hMAM-A-)MCF-7乳腺癌细胞的杀伤效果.结果:成功培养出形态典型、功能成熟的DC,经肽负载的DC具有更典型的形态特征,DC表面标记分子(CD80、CD86、CD83、HLA-DR)较对照组稍高,上清中IL-12平均分泌水平较对照组高,IL-10平均分泌水平较对照组低,与T细胞共培养后IFN-γ分泌水平较对照组显著增高(P<0.05),对AU-565的杀伤效果显著优于MDA-MB-415、MCF-7乳腺癌细胞.结论:成功预测出hMAM-A源性HLA-A2+限制性CTL表位肽,其致敏的DC可有效呈递表位肽,诱导的CTL对乳腺癌细胞产生特异性杀伤.     

负载酸洗抗原肽的树突状细胞诱导抗膀胱癌的作用

目的研究弱酸洗脱法提取抗原肽致敏的树突状细胞(DCs)诱导针对膀胱癌细胞的特异性杀伤效应。方法弱酸洗脱法获得BI U-87细胞抗原肽,用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导正常人DC并负载肿瘤抗原,进而激活T淋巴细胞;用MTT法检测其对BI U-87体外杀伤效应。结果弱酸可以洗脱肿瘤细胞膜表面大部分与MHC-Ⅰ类分子结合的抗原肽;外周血单个核细胞可培养出DC;效靶比40:1时负载膀胱癌抗原肽的DC诱导特异性CTLs可杀伤高达(78.5±7.0)%的BI U-87细胞。结论弱酸可以有效洗脱肿瘤细胞表面的Ⅰ类抗原肽,负载该类多肽的DC在体外可诱导出高效而特异的抗膀胱癌效应。     

肝癌细胞抗原致敏树突状细胞诱导的体外抗肿瘤作用

目的　探讨原发性肝癌患者外周血树突状细胞 (DC)经自体肝癌细胞抗原致敏后诱导的体外抗肿瘤作用。方法　对肝癌患者外周血采用密度梯度离心法分离 ,获得DC前体细胞 ,用重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白细胞介素 4(rhIL 4)联合培养 ,诱导扩增DC。制备自体肝癌细胞抗原 ,体外脉冲DC ,检测DC诱导自体T细胞增殖能力及细胞毒性T细胞 (CTL )在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性 ,并检测肿瘤抗原致敏DC分泌的IL 12水平。结果　经自体肝癌细胞抗原致敏的DC能分泌IL 12和诱导较强的自体T细胞增殖 ,且能诱导特异性CTL ,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性 ,杀伤率显著高于DC、未经肝癌细胞抗原致敏的DC激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率 ,而对CT 2 6细胞、BEL 740 2细胞无明显的杀伤作用。结论　肝癌患者外周血DC经自体肝癌细胞抗原致敏后能诱导高效而特异的抗肝癌免疫 ,其机制可能与增强T细胞应答和诱导机体产生肿瘤特异CTL从而发挥特异性的抗肿瘤作用有关。     

EBV-LMP2A肽诱导的特异性CTL对EBV阳性胃癌细胞的体外杀伤作用

目的:探讨HLA限制性EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)表位肽EBV-潜伏膜蛋白2A (EBV-latent membrane protein 2A,EBV-LMP2A)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对EBV阳性胃癌细胞的体外杀伤作用.方法:选用南京大学医学院附属肿瘤医院肿瘤中心HLA-A2阳性胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)、人胃腺癌细胞株(AGS)和人EBV阳性胃腺癌细胞株(AGS-EBV),通过改良的体外细胞培养技术用HLA-A2限制性的EBV-LMP2A抗原肽从人PBMC中诱导扩增出特异性CTL,采用四聚体技术和流式细胞术检测抗原肽诱导产生的特异性CTL的含量,通过FITC-PI标记流式术检测EBV-CTL对EBV阳性和EBV阴性的胃癌细胞的体外杀伤作用.结果:经改良的细胞培养技术和抗原肽双重刺激后EBV-LMP2A抗原肽可以诱导产生出高比例的抗原特异性CTL[EBV-LMP2A-356特异性T细胞占CD8+T细胞的(47.1±5.2)％];EBV-CTL对EBV阳性胃癌细胞的体外杀伤作用较EBV阴性的胃癌细胞明显增强[(45.1±9.3)％s(19.4±2.5)％,P＜0.05].结论:通过改良的细胞培养技术使用EBV-LMP2A抗原肽能诱导产生高比例的EBV特异性CTL,其对EBV阳性胃癌细胞有较强的特异性杀伤作用.     

