紫花苜蓿转录因子MsNF-YB4的克隆及其耐盐作用的评价

核因子Y的B亚基(NF-YB)可以在植物的生长、发育和抗逆响应中调节多种基因的表达,在植物的各种生理活动中发挥重要作用。紫花苜蓿是重要的牧草,具有较强的抗逆能力。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个NF-YB基因,即MsNF-YB4(Gen Bank登录号为KX966286)。该基因的开放阅读框长度为405 bp,编码134个氨基酸残基。经过比对发现,该基因与蒺藜苜蓿的NF-YB4(Mt NF-YB4)在m RNA的编码区内同源性为92%,而在蛋白水平上的同源性为94%。通过比对分析,发现MsNF-YB4含有典型的NF-YB转录因子保守结构域。我们通过qPCR的方法对MsNF-YB4基因的表达模式进行了分析,结果发现,在盐碱和干旱胁迫下,根瘤和根中的表达量显著上调,暗示该基因在盐碱和干旱胁迫的响应中发挥作用。我们构建了植物表达载体pCBC-MsNF-YB4,并通过农杆菌介导法获得了过量表达MsNF-YB4基因的转基因烟草。对T1代转基因烟草的耐盐性测试结果表明,MsNF-YB4基因的表达提高了转基因烟草的耐盐性,转基因烟草幼苗可以在含有1.4%Na Cl的培养基上生长。这些结果表明,MsNF-YB4在紫花苜蓿的盐胁迫响应中发挥重要作用。     

水稻转录因子NF-YB家族的生物信息学分析

转录因子NF-YB (nuclear factor-YB)家族是核因子Y (nuclear factor Y, NF-Y)家族的一个亚家族,在调控胚发育、形态建成、开花时间、株高、穗粒数等方面,尤其是在非生物胁迫应答中发挥着重要的作用。为揭示水稻NF-YB基因家族的信息及特征,加快基因家族功能挖掘进程,本研究利用生物信息学手段对该基因家族及其编码蛋白进行分析。结果表明,水稻中共有13个NF-YB基因,在染色体上分布不均匀,所编码的蛋白都定位在细胞核,且不含跨膜结构域或信号肽。多重序列比对,二级结构,三级结构以及基序分析表明,该家族成员保守性较高,均含有高度保守的CBF/NF-Y结构域。进化分析表明NF-YB家族基因的分化早于物种的分化。磷酸化位点和互作蛋白网络分析初步预测了家族成员的互作蛋白网络。本研究为后期NF-YB家族成员的功能研究,加快家族基因的实际应用进程提供了帮助。     

1个新棉花bHLH类基因GhbHLH130的克隆及表达分析

近年来,已发现碱性/螺旋-环-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix,bHLH)类转录因子家族在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究通过电子克隆方法得到1个新的棉花bHLH类转录因子基因的全长序列,利用反转录-PCR技术从陆地棉中分离出1个bHLH类转录因子基因,并命名为GhbHLH130。该基因包含1个552 bp的开放阅读框,编码184个氨基酸残基。序列分析表明GhbHLH130蛋白包含1个螺旋-环-螺旋(Helix-Loop-Helix)保守结构域,属于bHLH转录因子家族。实时荧光定量分析结果表明GhbHLH130基因的表达受干旱、高盐、低温以及外源脱落酸的显著诱导。亚细胞定位结果表明GhbHLH130基因在细胞核内表达。本研究结果表明GhbHLH130基因可能作为调控基因参与棉花的逆境应答响应过程。     

木薯转录因子基因MeHDZ14的克隆与分析

HD-Zip家族基因在植物生长发育和逆境胁迫中起重要作用。为了研究MeHDZ14基因在非生物胁迫(尤其是干旱)应答中的作用,选用对干旱信号反应灵敏、相对耐旱的木薯品种"SC124"作为实验材料,利用RT-PCR克隆了MeHDZ14基因。生物信息学分析发现,MeHDZ14基因编码的蛋白具有典型的HD-Zip保守结构域。将该基因编码的蛋白与GFP融合,亚细胞MeHDZ14:GFP重组蛋白定位于细胞核。同时,酵母Y187中的转录自激活试验结果也表明,MeHDZ14蛋白具有明显转录自激活功能。推断MeHDZ14是一个典型的HD-Zip I转录因子。MeHDZ14启动子区具有多个ABA响应元件ABRE(ABA response element)。基因差异表达分析结果表明,MeHDZ14基因在叶片和根中的表达受干旱胁迫的诱导,并对外源ABA具有明显的响应。因此,认为MeHDZ14基因通过ABA依赖信号传导途径参与调控木薯干旱响应。此外,还发现MeHDZ14基因的编码区虽然存在数个SNP,但表现出高度保守性,且在不同木薯品种中的表达对干旱胁迫均有明显的响应,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

