陆地棉质体转录活性因子基因GhPTAC的克隆及其耐盐性分析

为了挖掘新的耐盐基因及调控途径，利用基因芯片技术及抑制性差减文库技术筛选到质体转录活性因子，通过RACE及RT-PCR技术克隆到该基因的cDNA全长，命名为GhPTAC。该cDNA全长1 564 bp，其中ORF 1 038 bp，推测编码345个氨基酸残基的多肽。生物信息学分析表明GhPTAC为拟南芥PTAC13同源基因，同源性60.6%。编码蛋白为转录活跃的染色体(TAC)的一个组分，参与叶绿体基因组转录终止/抗终止调节。Real-time PCR分析结果表明，GhPTAC受盐胁迫诱导上调表达，在耐盐材料中9806中表达水平明显高于盐敏感材料中S9612，这与芯片结果一致。     

甘蓝型油菜BnRRS1-like和BnRRS2-like抗病基因表达特征及进化分析

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)作为中国乃至世界上重要的油料作物,在生产上常受到病虫危害而导致产量降低。NBS-LRR类基因已经被证明是一类广谱抗病基因,在拟南芥、水稻等作物中NBS-LRR类抗病蛋白参与对多种病原微生物的防御响应。本课题组通过对高/低油近等基因系材料做转录组分析筛选得到两个NBS-LRR类差异表达基因分别命名为BnRRS1-like和BnRRS2-like,对BnRRS1-like和BnRRS2-like基因进行了系统发育进化分析,结果表明,BnRRS1-like、BnRRS2-like基因与拟南芥RRS1-R基因高度同源。NCBI同源序列比对发现BnRRS1-like基因和BnRRS2-like基因与拟南芥RRS1-R基因相似度分别为60.68%和52.39%。对BnRRS1-like和BnRRS2-like基因编码的蛋白质序列分析结果表明:BnRRS1-like(BnaC09g18980)和BnRRS2-like蛋白(BnaA01g01460)均含有"TIR""NBS""LRR"保守结构域,属于TIR-NBSLRR类抗病蛋白。保守基序分析得出BnRRS1-like和BnRRS2-like基因有非常相似的保守基序。通过染色体定位结果表明,BnRRS1-like和BnRRS2-like基因分别定位于染色体C9和A1位置上。利用qRT-PCR技术分析发现,BnRRS1-like和BnRRS2-like均在油菜叶片中含量最高,其次是根,花中表达量最低。在油菜成株后进行核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核接种后,测定不同诱导时间BnRRS1-like和BnRRS2-like基因相对表达量,发现接种菌核病菌3 h后BnRRS1-like和BnRRS2-like基因表达量明显上升,12 h达到最大值。结果证明,BnRRS1-like和BnRRS2-like为油菜抗菌核病相关基因。     

花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶, 在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因, 命名为AhSuSy (GenBank登录号JF346233)。该基因cDNA序列全长2 790 bp, 包含一个2 421 bp的开放阅读框(ORF), 5′端非编码区57bp, 3¢端非编码区为312 bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸, 与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上; 成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy, 在IPTG诱导下得到92 kD左右的蛋白, 与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗, 分析胁迫后AhSuSy的转录水平, 同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量, 发现三者均表现为处理后4~12 h逐渐升高, 相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993(P=0.007<0.01), 处理后12~24 h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控, 在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。     

甘蔗中一个NBS-LRR类基因的全长克隆与表达分析

采用RACE技术, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376中克隆了一个NBS-LRR类基因的cDNA全长序列, 命名为SNLR。生物信息学分析显示, 甘蔗SNLR基因的cDNA全长为2 985 bp (Accession No. EF155654), 包括一个2 661 bp的完整开放读码框以及一个典型的29 bp poly-A。同时, 还具有NBS-LRR类抗病基因的所有保守结构域, 包括4个NBS区域保守结构域和6个潜在LRR结构域;蛋白疏水性分析和二级、三级结构分析表明, 该基因编码的蛋白质为弱碱性蛋白, pI为7.76, 无明显的疏水结构域, 以卷曲结构和螺旋结构为骨架, 三级结构未见明显的跨膜信号蛋白区。定量PCR分析表明, 甘蔗SNLR基因的表达受到黑穗病菌、水杨酸和过氧化氢的影响, 分别表现出“抑-扬”、“全程抑制”和“扬-抑”的表达模式, 也具有抗病基因组成型和组织特异性表达的特点。推测甘蔗SNLR基因可能为抗病相关基因。     

花生果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因AhFBA1的克隆与表达

以花生品种花育33为试材, 根据cDNA文库中已知的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 (fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 基因全长序列设计引物, 通过RT-PCR克隆到该基因, 命名为AhFBA1。AhFBA1全长为1489 bp, 开放阅读框为1200 bp, 编码400个氨基酸。预测该基因编码的蛋白含有Glycolytic保守结构域, 可能定位于叶绿体中。蛋白序列比对和进化树分析表明, 花生与大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和菜豆(Phaseolus vulgaris)等豆科植物中的FBA序列相似性最高, 亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示, 在高盐和干旱胁迫下, AhFBA1在花生叶和根中的表达均受明显诱导, 说明该基因可能参与花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控; AhFBA1在花生根和叶中均受ABA的明显诱导, 说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是依赖ABA的。     