负载肝癌抗原的树突状细胞瘤苗诱导的抗肿瘤作用

目的 探讨原发性肝癌患者外周血树突状细胞（DC）体外经自体肝癌细胞抗原致敏后诱导的抗肿瘤作用。方法肝癌患者外周血经梯度密度离心法分离，获得DC前体细胞，用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSP）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）联合培养，诱导扩增DC。制备自体肝癌细胞抗原，体外脉冲DC，检测DC诱导自体T细胞增殖能力及细胞毒性T细胞（CTL）在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性，并检测肿瘤抗原致敏DC分泌的IL-12水平。结果经自体肝癌细胞抗原致敏的DC能分泌IL-12和诱导较强的自体T细胞增殖，且能诱导特异性CTL，该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性，杀伤率明显高于DC、未经肝癌细胞抗原致敏的DC激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率，而对3LLLEWIS肺癌细胞、H22肝癌细胞则无明显的．杀伤作用。结论肝癌患者外周血DC经自体肝癌细胞抗原致敏后能诱导高效而特异的抗肝癌免疫，其机制可能与增强T细胞应答和诱导机体产生肿瘤特异CTL而发挥特异性的抗肿瘤作用有关。     

宫颈癌患者外周血树突状细胞抗宫颈癌免疫反应

[目的]研究自宫颈癌患者外周血分离、培养而来的树突状细胞体外对宫颈癌Hela细胞的抑制作用.[方法]应用细胞因子诱导培养从宫颈癌患者外周血分离的单核细胞,获得成熟DC.宫颈癌组织来源抗原致敏DC,激活T细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL).MTT法检测比较负载抗原DC与未负载抗原DC诱导的CTL对Hela细胞和SKOV3细胞不同的杀伤效应.[结果]宫颈癌细胞抗原致敏的DC,激活肿瘤抗原特异性CTL,对宫颈癌Hela细胞产生高效而特异的杀伤作用(56.410%),对卵巢癌SKOV3细胞仅有一定的杀伤作用(24.901%);而未致敏DC激活的CTL对以上两种肿瘤细胞只有很低的杀伤作用,分别为10.256%和20.151%.单纯肿瘤抗原刺激下的T细胞,对Hela和SKOV3细胞产生非特异性杀伤作用,其效率仅为1.865%及15.613%.[结论]宫颈癌患者外周血DC在体外能诱导高效而特异的抗宫颈癌细胞免疫反应,提示肿瘤抗原激活的DC作为疫苗在宫颈癌的免疫治疗中具有重要意义.     

泰素耐药相关基因-3细胞毒性T淋巴细胞表位负载树突状细胞疫苗的体外免疫效应研究

目的探讨泰素耐药相关基因(TRAG)3来源的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位负载树突状细胞疫苗的体外免疫效应,为临床开展基于TRAG3表位的特异性免疫治疗奠定基础。方法采用标准Fmoc方案合成表位肽,以反相高压液相色谱仪(RPHPLC)纯化、分析多肽,质谱鉴定多肽;从外周血单个核细胞(PBMC)分离培养树突状细胞(DC),应用相差显微镜和电镜从形态学上鉴定DC,采用流式细胞仪(FACS)分析DC表型;将TRAG3CTL表位肽(50μg/ml)负载的DC体外刺激PBMC3周,应用51Cr释放分析检测效应细胞CTL活性,同时应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测效应细胞IFNγ的分泌。结果Fmoc方案合成的表位肽纯度>90%,质谱鉴定的分子量与预计值一致;PBMC分离培养的DC在光镜、电镜下显示了其特殊形态,FACS分析证实其具有成熟DC的表型;经TRAG3表位肽负载的DC在体外能够有效活化特异性抗瘤CTL反应,并能显著刺激效应细胞内IFNγ的释放。结论TRAG3CTL表位肽负载的DC疫苗在体外能够有效激发抗瘤CTL免疫反应,可开展进一步的临床实验。     