小桐子WOX基因家族全基因组鉴定与表达分析

WOX转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用。基于全基因组和转录组测序数据,本研究首次对小桐子WOX转录因子保守域、保守基序,染色体定位和不同条件下的表达模式进行了全面的分析。总共12个WOX蛋白在小桐子基因组中被鉴定。保守域分析表明,12个小桐子WOX蛋白的结构域均含有螺旋-环-螺旋-拐角-螺旋基序。染色体定位分析表明,小桐子12个WOX蛋白不均匀地分布在7个连锁群(LGs)上,然而,没有WOX蛋白定位于LG1、LG5、LG7和LG8。系统发育树的结果表明,12个小桐子WOX蛋白被分成3个组即Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ。在这12个WOX基因中,部分基因在被检测的组织中(根,茎皮层,叶和种子)显示出差异表达模式,如1个WOX基因(JcWOX1)在根中表达最高,3个WOX基因(JcWOX3, JcWOX7, JcWOX12)在种子中表达最高。此外,表达模式和qRT-PCR分析显示,3个小桐子WOX基因的表达在至少一个胁迫(干旱或者盐)条件下显示出至少2倍的增加或者降低。在这3个差异表达小桐子WOX基因中,2个WOX基因(JcWOX1, JcWOX6)在至少一个处理时间点表现出对干旱和盐胁迫响应,1个基因(JcWOX5)仅仅对干旱胁迫响应。该结果将为进一步研究WOX基因在调控小桐子生长发育和非生物胁迫响应中的作用提供一些有价值的信息,为小桐子WOX基因的功能研究与利用提供科学依据。     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

梭梭HaNAC2基因克隆、表达分析及亚细胞定位

本研究从梭梭中克隆得到1个NAC转录因子,命名为HaNAC2。同源性比对分析结果显示该基因含有典型的NAC蛋白结构域。系统发育分析结果推测该蛋白属于NAC家族第Ⅰ组的SENU5亚家族,组织特异性分析结果表明该基因在梭梭同化枝中表达量最高,荧光定量PCR结果显示该基因的表达量随干旱胁迫时间的增加而升高,推测其表达受干旱胁迫诱导。本研究克隆了该基因的启动子并进行分析,结果发现HaNAC2基因的启动子含有启动子固有元件,如TATA-box,CAAT-box等,还含有一些调控元件如MYB结合位点、组织特异性表达响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列。通过PEG介导的原生质体转化法进行亚细胞定位分析,结果显示该蛋白定位于细胞核。本研究初步探索了HaNAC2基因的表达及定位,为进一步研究该基因在梭梭抗旱中的功能打下基础。     

紫花苜蓿MsERF003的基因克隆及其在干旱胁迫中的功能分析

ERFs转录因子属于AP2/ERF转录因子超家族,在植物生长、发育和逆境胁迫响应调节中具有重要的作用。紫花苜蓿是重要的牧草,具有较强的抗旱能力。本研究通过RT-PCR的方法从紫花苜蓿中克隆了一个ERF基因,即MsERF003。该基因的开放阅读框长度为570 bp,编码190个氨基酸残基。序列比对发现,该基因与来自蒺藜苜蓿的同源基因PPLZ02 (LOC11427311)的mRNA的编码区同源性为99%,在氨基酸水平的同源性为98.94%。通过qPCR方法对MsERF003基因的表达模式进行了分析,我们发现在干旱胁迫的条件下,在各个组织中的表达量均有上调,在茎和荚果中尤为显著,暗示该基因在响应干旱胁迫时,主要在茎和胚胎发育中发挥作用。我们预测了可能与Ms ERF003高度同源的PPLZ02的互作蛋白,发现其与多种转录因子和酶类互作。我们构建了植物表达载体pCBC-MsERF003,并利用农杆菌转化法获得过量表达该基因的转基因烟草。抗旱性评估结果显示,在干旱处理后,过量表达Ms ERF003的转基因烟草植株比野生型有更好的保水性,其脯氨酸含量极显著高于野生型,显示出更强的抗旱能力。本研究为进一步探究紫花苜蓿的抗旱性调控提供了有益参考。     