甜菜NAC转录因子BvNAC46基因的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的强抗旱甜菜品种HI0466为材料,通过RT-PCR技术克隆到一个甜菜NAC类转录因子基因的cDNA序列,命名为BvNAC46(GenBank登录号:XM_010689163.2)。序列分析表明,该基因序列全长1 047 bp,包含一个576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸,为稳定的疏水性蛋白,推测理论分子量为88.725 kD,亚细胞定位于细胞核中。含有一个NAM保守结构域,具有NAC转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了甜菜BvNAC46基因的植物表达载体pCAMBIA2301-BvNAC,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能提供参考。     

烟草NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

通过同源克隆法获得烟草抗病基因同源序列(RGAs),为烟草抗病基因的筛选和相关研究提供帮助。基于抗病基因的NBS-LRR保守结构域,筛选并合成了3对简并引物,扩增烟草中的NBS-LRR类抗病基因。获得了4条与抗病基因具有高度同源性的NBS-LRR类烟草抗病基因同源序列(TRGA,登录号:MK634316,MK634317, MK634318, MK634319),目的片段大小均在500 bp左右;BLAST X分析表明,获得的4个烟草RGAs与已知RGAs具有高度相似性,氨基酸相似性为97%～100%;聚类分析将其分成2大类,包括TIRNBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两类抗病基因,其编码氨基酸序列含有NBS保守区的典型特征基序。通过简并引物进行同源扩增是分离烟草RGAs的有效方法,可为进一步抗病基因筛选及抗病分子育种奠定基础。     

大薯病程相关蛋白1(PR1)基因及其启动子序列的克隆与分析

为了研究大薯Da PR1基因的表达模式及调控机理,本研究利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从高抗炭疽病大薯材料Da94中获得1个病程相关蛋白1(pathogensis-related protein 1,PR1)基因,命名为Da PR1。测序显示该基因包含长度为501 bp的完整开放阅读框(ORF),预测编码166个氨基酸。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白具有典型SCP-PR1-like保守结构域,Blast比对表明Da PR1蛋白与多种植物的PR1蛋白高度同源。实时荧光定量PCR检测表明,Da PR1基因在高抗种质中受炭疽菌显著诱导,在侵染48 h时其相对表达量达到最大。通过巢式PCR扩增Da PR1上游转录调控序列的5'端,获得1 203 bp的Da PR1基因启动子,序列分析表明该区域除了含有基础的启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还存在茉莉酸(JA)、赤霉素(GB)等激素响应元件及真菌诱导响应元件(W-box)。本研究通过克隆和分析Da PR1基因及其启动子序列,为进一步研究该基因的功能及其表达调控机制奠定了基础。     

大豆尿黑酸叶绿基转移酶基因的克隆与进化分析

采用基于EST的电子克隆方法,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的尿黑酸叶绿基转移酶基因(Homogentisate phytyltransferase,HPT)cDNA序列为信息探针,对大豆的EST数据库进行同源检索筛选,获得了1 777 bp长大豆HPT基因的cDNA序列(GenBank登录号为:AY956421),经RT-PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,表明与电子克隆序列一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,173～1 408 bp),推测编码411个氨基酸的蛋白。该蛋白与拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、光合集胞蓝细菌(Synechocystis)的序列进行了比较,发现该基因具有保守性。     

芝麻中一个富含脯氨酸新基因的克隆与特征分析

芝麻青枯病是影响我国南方芝麻产量及品质的重要病害。该病属细菌病害,由青枯雷尔氏菌引起。本研究利用随机引物对芝麻受青枯雷尔氏菌诱导前后进行基因差异表达分析,发现一个诱导明显下调的基因(片段)。将该片段克隆、测序后,在芝麻基因组数据库中比对其序列,得到一个ORF完整的全长基因。序列分析表明该基因无内含子,ORF长度为1458 bp,编码486氨基酸,其N端富含脯氨酸及富含脯氨酸的重复序列,属于富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein,PRP),将其命名为Si PRP(Sesamum indicum proline-rich protein)。根据该基因ORF两翼序列设计引物在芝麻c DNA中克隆到该基因,测序结果与预测序列一致。Blast分析表明该基因编码蛋白与其他植物中发现的PRP蛋白同源性很低,且其富含脯氨酸的重复序列在其他植物中也未发现,推测为一个新型富含脯氨酸蛋白。进一步设计基因专化的定量及半定量PCR引物进行其诱导表达分析,再次证明该基因受病菌诱导后下调表达。与其他植物中发现的大多数PRP蛋白定位于细胞壁不同,Si PRP主要定位于细胞膜,少量可以分泌到细胞外。烟草表皮细胞瞬时表达显示该蛋白定位在细胞膜上的特殊结构,推测该蛋白在芝麻和青枯雷尔氏菌的互作中发挥重要作用。     