肝癌树突状细胞瘤苗诱导抗肿瘤作用的研究

目的：研究负载肝癌抗原的肝癌树突状细胞（dendritic cell,DC）瘤苗诱导的抗肿瘤作用。方法：于体外用rhGM-CSF和rhIL-4从肝癌患者外周血诱导DC,并用肝癌细胞抗原冲击致敏,制成负载肝癌抗原的肝癌DC瘤苗。肝癌DC瘤苗活化自体T淋巴细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic of T-lymphocytes,CTL）,采用流式细胞术检测CTL分型;乳酸脱氢酸（LDH）4 h释放法检测CTL对肝癌细胞的特异性杀伤作用。MTT法检测肝癌DC瘤苗及其活化CTL培养上清对肿瘤细胞的抑制作用;ELISA法检测肝癌DC瘤苗活化的CTL培养上清中IL-12、IFN-γ和TNF-α水平。结果：经肝癌DC瘤苗活化后的T淋巴细胞群中,CD56^＋细胞数量显著减少,CD4^＋T和CD8^＋T细胞数量增加,其中以CD8^＋T细胞增加较明显;细胞毒实验显示,该CTL对自体肝癌细胞具有较强的杀伤作用,而对与致敏DC的肝癌抗原无关的CT26结肠腺癌细胞无明显杀伤作用;单纯肝癌DC瘤苗或其激活的CTL培养上清也表现出较强的抑瘤作用,而且这种抑瘤作用具有广谱性,可抑制多种肿瘤细胞的生长;在CTL培养上清中可检测到IL-12、TNF-α和IFN-γ的含量。结论：肝癌DC瘤苗不仅诱导了对肝癌细胞的特异性CTL杀伤作用,而且可激活CD4^＋T和CD8^＋T细胞分泌IL-12、TNF-α和IFN-γ等细胞因子,以非杀伤方式直接或间接地抑制肿瘤细胞生长,发挥非特异性的抗肿瘤作用。     

树突状细胞负载的exosome疫苗抗胶质瘤的实验研究

目的：旨在分离胶质瘤细胞释放的exosomes,致敏外周血树突状细胞（dendritic cell,DCs）,观察其对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）的激活效应。方法：离心超滤和蔗糖密度梯度离心法分离胶质瘤细胞释放的exosomes,固相免疫电镜法（SPIEM）制备exosomes的MAGE-1及ICAM-1免疫电镜标本。常规方法从外周血单个核细胞诱导DCs并分离T细胞,将胶质瘤细胞来源的exosomes冲击或未冲击的DCs与T细胞共培养。MTT比色法检测体外细胞毒活性。结果：胶质瘤细胞分泌的exosomes为直径50-100nm的膜性微囊,经抗MAGE-1、ICAM-1抗体-胶体金免疫电镜标记,囊外膜可见点状？颗粒状电子致密物沉积。培养后DCs的表面标志物CD1a、HLA-DR、CD83、CD86的表达率较培养前明显升高,差异有显著性（P〈0.05）。exosomes致敏的外周血DCs激活CTLs的能力显著高于肿瘤冻融抗原致敏的DCs组,在效靶比为50：1时,两组CTLs对胶质瘤细胞的杀伤率为70.4%±4.1%vs30.1%±2.8%,（P〈0.05）。结论：胶质瘤细胞分泌的exosomes负载外周血DCs后活化CTLs,发挥抗肿瘤活性,可以作为一种有效的抗胶质瘤免疫治疗策略和方法。     