甜菜ERF转录因子基因克隆及非生物胁迫响应分析

ERF(Ethylene-responsive element binding factors)是调控植物生长发育和响应胁迫的重要转录因子，在植物应对生物及非生物胁迫反应、调控胁迫相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性中起着重要的作用。分析甜菜ERF转录因子基因在非生物胁迫下的表达规律，旨在为深入研究ERF转录因子在甜菜逆境胁迫应答中的作用机制提供理论依据。本研究以高糖型甜菜品系‘BS02’为试材，利用RT-PCR方法克隆得到Bv＿ammr基因，并对其进行生物信息学分析。该基因CDS区长906 bp，编码301个氨基酸。蛋白质分子量为33.19 kD，理论等电点为8.61，其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，具有一个AP2保守结构域；氨基酸序列的同源性和进化树分析显示其编码蛋白与马兜铃菌毛所编码的蛋白亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR方法观测非生物胁迫下该基因表达模式，结果表明，Bv＿ammr基因对低温、高温、干旱、盐、ABA等非生物胁迫有不同程度响应。     

紫花苜蓿(Medicago sativa)YABBY基因家族的生物信息学分析及其对逆境胁迫的响应

YABBY转录因子家族是植物特有转录因子,与植物形态有关,在植物响应胁迫方面也有重要的调控作用。为了研究YABBY基因家族在苜蓿抗逆性中的作用,本研究利用生物信息学对苜蓿的YABBY转录因子家族成员、分布及结构等进行分析。对苜蓿、大豆、水稻和拟南芥进行系统进化树的分析,表明该家族基因在植物中具有同源性。理化性质和结构分析表明,苜蓿中YABBY基因主要分布在第2、4、5条染色体上,苜蓿YABBY家族基因中包含5个保守结构域,其蛋白质主要以无规则卷曲的形式构成,α-螺旋、β-折叠和β-转角含量较少,启动子序列分析发现该家族存在ABRE顺式反应元件,能够响应盐胁迫及ABA(Ascisic acid)胁迫,通过基因表达模式分析,发现MsYABBY2基因响应盐、碱、干旱等逆境胁迫,推测其在抗逆境胁迫中起到关键调节作用。本研究为后续研究MsYABBY基因的抗逆机制及调控机理提供了理论基础。     

玉米小分子热激蛋白ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析

植物热激蛋白是一类代表性高温响应蛋白。以玉米种质POB21为材料,克隆了一个CDS序列长度为477 bp的小分子热激蛋白基因。该基因编码的蛋白含158个氨基酸,具有HSP20蛋白典型的ACD结构域,预测的等电点为5.36,分子量为17.746 k D,被命名为Zm HSP17.7。在水稻、拟南芥等植物基因组中都有其同源基因,进化和亚细胞定位分析表明,此基因属CI类小分子热激蛋白家族成员。Northern杂交分析表明,高温快速诱导Zm HSP17.7基因表达,15%PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达,但在复合胁迫下干旱增强了高温的诱导效果。外源ABA也不影响该基因的表达。与野生型拟南芥相比,超表达Zm HSP17.7的转基因拟南芥在种子萌发和植株生长过程中表现出更强的高温和干旱耐受性,说明该基因可以在植物防御高温、干旱及复合胁迫中发挥一定作用。     

砂藓(Racomitrium canescens)抗旱相关过氧化氢酶基因RcCAT的克隆与表达分析

在植物抵御和适应干旱胁迫的过程中,细胞中的氧化还原水平的调节十分重要,过氧化氢酶(catalase,CAT)是细胞氧化还原调控系统中的一个关键酶。砂藓(Racomitrium canescens)是一种具有强抗旱和旱后复水能力的藓类植物,其中能够响应干旱处理的基因和蛋白质可能与其抗旱特性功能相关。在本研究中,我们发现了一个在砂藓干旱处理转录组数据中呈上调表达的过氧化氢酶基因,将其命名为RcCAT,我们对这个基因的CDS序列进行了克隆和相关的生物信息学分析,并对砂藓复水和快速脱水过程中RcCAT具体的表达变化进行了检测。RcCAT的CDS全长1560 bp,编码含有519个氨基酸残基的多肽序列。对RcCAT蛋白质的氨基酸序列进行生物信息学预测,结果显示RcCAT相对分子质量为58.6 kD,理论等电点为6.52,不含有跨膜结构和信号肽,具有过氧化氢酶的保守结构域,与其它苔藓植物中的一些过氧化氢酶序列同源性较高,属于不稳定的亲水性蛋白质。在砂藓的复水和快速脱水过程中,RcCAT的表达水平均呈现快速大幅度的变化趋势,具有表达变化峰值,说明该基因具有能够快速响应干旱胁迫的可能性。本研究为从基因表达水平研究过氧化氢酶生物学功能提供理论依据,为进一步挖掘砂藓抗旱机制提供基础资源。     