不同花生基因型脂肪酸脱氢酶基因序列分析

根据Δ¹²-脂肪酸脱氢酶（FAD）保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR扩增,获得了花生属不同基因型的全长为1 140 bp的cDNA序列。序列分析结果表明,序列编码379个氨基酸的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为42 kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白（membrance-anchored protein）重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些分析表明所获得的序列为Δ¹²-脂肪酸脱氢酶。系统进化树分析表明,FAD序列在花生属植物进化过程中较为保守;与其他物种的FAD序列也具有较高的同源性。这为探讨花生属植物之间的进化关系提供了一定的分子水平证据。     

花生膜联蛋白基因AhAnn1的克隆与表达分析

为挖掘花生抗逆境胁迫相关基因,克隆抗逆相关膜联蛋白Annexin基因,以花生品种花育25号为试验材料,从已知抑制消减杂交文库中获得花生膜联蛋白Annexin类似基因片段,通过RACE技术获得Annexin基因5'-RACE片段。对5'-RACE序列和抑制消减杂交文库中已知基因片段进行拼接,设计特异引物通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到该基因,命名为AhAnn1。结果表明,AhAnn1全长为1 277 bp,开放阅读框为951 bp。根据编码区预测AhAnn1编码一条316个氨基酸组成的多肽,预测分子量为36.10 k Da,等电点为7.07。预测该基因编码的蛋白含有膜联蛋白Annexin保守结构域,定位于细胞质中。蛋白序列多重比对和系统发育分析表明,花生与大豆、苜蓿、鹰嘴豆等豆科植物中的膜联蛋白相似性最高,亲缘关系最近。荧光实时定量PCR结果显示,AhAnn1在根系和叶片中的表达量随干旱胁迫程度的增加而增加。由此推测AhAnn1是一种干旱胁迫应答基因,在花生逆境调控中发挥作用。结果为进一步研究花生AhAnn1基因的功能和花生抗逆境胁迫相关分子机理提供了理论基础。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

巴西橡胶树一个Mlo基因克隆及其序列特征分析

Mlo基因是植物抗病基因中的重要成员。巴西橡胶树Mlo基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病橡胶树新品种奠定基础。本研究以大麦Mlo基因(GenBank登录号: Z83834)为探针对巴西橡胶树的EST和转录组数据库进行同源搜索,并将获得的同源EST序列进行拼接,最后得到巴西橡胶树Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因CDS片段1668 bp,编码555个氨基酸,分子量为63.14 kDa,等电点是8.85。对巴西橡胶树Mlo的编码蛋白结构域进行分析发现,该蛋白具有Mlo保守结构域,包含8次跨膜结构。通过对不同物种的Mlo同源蛋白进行聚类分析发现,巴西橡胶树Mlo蛋白与木薯Mlo蛋白同源性最高,达到92.1%,其次是蓖麻(87.6%);在拟南芥基因组中,与AtMlo8的相似性最高,达到67%,而且AtMlo8也包含有8次跨膜结构,因此,将巴西橡胶树中克隆的Mlo基因命名为HbMlo8。通过对所克隆的HbMlo8基因分析可知,该基因属于Mlo基因家族成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证巴西橡胶树HbMlo8的功能奠定了基础。     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的克隆与序列分析

为了研究木薯(Manihot esculenta Crantz)的抗逆境胁迫机制,从水稻低温诱导及抗旱基因OsLTI6A出发,同源克隆了木薯的抗逆基因MeLIT6A,并对其序列和功能进行了分析研究。MeLIT6A的基因组序列全长为273 bp,其中ORF长度为173 bp,内含子长度为99 bp;编码1个含有57个氨基酸残基的蛋白,含有1个与Pmp3超级家族同源性极高的保守区域。该基因推导蛋白MELTI6A与蓖麻的、拟南芥的、水稻的、玉米的低温诱导蛋白基因6A (LTI6A)的推导蛋白的同源性分别为：89.7%。81.0%、74.1%和87.9%。蛋白功能分类预测MELTI6A是1个非酶类的、疏水性较高的、有2个透膜区域的蛋白,可能有转运蛋白和作为受体蛋白的功能,与拟南芥的AtLTI6A的功能相似。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

胡杨核转录因子PeNF-YB1克隆及其干旱响应表达

为阐明木本植物中核转录Y因子B亚基蛋白(NF-YB)及其编码基因在抗旱转录调控中的机制,运用生物信息学知识和方法,采用PCR克隆技术,以模式树种毛果杨基因组核转录Y因子B亚基蛋白同源序列为参考,从胡杨叶组织基因组材料中反转录获取了核酸长度为543 bp的目标基因PeNF-YB1。该基因编码的蛋白具有螺旋-环-螺旋二级结构,含有NF-YB蛋白保守结构域和功能氨基酸,不含核定位信号肽;GFP亚细胞定位表明该基因在核中表达;PEG6000溶液干旱胁迫下,该基因表达具有早期上调、延后转为下调的响应变化。研究认为克隆的PeNF-YB1是植物NF-YB亚基基因家族成员,并在干旱早期响应过程中起转录表达作用。研究结果不仅说明了NF-YB转录因子在木本植物中的抗旱作用,也为树木抗旱调控机制的阐明提供了重要参考。