AFP与HBsAg混合多肽负载树突状细胞治疗HBV阳性肝癌的研究

目的：以AFP和HBsAg为双靶标,以树突状细胞（DCs）为抗原载体与佐剂,探讨其激发特异性（CTL）反应的能力及其在HBV阳性肝癌（HCC）患者应用的可行性。方法：采集20例HLA—A201＋HBV＋AFP＋HCC患者外周血,分离单核细胞（Mo）和外周淋巴细胞（PBLs）,将Mo诱导为成熟DCs（mDC）;人工合成AFP和HBsAg多肽,负载mDC后体外致敏,检测其体外杀伤活性;同时于患者皮内注射负载AFP和HBsAg混合多肽的DCs,监测接种前后患者外周血中细胞因子和特异性CTL水平变化,并进行DTH试验,治疗后跟踪检测患者AFP水平和乙肝两对半水平的变化。结果l患者外周PBLs经DCs致敏后,对负载AFP和HBsAg多肽的T2靶细胞杀伤率明显增高,P〈0．05。接种负载AFP和HBsAg多肽的DCs后,血清中IL-2、IL-12、IFN-γ水平较治疗前显著升高,P〈0．05,TNF-a和IL-10水平较治疗前均差异不大,P〉0．05;DTH试验阳性率为41．7％（5／12）,患者外周血中特异性CTLs比例明显上升的有4例（4／12）。治疗后有4例患者AFP水平下降,9例HBeAg阳性的患者中有3例HBeAg下降,2例患者出现血清学应答。结论：负载AFP和HBsAg多肽的Dcs体内、体外均具有激发特异性cTLs反应能力,可诱导Thl型细胞因子的分泌,有望成为一种HCC治疗的新方法。     

Streptococcal preparation OK-432 promotes the capacity of dendritic cells (DCs) to prime carcinoembryonic antigen (CEA)-specific cytotoxic T lymphocyte responses induced with genetically modified DCs that express CEA

Cancer immunotherapy using dendritic cells (DCs) adenovirally transduced with the whole tumor-associated antigen (TAA) gene is an effective approach. Streptococcal preparation OK-432 is useful for stimulating DCs in terms of maturation. In this study, we established carcinoembryonic antigen (CEA)-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) using in vitro stimulation with adenovirally modified human DCs that express CEA. We investigated whether OK-432 stimulation could be more effective in inducing CEA-specific CTLs compared with other typical stimuli. DCs adenovirally transduced with the CEA gene were cultured under various conditions with tumor necrosis factor (TNF)-alpha, lipopolysaccharide (LPS), or OK-432. A cytotoxicity assay using peripheral blood mononuclear cell (PBMC)-derived CTLs was performed in a 4 h-51Cr release assay. OK-432 stimulated immature DCs to acquire a mature phenotype and to produce significant amounts of T-helper 1 cytokines. In all groups (immature DCs, TNF-alpha/DCs, LPS/DCs, OK-432/DCs), CEA-specific CTLs were generated. OK-432-stimulated DCs (HLA-A24) induced the most potent cytotoxic activity against CEA-expressing targets (A24) but not against controls. OK-432/DCs were able to induce markedly potent CTLs specific to target cells pulsed with CEA652 peptide (HLA-A24-restricted peptide), although others failed to induce potent CTLs. In conclusion, the CTL induction protocol using adenovirally modified DCs that express CEA after maturation with OK-432 showed a potent antitumor activity against CEA-expressing target cells, and is therefore promising for clinical applications as a cancer vaccine therapy.     

bcr／abl基因修饰树突细胞疫苗诱导CTLs杀伤K562细胞体外实验研究

背景与目的：T细胞介导的特异性免疫效应在慢性粒细胞白血病的治疗中发挥着重要作用,而以树突细胞（dendriticcell,DC）为中心的免疫治疗是目前肿瘤生物免疫学治疗的热点之一。本研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体,介导慢性粒细胞白血病bcr／abl基因片段转导DC制备疫苗,观察bcr／abl基因修饰DC疫苗诱导产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）在体外对白血病K562细胞的杀伤效应。方法：应用RT—PCR法扩增慢性粒细胞白血病bcr／abl基因片段．构建复制缺陷型重组腺病毒质粒。并包装产生重组腺病毒。体外诱导培养外周血单个核细胞来源DC,观察DC分别经重组腺病毒转染及多肽负载后,诱导产生特异性的CTLs在体外对白血病K562细胞的杀伤效应。结果：成功构建了携带bcr／abl基因片段的复制缺陷型重组腺病毒表达载体,包装产生的重组腺病毒滴度高达2．0×10^10pfu／mL。体外转染DC效率达到50％～60％,成功制备了bcr／abl特异性DC疫苗。体外实验中,在40：1和20：1效靶比下,bcr／abl基因修饰DC疫苗对K562细胞的杀伤效应分别为（47．6±4．7）％和（47．5±1．6）％,多肽负载DC为（25．8±4．4）％和（24．6±6．3）％,空白DC为（5．7±1．3）％和（4．5±1．6）％,基因修饰DC疫苗诱导的杀伤效应明显高于多肽负载及空白组（P〈0．05）。结论：以重组腺病毒为载体介导bcr／abl基因片段转导DC制备的基因修饰DC疫苗,具有显著的诱导CTLs杀伤白血病K562细胞的作用。     