花生NBS-LRR类基因P9的克隆与序列分析

为探索花生NBS-LRR类基因在花生抗病中的分子作用机制,本研究以花生品种‘Z525’为试验材料,采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,克隆了花生叶片中的P9基因。结果表明,获得一个长度为3557 bp的序列,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF),ORF的长度为3195 bp(93 bp^3287 bp),编码1064个氨基酸(120.4 kD),等电点pI为5.92。序列分析表明,该基因编码的蛋白与花生中假定的抗性蛋白RPP13-like及花生二倍体野生种Arachis duranensis和Arachis ipaensis推测的抗病蛋白At3g14460、RPP13-like高度相似;P9蛋白属于NBS-LRR家族,具有典型的NB-ARC和LRR-3两个保守结构域,推测该基因参与花生抗病调控过程。蛋白质亚细胞定位预测表明该基因编码的蛋白主要位于叶绿体中,可能少量分布于细胞核中,推测该基因可能主要作为叶绿体蛋白参与细胞的抗氧化、抗衰老等抗逆过程,其次作为转录因子参与转录调控作用。本研究克隆了P9基因的全长cDNA序列,并对该基因序列、结构和功能等方面进行了分析,为进一步研究花生抗病分子机制提供理论基础,同时为花生抗病品种的选育提供理论支持。     

水分亏缺条件下玉米根系TIP1-1基因的表达

以一组具有不同抗旱性状的玉米遗传材料杂交种户单4号(抗旱)及其父本803（不抗旱）,母本天四（抗旱）为供试材料,以微管蛋白基因为内参基因,水通道蛋白基因TIP1-1为检测基因,在PEG-6000模拟水分亏缺条件下,采用半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）体系检测TIP1-1基因在玉米根系中的表达情况。在正常     

花生膜联蛋白基因AhAnn1的克隆与表达分析

为挖掘花生抗逆境胁迫相关基因,克隆抗逆相关膜联蛋白Annexin基因,以花生品种花育25号为试验材料,从已知抑制消减杂交文库中获得花生膜联蛋白Annexin类似基因片段,通过RACE技术获得Annexin基因5'-RACE片段。对5'-RACE序列和抑制消减杂交文库中已知基因片段进行拼接,设计特异引物通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到该基因,命名为AhAnn1。结果表明,AhAnn1全长为1 277 bp,开放阅读框为951 bp。根据编码区预测AhAnn1编码一条316个氨基酸组成的多肽,预测分子量为36.10 k Da,等电点为7.07。预测该基因编码的蛋白含有膜联蛋白Annexin保守结构域,定位于细胞质中。蛋白序列多重比对和系统发育分析表明,花生与大豆、苜蓿、鹰嘴豆等豆科植物中的膜联蛋白相似性最高,亲缘关系最近。荧光实时定量PCR结果显示,AhAnn1在根系和叶片中的表达量随干旱胁迫程度的增加而增加。由此推测AhAnn1是一种干旱胁迫应答基因,在花生逆境调控中发挥作用。结果为进一步研究花生AhAnn1基因的功能和花生抗逆境胁迫相关分子机理提供了理论基础。     

热激转录因子在植物胁迫应答和生长发育中的作用

由于其固有的生长方式,植物常常会面临诸如干旱、盐碱、极端温度和病虫害等不利因素的影响,因此,植物在漫长的进化过程中发展出一套精巧的调控机制来应对自然界中的各种环境和生物胁迫,并维持其正常的生长发育。植物基因表达的分子调控网络十分复杂,包括转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平等多个层次。转录因子介导的转录水平上的调控对于基因表达调控发挥着至关重要的作用,转录因子与靶基因启动子区的顺式元件相互作用来调控下游基因的表达。热激转录因子(heat shock factor,HSF)是真核生物中广泛存在的一类转录因子,通过识别热激元件(heat shock element,HSE)调控基因表达,从而参与植物的各种生命活动。植物HSF数量众多、功能多样、调控机制复杂精巧,不仅能够影响植物对高温、干旱、重金属等胁迫的抗性以及植物的抗病性,还参与了对植物配子形成和根发育等过程的调控。本综述归纳了植物中HSF的基本结构和分类、HSF受到的调控,重点介绍了HSF在应答各种胁迫条件和调控植物生长发育中的研究进展,并对植物HSF研究中有待进一步阐明的问题进行了探讨和展望,以期为植物的抗逆性改良和分子育种中潜在候选基因的选择提供参考依据。     