DCs诱导特异性CTL抗非霍奇金淋巴瘤作用的研究

目的：探讨树突状细胞（dendritic cells,DCs）及经DCs诱导的肿瘤特异性CTL（cytotoxic T lympho-cyte,CTL）对杀伤非霍奇金淋巴瘤（NHL）细胞的作用。方法：分选DCs,NHL细胞株（Raji）冲击DCs,诱导产生CTL,加入荧光标记的抗体100μl（分别为抗CD11a、CD86、CD83的单抗）,FACScan检测其表型,MTT检测其刺激淋巴细胞的能力。LDH释放实验检测DC诱导的CTL的杀伤作用。结果：DC可刺激T细胞增殖;CTL对Raji细胞有杀伤作用,CTL与Raji细胞比例为100：1、10：1时,对Raji细胞的杀伤率为（57.1±3.7）%、（35.8±6.2）%,两者有显著差异（P〈0.05）。结论：DC及CTL对NHL能产生高效的杀伤作用。     

K-ras 抗原致敏的DC诱导CTL 对胰腺癌体内杀伤活性的研究*

目的:研究K-ras多肽的致敏树突状细胞（DC）活化的特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）对胰腺癌的体内外杀伤作用。方法:联合应用粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4 诱导培养外周血DC。表达K-ras突变体的胰腺癌细胞株全瘤、单纯K-ras突变体多肽和K-ras突变体表位肽阳离子纳米颗粒分别致敏DC。致敏DC刺激T 淋巴细胞得到肿瘤抗原特异的细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）。 Patu 8988、SW1990细胞系制备荷瘤裸鼠模型评价CTL 体内抗肿瘤活性。结果:负载全瘤抗原的DC其诱导产生的CTL 对胰腺癌有较好的抑制,负载单纯K-ras（12-Val ）突变体多肽、K-ras（12-Val ）突变体表位肽阳离子纳米颗粒的DC其诱导产生的CTL 对表达K-ras（12-Val ）突变体阳性（Patu 8988）的胰腺癌有较特异的抑制作用,而对K-ras（12-Val ）突变体阴性（SW1990）的胰腺癌的抑制作用与对照组比较无显著性差异。结论:负载肿瘤抗原的DC诱导的CTL 可显著提高对荷瘤裸鼠的生存时间,抑制肿瘤的生长速度,并显示其可增加抗肿瘤特异性。      

基因腺病毒感染树突状细胞诱导CTL对胶质瘤细胞的杀伤作用

目的:研究EPHA2基因修饰的树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lympho-cyte,CTL)对U251胶质瘤细胞的杀伤效应,为胶质瘤的免疫治疗提供新的方法。方法:将重组EPHA2腺病毒rAd-EPHA2感染HLA-A2阳性的人外周血来源的DC,制备EPHA2基因修饰的DC疫苗,Western blotting和FACS方法检测感染后DC的EPHA表达。以DC疫苗体外刺激HLA-A2阳性的单个核细胞,酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)和标准51Cr释放实验分别检测DC疫苗所诱导的CTL活性和对HLA-A2阳性的U251细胞的杀伤作用(另设rAd-Lac Z感染的DC组和PBS组作为对照)。结果:成功制备了EPHA2基因修饰的DC疫苗,其可有效表达EPHA2蛋白。与感染rAd-LacZ的DC和PBS组相比,感染rAd-EPHA2的DC疫苗能有效激发CTL活性[(187±21)vs(12±4)、(18±5)个,P<0.01];所诱导的CTL对胶质瘤U251细胞有明显的杀伤效应[(45.7±6.8)%vs(7,1±4.5)%,P<0.01],对自身淋巴细胞没有杀伤效应。结论:EPHA2基因修饰的DC疫苗能有效激发CTL活性,并对胶质瘤U251细胞有明显的杀伤活性。