甘蔗PsbS亚基应答甘蔗花叶病毒侵染及其与6K2蛋白的互作研究

Non-photochemical quenching (NPQ) is the main mechanism of photoprotective regulation in higher plants. The PsbS subunit of Photosystem II (PSII) plays a key role in NPQ. The involvement of PSII PsbS subunit in Sugarcane mosaic virus (SCMV) infection of sugarcane (Saccharum spp. hybrid) has not been reported. In the previous research, we cloned the coding sequence of the PsbS subunit from sugarcane and designated it as ScPsbS. ScPsbS had an open reading frame (ORF) length of 798 bp and encoded a protein of 265 aa. Bioinformatics analysis showed that ScPsbS was a stable hydrophobic protein with chloroplast localization signals and four transmembrane domains. The ScPsbS protein possesses a typical domain of PsbS protein. Phylogenetic tree analysis showed that ScPsbS was divergent between monocotyledons and dicotyledons, or C₃ plants and C₄ plants. Subcellular localization analysis showed that ScPsbS was located in chloroplasts and partially colocalized with SCMV-6k2 in chloroplasts. The interaction of ScPsbS with the SCMV-6K2 was further confirmed by bimolecular fluorescence complementation assays (BiFC). ScPsbS gene showed obvious tissue specificity in sugarcane tested by real-time quantitative PCR analysis. ScPsbS gene had highest expression in mature leaves, followed by immature leaves and leaves beginning to senesce, and hardly expressed in stems and roots. The expression of ScPsbS gene was significantly affected by SCMV infection, with significant upregulation in the early stage of SCMV infection, and no significant affection in the later stage of SCMV infection.     

苎麻Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析

以耐旱性较强的湘苎3号为材料,从苎麻转录组测序结果中获得了1个与P5CS基因高度相似的Unigene,该片段长1 448 bp,根据该序列设计5′RACE和3′RACE槽式PCR引物,利用RACE结合RT-PCR技术分别克隆得到590 bp的5′端和293 bp的3′端,拼接获得该基因全长cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明,该基因全长为2 318 bp,其中开放读码框为2 154 bp,编码717个氨基酸,其编码蛋白质的等电点和分子量分别为6.57 kD和77.56 kD,与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的P5CS基因的核苷酸序列相似性分别为81%、81%、75%和72%,蛋白质序列的相似性分别为86%、85%、78%和77%,说明该基因与P5CS为同源,被命名为BnP5CS1。半定量RT-PCR分析表明,该基因在苎麻的茎尖中表达量最高,在根中其次, 且受干旱胁迫的诱导。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因,BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。     

露地菊(Chrysanthemum×grandiflora)CgDREB基因克隆和生物信息学分析

DREB转录因子在植物抗逆过程中起关键性作用,它可以激活一系列抗逆功能基因的表达从而综合提高植物的抗逆性。为探究露地菊DREB基因的功能,本研究通过结合RNA-Seq和RT-PCR技术从露地菊‘纽9717’中克隆得到CgDREB基因,并对该基因及其蛋白进行生物信息学和表达模式分析。结果显示,CgDREB基因ORF全长450 bp,编码149个氨基酸,预测蛋白相对分子量16.742 kD,理论等电点9.32,为亲水性蛋白,没有跨膜结构,无信号肽。功能结构域分析表明其具有一个高度保守的AP2/ERF结构域。同源性分析其属于AP2/ERF转录因子家族DREB亚组A-5组。蛋白质二级结构中无规则卷曲占57.05%,α-螺旋占28.86%,延伸链占10.07%,β-转角占4.03%。三级结构显示其以单体蛋白结构存在。RT-qPCR分析表明,高盐、干旱、低温和ABA均能诱导CgDREB基因的表达。本研究为深入了解露地菊A-5组DREB转录因子及其抗逆调控机制提供基础,为露地菊品种改良提供理论依据。